第2章新 基因工程及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用

三）質(zhì)粒

（plasmid）

質(zhì)粒是存在于細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)中獨(dú)立于染色體而自主復(fù)制的共價(jià)、封閉、環(huán)狀雙鏈DNA分子（CovalentlyclosedCircularDNA,cccDNA）。

★不是細(xì)菌生長(zhǎng)所必需的

★可賦予細(xì)菌抵御外界因素不利影響的能力

★分子量在1-200kb之間基因工程至少需要3種工具：限制性核酸內(nèi)切酶——“分子手術(shù)刀”DNA連接酶——“分子縫合針”基因進(jìn)入受體細(xì)胞的運(yùn)載體——“分子運(yùn)輸車(chē)”主要從原核生物中分離純化出來(lái)1.1.1來(lái)源：1.1.2特點(diǎn)：1.1.3作用：1.1.4結(jié)果：具有專(zhuān)一性識(shí)別某種特定的核苷酸序列，使特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵切開(kāi)形成兩種末端黏性末端平末端切開(kāi)磷酸二酯鍵1.2DNA連接酶—“分子縫合針”1.2.1作用：恢復(fù)被限制酶切開(kāi)的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵E.coliDNA連接酶：連接黏性末端T4DNA連接酶：連接黏性末端和平末端(效率較低)1.2.2種類(lèi)：形成磷酸二酯鍵1.3基因進(jìn)入受體細(xì)胞的運(yùn)載體—“分子運(yùn)輸車(chē)”1.3.1常用的運(yùn)載體：質(zhì)粒、λ噬菌體衍生物、動(dòng)植物病毒等質(zhì)粒：一種存在于細(xì)菌或細(xì)胞染色體外的能夠獨(dú)立復(fù)制的遺傳物質(zhì)。一般為雙鏈共價(jià)閉合環(huán)形DNA分子，長(zhǎng)度為2-200kb。大腸桿菌及質(zhì)粒載體結(jié)構(gòu)模式圖1.3.2作為運(yùn)載體所具備的條件：結(jié)構(gòu)小(即小載體（1－1.5kb）→不易損壞，在細(xì)菌里面拷貝數(shù)也多)對(duì)細(xì)胞無(wú)害能自我復(fù)制有標(biāo)記基因：有多個(gè)酶切位點(diǎn)等如四環(huán)素抗性基因、氨芐青霉素抗性基因等小結(jié)基因工程的工具限制酶主要存在于原核生物中具有專(zhuān)一性(識(shí)別序列)切開(kāi)DNA分子的磷酸二酯鍵DNA連接酶連接磷酸二酯鍵種類(lèi)E.coliDNA連接酶T4

DNA連接酶運(yùn)載工具條件結(jié)構(gòu)小而穩(wěn)定能自我復(fù)制具多個(gè)限制酶切位點(diǎn)具標(biāo)記基因等質(zhì)粒、λ噬菌體衍生物、動(dòng)植物病毒等基因工程的基本操作程序1、獲取目的基因2、構(gòu)建基因表達(dá)載體3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4、目的基因的檢測(cè)與鑒定一、提取目的基因1、目的基因原核細(xì)胞基因結(jié)構(gòu)真核細(xì)胞基因結(jié)構(gòu)是所要研究或應(yīng)用的基因，也就是將要克隆或表達(dá)的基因或基因的一個(gè)片段。獲取目的基因是分子克隆中最重要的一步。2、獲取目的基因的常用方法（1）從基因文庫(kù)中獲?。?）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增（3）人工合成（通過(guò)DNA合成儀）基因文庫(kù)基因組文庫(kù)部分基因文庫(kù)如cDNA文庫(kù)包含了一種生物的全部基因的基因文庫(kù)叫做基因組文庫(kù)

將細(xì)胞所有mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA片段，克隆到適當(dāng)?shù)妮d體中，構(gòu)建成含有不同cDNA片段的克隆載體混合物，此即cDNA文庫(kù)?；蚪M文庫(kù)與部分基因文庫(kù)的比較基因文庫(kù)的構(gòu)建將總DNA包含的基因組各片段分別克隆在質(zhì)粒或噬菌體載體上，便構(gòu)成了該生物的基因文庫(kù)。cDNA合成過(guò)程

