超級感受態(tài)細(xì)胞的制備方法

什么是感受態(tài)細(xì)胞野生型E.coli并不容易轉(zhuǎn)化，這是由于細(xì)菌產(chǎn)生一種酶能迅速降解進入的外源DNA。經(jīng)過多年的努力，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)了一種方法可以增加細(xì)胞吸收外源DNA的效率。那就是用化學(xué)方法處理細(xì)胞，使其改變膜對DNA的通透性。這種細(xì)胞就稱為感受態(tài)細(xì)胞，即細(xì)胞處于能攝入核酸分子時的生理狀態(tài)。這種方法已經(jīng)成為基因工程的常規(guī)技術(shù)，它對于我們利用體外DNA重組技術(shù)來了解真核和原核生物的基因功能特別重要。細(xì)菌的轉(zhuǎn)化有兩種類型：一種是自然轉(zhuǎn)化(naturaltransformation)，在自然轉(zhuǎn)化中細(xì)菌可以自由地吸收DNA，通過它來進行遺傳轉(zhuǎn)化；另一種是工程轉(zhuǎn)化(engineeredtransformation)，在這種轉(zhuǎn)化中，細(xì)菌發(fā)生改變使得它們能攝入并轉(zhuǎn)化外源DNA?？莶輻U菌中的轉(zhuǎn)化屬于自然轉(zhuǎn)化，E.coli轉(zhuǎn)化就屬于工程轉(zhuǎn)化。DH5a是一種常用于質(zhì)?？寺〉木?。E?coliDH5a在使用pUC系列質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化時，可與載體編碼的卩一半乳糖苷酶氨基端實現(xiàn)a—互補。可用于藍(lán)白斑篩選鑒別重組菌株Transformation"Ultra-Competent"E.coli(InoueMethod)Inoue法制備大腸桿菌超級感受態(tài)細(xì)胞Inoue,H.,H.Nojima,andH.Okayama.1990.HighefficiencytransformationofEscherichiacoliwithplasmids.Gene96:23-28.CitationAbstractProcedure步驟InoculatefromanovernightgrowninLB.從培養(yǎng)過夜的LB平板上挑取單菌落Growin250ml"SOB"at18CuntilOD600=0.6. (0.3)接種于250mLSOB,18度培養(yǎng)至OD=0.62.Onicefor10minutes.菌液置冰上10分鐘Spinat2500xg(5000rpminaSorvallGSAor3000rpminaBeckmanJ-6Bcentrifuge)for10min.at4C.4度2500g離心10兮鐘Resuspendcellsgentlyin80mloficecold"TB".小心用80mL預(yù)冷TB重懸細(xì)胞Onicefor10minutes.(30min)菌液置冰上10分鐘Spinat2500xg(5000rpminaSorvallGSA,5500rpminaSorvallSS-34,or3000rpminaBeckmanJ-6Bcentrifuge)for10min.at4C?4度2500g離心10分鐘Resuspendcellsgentlyin20mloficecold"TB".小心用20mL預(yù)冷TB重懸細(xì)胞AddDMSOtoafinalconcentrationof7%.加入DMSO至終濃度7%Placeonicefor10minutes.置冰上10分鐘Aliquotinto1-2mlandfreezeinliquidnitrogen.分裝，液氮速凍Storeinliquidnitrogen.凍存SOBMediumandTB(TransformationBuffer)JM108感受態(tài)細(xì)胞的制備剛開始做實驗時，是向TAKARA購買的，一支30元，定了10支。后來干脆自己做，感覺質(zhì)量和TAKARA的質(zhì)量不相上下，下面談?wù)勎抑谱鞲惺軕B(tài)的體會。前期工作分子生物耗費時間在于準(zhǔn)備過程太多。所以做好前期工作非常重要，所謂‘磨刀不誤砍材功'。注意事項1?不要用經(jīng)過多次轉(zhuǎn)接或儲于4C的培養(yǎng)菌，最好從一70°C或-20°C甘油保存的菌種劃板（AMP陰性）37度過夜培養(yǎng)，劃板時用小TIP頭挑少許冰渣即可，輕劃S行。