冰凍切片制作方法與注意事項

冰凍切片制作方法與注意事項一、固定：固定即借助化學試劑是組織和細胞中的有機和無機成分凝固或沉淀，停止發(fā)生死后組織變化，盡量保持其活體狀態(tài)的過程。固定的方法有浸泡固定法，注射、灌注固定法，蒸汽固定法，本實驗用的是注射、矢注固定法：某些組織塊由于體積過大或固定液極難流入內(nèi)部或需要對整個臟器或整個動物進行固定，就可采用灌注或灌流固定法。固定時將固定液直接注入動物的血管，經(jīng)血管分支到達整個組織或全身，從二十只得到充分固定。固定液分為單純固定液和混合固定液。單純固定液有甲醛、乙醇、氯化汞、醋酸、苦味酸等，混合固定液包括Bouin液、Zenker液、Carnoy液、中性甲醛液等。本實驗用的固定液為4%甲醛（10%福爾馬林）。固定后的處理：用水配制的固定液固定后應用流水沖洗，可是組織中的固定液隨時溢出和隨時洗去。對小動物和腦組織等，應以浸泡為主，即能達到?jīng)_洗的目的，又不損害組織?！咀⒁馐马棥?.定要及時。1.定要及時。組織塊的大小要合適。3? 應有足夠的固定液，一般與組織塊的比例為20:1，容器勿過小，組織勿過多。4.定時間要合適，甲醛固定液一般固定兩天左右，第一天要更換一次固定液。4.定時間要合適，甲醛固定液一般固定兩天左右，第一天要更換一次固定液。5.要進行促使固定，在固定期間輕輕地攪動組織或搖動容器使組織移動有利于固定液的滲透，適當提高溫度也可縮短固定時間。6.選擇合適的定液。6.選擇合適的定液。7. 一次取材數(shù)量過多時，應對取材部位和順序進行編號，并及時做好記錄。二、脫水脫水就是用某些溶劑逐步將組織塊內(nèi)的水分置換出來的過程，使用的試劑稱為脫水劑。脫水劑有非石蠟溶劑的脫水劑如乙醇、丙酮等，和脫水兼石蠟的脫水劑如正丁醇等。本實驗所用的是乙醇脫水。乙醇是最常用的脫水劑，其優(yōu)點是脫水能力強，即能與水相混合，又能與透明劑相混，并可使組織硬化，便于切片。缺點是穿透組織的速度快，且容易使組織收縮、變脆。為克服這一缺點，在一般脫水中，應采用循序漸進的方法，逐步升級，經(jīng)一系列不同濃度的乙醇，使組織中的水分逐漸被乙醇代替。脫水時間視組織塊大小、性質(zhì)和類型而定?！咀⒁馐马棥棵撍仨殢氐?，組織塊只有脫水充分才能在透明劑中有良好的透明，也有利于染色。脫水須在有蓋子的瓶中進行，高濃度乙醇易吸收空氣中的水分。脫水劑的用量不能太少，應為組織塊的5?10倍以上，并及時更換。三、透明在切片制作過程中有兩次透明，第一次是脫水以后組織塊的透明，第二次是染色以后切片的透明。二甲苯是最常用的透明劑。它是一種無色透明的液體，容易揮發(fā)，透其明能力強，但易使組織收縮變脆，所以組織塊在二甲苯中不宜久留?！咀⒁馐马棥客该鲃┑挠昧坎荒芴伲瑧獮榻M織塊的5~10倍以上透明過程中用的器材如銀子必須干燥，不得將水滴入二甲苯中。在使用時應在盛二甲苯是一種易揮發(fā)的有毒氣體，長期接觸對呼吸道粘膜等有刺激作用，所以二甲苯的容器上加蓋蓋子。在使用時應在盛四、組織切片冰凍切片法）操作程序：切片前先安裝好刀片，調(diào)整好切片厚度及切片角度。根據(jù)標本的組織類型，確定最1.