葡聚糖凝膠微柱離心法測定酮康唑醇質(zhì)體

葡聚糖凝膠微柱離心法測定酮康唑醇質(zhì)體

隨著抗生素和免疫抑制劑的廣泛應(yīng)用，真菌感染日益嚴(yán)重，臨床上成為一種常見疾病。酮康唑系第3代咪唑類抗真菌藥,對皮膚癬菌、表皮癬菌屬、小孢子菌屬及酵母菌等具有抑制作用。臨床用于治療各種不同類型的念珠菌、酵母菌、皮膚真菌所致的疾病,特別對念珠菌和淺表癬菌有強(qiáng)大的抗菌力。作為外用制劑常用的有酮康唑軟膏劑、洗劑、搽劑、滴耳劑、噴膜劑等,但都難以攜帶藥物到達(dá)皮膚深層,抗菌效果有限,需要進(jìn)一步研發(fā)透皮效果好的外用制劑。近年來,有學(xué)者采用醇質(zhì)體作為經(jīng)皮給藥載體,以提高藥物的滲透系數(shù),增加藥物在真皮層中的累積量。為此,筆者采用注入法研制了酮康唑醇質(zhì)體經(jīng)皮給藥制劑。包封率是衡量醇質(zhì)體制備工藝的重要指標(biāo)之一,而測定的關(guān)鍵是將游離藥物與醇質(zhì)體進(jìn)行分離。本試驗(yàn)擬用葡聚糖凝膠微柱離心法快速分離醇質(zhì)體和游離藥物,再用HPLC測定酮康唑含量,為酮康唑醇質(zhì)體的質(zhì)量控制建立測定方法。1著色機(jī)及針筒、儀器和參數(shù)設(shè)置HPLC1200型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司,LC系統(tǒng)化學(xué)工作站);HP8453型紫外-可見光光譜儀(美國安捷倫公司);TL-4型臺式離心機(jī)(湖南儀器儀表總廠離心機(jī)廠);注射器針筒(浙江康康醫(yī)療器械有限公司,規(guī)格:2mL)。酮康唑(南京白敬宇制藥有限責(zé)任公司,批號KE080901,純度99.40%);葡聚糖凝膠-G50(臺州市路橋四甲生化塑料廠,批號20081110,粒徑:100~200目,規(guī)格:生化試劑);聚偏氟乙烯微孔濾膜(F型)(上海興亞凈化材料廠,規(guī)格:直徑50mm,孔徑:0.45μm);乙腈、甲醇等試劑(均為分析純)。2方法和結(jié)果2.1超聲粒徑測量采用注入法制備酮康唑醇質(zhì)體。精密稱取卵磷脂200mg、酮康唑50mg,加乙醇3mL溶解,置于磁力攪拌器上,在密閉條件下邊攪拌邊緩慢細(xì)流注入到7mL蒸餾水中,再繼續(xù)攪拌10min,于冰水浴條件下探頭式超聲(200W,超聲5s,停5s)5min,最后過0.45μm微孔濾膜,將得到的樣品冷藏備用。用激光粒度儀測得樣品平均粒徑為222.87nm,粒徑范圍為150~300nm,跨距為0.29。同法制備空白醇質(zhì)體。2.2溶液制備2.2.1標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備準(zhǔn)確稱取干燥至恒重的酮康唑10.0mg置于100mL量瓶中,用甲醇溶解并定容,即得100μg·mL-1對照品貯備液。2.2.2含有藥物的體破乳劑精密量取酮康唑醇質(zhì)體0.2mL于10mL量瓶中,用甲醇破乳并定容至刻度,備用。2.2.3白色醇質(zhì)體破液2.3hplc色度分析方法的構(gòu)建2.3.1色譜線的制備色譜柱為SinochromODS-BP(4.6mm×200mm,5μm);流動相為乙腈-水-三乙胺(60∶40∶0.5,以磷酸調(diào)pH8.6);柱溫為室溫;流速為1.0mL·min-1;檢測波長為243nm,進(jìn)樣量為20μL。取“2.2”中3種溶液用流動相適當(dāng)稀釋后分別進(jìn)樣,得色譜圖1?？梢娡颠蛏V峰保留時(shí)間約7.364min,按酮康唑計(jì)理論板數(shù)為8833,拖尾因子為0.84,輔料和試劑對酮康唑測定無干擾。2.3.3日內(nèi)和一個(gè)月精密度將“2.3.2”項(xiàng)下10,40,80μg·mL-1酮康唑?qū)φ掌啡芤涸谑覝胤胖?每隔3h進(jìn)樣,考察日內(nèi)精密度;每天同一時(shí)刻進(jìn)樣,考察3d內(nèi)的日間精密度。