第一步，反轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板合成一條與RNA互補(bǔ)的DNA單鏈，形成RNA-DNA雜交分子。第二步，核酸酶H使RNA-DNA雜交分子中的RNA鏈降解，使之變成單鏈的DNA。第三步，以單鏈DNA為模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一條互補(bǔ)的DNA鏈，形成雙鏈DNA分子。基因組文庫(kù)將基因組DNA經(jīng)內(nèi)切酶消化后插入載體，得到含有不同插入片段載體，這種克隆載體混合物應(yīng)該含有不同基因組片段，此即基因文庫(kù)。cDNA文庫(kù)將細(xì)胞所有mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA片段，克隆到適當(dāng)?shù)妮d體中，構(gòu)建成含有不同cDNA片段的克隆載體混合物，此即cDNA文庫(kù)。各種組織或細(xì)胞的基因組或cDNA文庫(kù)都可以從公司購(gòu)買(mǎi)?？捎靡阎邢薜男畔⒑铣商禺愋蕴结槪捎梅肿与s交法從文庫(kù)中篩選感興趣的片段。構(gòu)建基因文庫(kù)的方法①鳥(niǎo)槍法(直接分離法)②反轉(zhuǎn)錄法提取某種生物的全部DNA用適當(dāng)?shù)南拗泼盖幸欢ù笮〉腄NA片段將DNA片段與載體連接導(dǎo)入受體菌中儲(chǔ)存基因組文庫(kù)①鳥(niǎo)槍法(直接分離法)某種生物的mRNA單鏈互補(bǔ)DNA雙鏈cDNA片段導(dǎo)入受體菌中儲(chǔ)存與載體連接cDNA文庫(kù)逆轉(zhuǎn)錄②反轉(zhuǎn)錄法求異思維你能推測(cè)出由mRNA反轉(zhuǎn)錄形成cDNA的過(guò)程大致分為哪些步驟嗎？反轉(zhuǎn)錄酶既可以利用DNA又可以利用RNA作為模板合成與之互補(bǔ)的DNA鏈。像其他DNA聚合酶一樣，反轉(zhuǎn)錄酶也以5′→3′方向合成DNAcDNA合成過(guò)程是：第一步，反轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板合成一條與RNA互補(bǔ)的DNA單鏈，形成RNA-DNA雜交分子。第二步，核酸酶H使RNA-DNA雜交分子中的RNA鏈降解，使之變成單鏈的DNA。第三步，以單鏈DNA為模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一條互補(bǔ)的DNA鏈，形成雙鏈DNA分子。如何從基因文庫(kù)中得到所目的基因？依據(jù)：目的基因的有關(guān)信息。如：根據(jù)基因的核苷酸序列基因的功能基因在染色體上的位置基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA基因的表達(dá)產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性。①鳥(niǎo)槍法：供體細(xì)胞中的DNA許多DNA片段運(yùn)載體限制酶與載體連接載入受體細(xì)胞產(chǎn)生特定性狀導(dǎo)入外源DNA擴(kuò)增目的基因分離(直接分離法)(一)從基因文庫(kù)中獲取目的基因②反轉(zhuǎn)錄法：

以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)的單鏈DNA，然后在酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得所需的基因。目的基因的mRNA雜交雙鏈(單鏈RNA/單鏈DNA)單鏈DNA反轉(zhuǎn)錄酶核酸酶HDNA聚合酶雙鏈DNA(目的基因)③根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA法：

根據(jù)已知蛋白質(zhì)的氨基酸序列，推測(cè)出相應(yīng)的信使RNA序列，然后按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，推測(cè)出它的結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列，再通過(guò)化學(xué)方法，以單核苷酸為原料合成目的基因。蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列推測(cè)推測(cè)目的基因化學(xué)合成上述三種目的基因提取的方法有何優(yōu)缺點(diǎn)？?jī)?yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)鳥(niǎo)槍法反轉(zhuǎn)錄法根據(jù)已知氨基酸合成DNA法操作簡(jiǎn)便廣泛使用工作量大，盲目，分離出來(lái)的有時(shí)并非一個(gè)基因?qū)Ｒ恍詮?qiáng)操作過(guò)程麻煩，mRNA很不穩(wěn)定，要求的技術(shù)條件較高專(zhuān)一性最強(qiáng)僅限于合成核苷酸對(duì)較少的簡(jiǎn)單基因思考:為什么要構(gòu)建基因文庫(kù)?直接從含有目的基因的生物體內(nèi)提取不行嗎?尋根問(wèn)底1.為什么要構(gòu)建基因文庫(kù)？直接從含有目的基因的生物體內(nèi)提取不行嗎？構(gòu)建基因文庫(kù)是獲取目的基因的方法之一，并不是惟一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通過(guò)PCR方式從含有該基因的生物的DNA中，直接獲得，也可以通過(guò)反轉(zhuǎn)錄，用PCR方式從mRNA中獲得，不一定要構(gòu)建基因文庫(kù)。但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想從一種生物體內(nèi)獲得許多基因，或者想知道這種生物與另一種生物之間有多少基因不同，或者想知道一種生物在個(gè)體發(fā)育的不同階段表達(dá)的基因有什么不同，或者想得到一種生物的全基因組序列，往往就需要構(gòu)建基因文庫(kù)。（2）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因PCR——聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一項(xiàng)生物體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)。PCR技術(shù)原理：前提：條件：方式：結(jié)果：DNA復(fù)制一段已知目的基因的核苷酸序列以_____方式擴(kuò)增，即____（n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）指數(shù)2n模板DNA；DNA引物；四種脫氧核苷酸；熱穩(wěn)定DNA聚合酶（Taq酶）等使目的基因的片段在短時(shí)間內(nèi)成快速地?cái)U(kuò)增

過(guò)程變性、退火、延伸三步曲變性：加熱至90～95℃氫鍵斷裂，雙鏈DNA解鏈成為單鏈DNA退火：冷卻至55～60℃引物與模板的單鏈DNA互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合延伸：加熱至70～75℃以目的基因?yàn)槟０?，合成互補(bǔ)的新DNA鏈變性退火延伸（3）人工合成——根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA僅限于合成核苷酸對(duì)較少的簡(jiǎn)單基因蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列推測(cè)推測(cè)目的基因化學(xué)合成（通過(guò)DNA合成儀）

根據(jù)已知蛋白質(zhì)的氨基酸序列，推測(cè)出相應(yīng)的信使RNA序列，然后按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，推測(cè)出它的結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列，再通過(guò)化學(xué)方法，以單核苷酸為原料合成目的基因。二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建——核心（1）用一定的_________切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個(gè)切口，露出____________。（2）用___________切斷目的基因，使其產(chǎn)生_________________。（3）將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的______處，再加入適量___________，形成了一個(gè)重組DNA分子（重組質(zhì)粒）限制酶黏性末端同一種限制酶切口DNA連接酶相同的黏