將待切的組織塊平放在軟塑瓶蓋或特質(zhì)小盆內(nèi)，直接或涂敷包埋劑后馬上放到冷凍2.佳切片溫度。臺上冷凍。3.將凍好的組織塊安裝到組織塊夾持器上，調(diào)整好刀片與組織塊之間的角度和距離，位置和角度。調(diào)整好防卷板的4.準備好后，轉動切片機旋轉輪的手柄進行切片。將切好的切片黏附在載玻片上，室1-2溫下自然晾干小時后可根據(jù)不同的需要進行固定、染色等制片步驟，也可用錫冰箱中待用。紙包好后封存于-20C攝氏度注意事項】切片時恒冷箱內(nèi)的適宜溫度是-20--15攝氏度。為防止組織中形成冰晶而影響1.將待切的組織塊平放在軟塑瓶蓋或特質(zhì)小盆內(nèi)，直接或涂敷包埋劑后馬上放到冷凍2.佳切片溫度。臺上冷凍。3.將凍好的組織塊安裝到組織塊夾持器上，調(diào)整好刀片與組織塊之間的角度和距離，位置和角度。調(diào)整好防卷板的4.準備好后，轉動切片機旋轉輪的手柄進行切片。將切好的切片黏附在載玻片上，室1-2溫下自然晾干小時后可根據(jù)不同的需要進行固定、染色等制片步驟，也可用錫冰箱中待用。紙包好后封存于-20C攝氏度注意事項】切片時恒冷箱內(nèi)的適宜溫度是-20--15攝氏度。為防止組織中形成冰晶而影響細胞的形態(tài)，甚至破壞細胞的結構，在組織冰凍時要法。組織塊在冰凍時，應根據(jù)組織的形狀和結構來放，切片也是如此。切片時，若發(fā)現(xiàn)冰凍過度，采用速凍的方可將冰凍組織塊取出在室溫下放置片刻再切片。HE染色）4.五、染色一）染色試劑配制1?蘇木精染液蘇木精染液是常用的一種燃料，主要用于對細胞核的染色。蘇木精本和力很弱，HE染色實際是通過蘇木精的氧化物一蘇木紅對組織細胞進行染色。過自然和身與組織的親化學方法兩種方式氧記懇需果蟲咿是通過蘇木精的氧化物一蘇木紅對組織細胞進行染色。蘇木精可通自然方化學方法是將化學氧化劑加入蘇木精溶液。法是將蘇木精溶液爆率在陽光下或空氣Harris蘇木精配方：A液（蘇木精1g,無水乙醇10ml）,B液（鉀明磯20g,蒸鐳水200ml）,氧化汞0.5g，冰醋酸8ml°配制方法：想將A液攪拌溶解，再將B液煮沸融化去火。將A液緩緩加入B液，混合后煮沸約1分鐘。離火后在該混合液中加入氯化汞，用玻璃棒充分攪拌至染液變?yōu)樽霞t色，冷卻后加入冰醋酸混勻，過濾后即可使用。2?伊紅染液伊紅是 種煤焦油染料，是細胞質(zhì)較為想的染色劑。常用的是 1%伊紅醇溶液。其配方是在3.1%鹽酸酒精分化液染色過程95%乙醇100ml中加入1g伊紅，玻璃棒攪拌均勻。36%-38%的鹽酸1ml加入75%乙醇99ml中混勻即可。切片進入蘇木精染液自來5-30min（根據(jù)不同需要和顏色情況決定染色時間）水洗去浮色。1%鹽酸酒精分化數(shù)秒。自來水沖洗半小時以上,是切片藍化。半小時以上,是切片藍化。蒸憎水洗。如伊紅染液復染1-10蒸憎水洗。如伊紅染液復染1-10按順序經(jīng)95%乙醇？、分鐘，使細胞質(zhì)染成紅色。仲脫水兼分化伊紅顏色各1min。1/2二甲苯（無水乙醇：10?二甲苯？、/透明，每次各約2-3min°1