同時記得設(shè)立對照：A、在AMP陽性板劃菌，排出AMP抗性菌污染。大家都知道，實驗室很多材料從師姐傳師妹，或許經(jīng)過很多人的轉(zhuǎn)手。所以從頭鑒定所用材料的可靠性非常必要。B、AMP陰性空白培基。系統(tǒng)控制參照，為更準(zhǔn)確起見，用TIP頭不沾任何東西進行劃板。第二天挑克隆。2?質(zhì)粒的質(zhì)量和濃度:用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA應(yīng)主要是超螺旋態(tài)DNA（cccDNA）。轉(zhuǎn)化效率與外源DNA的濃度在一定范圍內(nèi)成正比，但當(dāng)加入的外源DNA的量過多或體積過大時,轉(zhuǎn)化效率就會降低。Ing的cccDNA即可使50“1的感受態(tài)細(xì)胞達到飽和。一般情況下,DNA溶液的體積不應(yīng)超過感受態(tài)細(xì)胞體積的5%。不過我一般鏈接反應(yīng)后（TAKARA的鏈接酶，體系25微升）會全量加到200微升的感受態(tài)里，約為150ng（載體0.1微克，目的片段約0.05微克）。效果也好。3?試劑的質(zhì)量:所用的試劑，如CaC12等均需是最高純度的（GR.或AR.）,并用超純水配制，最好分裝保存于干燥的冷暗處。國產(chǎn)的當(dāng)然也可以。我用都是國產(chǎn)的，好像是隴西化學(xué)制劑，分析純。4?防止雜菌和雜DNA的污染整個操作過程均應(yīng)在無菌條件下進行，所用器皿,如離心管,tip頭等最好是新的，并經(jīng)高壓滅菌處理，所有的試劑都要滅菌,且注意防止被其它試劑、DNA酶或雜DNA所污染，否則均會影響轉(zhuǎn)化效率或雜DNA的轉(zhuǎn)入，為以后的篩選、鑒定帶來不必要的麻煩。培養(yǎng)基的配制1?配制LB-AMP抗性培養(yǎng)基LB液體培養(yǎng)基：精解蛋白胨10g，酵母抽提物5g，氯化鈉10g,加去離子水800ml充分?jǐn)嚢枞芙?，用Imol/LNaOH調(diào)pH7.0,補加去離子水至1000毫升，高壓滅菌,4度保存。我一般沒有用Imol/LNaOH調(diào)pH7.0。而是直接精解蛋白胨10g,酵母抽提物5g,氯化鈉l0g加去離子水至1000ml。LB固體培養(yǎng)基：LB液體培養(yǎng)基中加1.5%瓊脂粉，高壓滅菌消毒；3?Amp母液：用無菌水或生理鹽水配制成100mg/ml即100ug/ul溶液，置-20°C保存；AMP500mg/支，一支用5ml稀釋即得。然后分5支分裝（濃度100mg/ml即100ug/ul）。4?含Amp的LB固體培養(yǎng)基：將配好的LB液體培養(yǎng)基高壓滅菌后冷卻至60C左右，加入Amp儲存液，使終濃度為100ug/ml搖勻后鋪板（30ml/90mm）：即多少毫升培養(yǎng)基加多少微升上述的Amp母液多少毫升培基=加多少微升母液，或減半量則最終濃度為50ug/ml有指南上寫細(xì)菌轉(zhuǎn)化后37度復(fù)蘇時用SOC培基。我從來只用AMP陰性的普通培基，效果也很好。5?0?05mol/LCaC12溶液:我們實驗室只有CaCl2-6H2O,分子量219,配制100ml的，則需稱量0.005x219=1.095g就可以了。其實氯化鈣的摩爾濃度在0.05-0.1mol/L均可。溶于50ml重蒸水中,定容至100ml,高壓滅菌。6?含15%甘油的0.05mol/LCaCl2:先配制成0.1mol/L的氯化鈣溶液50ml,加入15ml甘油,定容至100ml,高壓滅菌。有文獻說要用0.22的濾器，其實完全沒有必要。高壓即可。準(zhǔn)備工作做好了，就可以開工了。一、受體菌的培養(yǎng)從LB平板上挑取新活化的JM109單菌落，接種于3-10mlLB液體培養(yǎng)基中,37C下振蕩培養(yǎng)12小時左右（一般過夜）。將該菌懸液以1:100-1:50的比例接種于10ml試管（如較多制備，多用幾個試管即可）的LB液體（AMP陰性）培養(yǎng)基中同時做空的培基對照,37C振蕩培養(yǎng)2-3小時至OD600=0.5左右。二、感受態(tài)細(xì)胞的制備（CaC12法）1、 將培養(yǎng)液分轉(zhuǎn)入1.5ml的離心管中（一管10ml菌液可分裝成約6管1.5ml的離心管中），冰上放置10分鐘,然后于4°C下3000g離心10分鐘。2、 棄去上清，用預(yù)冷的0.05mol/L