計(jì)算日內(nèi)和日間精密度,見表1。結(jié)果RSD均<2%,表明精密度良好。2.3.4對照品回收率的測定精密量取1.0mL空白醇質(zhì)體置10mL量瓶中,分別加入1.0,4.0,8.0mL的酮康唑?qū)φ掌焚A備液,各3份,用甲醇定容,測定回收率。結(jié)果表明空白加樣回收率良好。結(jié)果見表2。2.3.5總酮康唑含量測定精密移取0.2mL同一批自制的樣品3份,用甲醇直接破乳并定容至10mL,按照“2.3.1”項(xiàng)下方法測定樣品中酮康唑的總含量為4.93mg·mL-1,RSD為0.62%(n=3)。2.4葡聚糖溶液的制備稱取適量葡聚糖用蒸餾水浸泡煮沸2h以上使其充分溶脹并用蒸餾水漂洗干凈,再填充于2.5mL注射器中,置于離心機(jī)中,以2000r·min-1離心3min,除去柱中部分水分,使葡聚糖在2.5mL刻度線附近,備用。取0.2mL樣品置于柱頂端,以2400r·min-1離心5min,再用0.2mL蒸餾水洗脫,重復(fù)3次,合并4次離心液于10mL量瓶中,待分析。2.4.2加標(biāo)回收率測定取空白醇質(zhì)體0.2mL兩份,一份直接用蒸餾水定容至10mL;另一份按照“2.4.1”項(xiàng)下方法操作,過柱離心,收集液用蒸餾水定容至10mL,于500nm處測定A前和A后,按A后/A前×100%計(jì)算空白醇質(zhì)體過柱后的平均回收率,得醇質(zhì)體過柱后的平均回收率為99.49%,RSD為0.39%。2.4.3離心柱前微柱的吸附取濃度分別為40,20,1mg·mL-1的酮康唑溶液各0.2mL兩份。一份直接用甲醇稀釋定容至10mL;另一份按照“2.4.1”項(xiàng)下方法操作,收集離心液后用甲醇定容。再按照“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件測定過微柱前后的峰面積,分別得Y前,Y后。按(Y前-Y后)/Y前×100%計(jì)算微柱對游離藥物吸附率,得微柱對酮康唑的吸附率達(dá)到99.30%,RSD為0.88%。結(jié)合“2.4.2”項(xiàng)下結(jié)果可知,在“2.4.1”的離心洗脫條件下,游離藥物與醇質(zhì)體可以完全分離。2.5柱離心前醇質(zhì)體中酮康唑峰面積測定準(zhǔn)確量取3個(gè)不同批號的醇質(zhì)體樣品0.2mL4份,一份用甲醇直接破乳并定容至10mL,測定過柱離心前醇質(zhì)體中酮康唑峰面積(Y前)。另3份按“2.3.1”項(xiàng)下方法分離樣品,測定過柱后包封于醇質(zhì)體中酮康唑峰面積(Y后),按公式En%=Y后/Y前×100%計(jì)算包封率,結(jié)果見表3。3討論3.1流動相的選擇參照文獻(xiàn),以甲醇-水(80∶20)為流動相,酮康唑色譜峰出峰時(shí)間為2.685min,輔料峰為1.978min,藥物峰與輔料峰保留時(shí)間十分接近,不能很好分離。流動相改為乙腈-水-三乙胺(60∶40∶0.5,磷酸調(diào)pH7.0),藥物峰為8.432min,保留時(shí)間有點(diǎn)長。但是當(dāng)乙腈-水-三乙胺(60∶40∶0.5,以磷酸調(diào)pH8.6),藥物峰(約7.364min)與輔料峰(10.333min)完全分離,雜峰少,峰形好,拖尾因子為0.84,所以,以此為酮康唑醇質(zhì)體中藥物測定的流動相。3.2萃取條件的優(yōu)化微柱的制備、離心轉(zhuǎn)速與時(shí)間、洗脫液用量與次數(shù)等對游離藥物與醇質(zhì)體的分離有很大的影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)微柱中水分保留量對后續(xù)分離效果非常重要,足夠的水分可以推動醇質(zhì)體的洗脫;但洗脫液用量與次數(shù)多又會導(dǎo)致游離藥物洗出,且收集液體積大,對醇質(zhì)體的破乳會帶來麻煩。經(jīng)反復(fù)實(shí)驗(yàn)摸索,對本體系中游離酮康唑與醇質(zhì)體的分離條件是:2.5mL葡聚糖凝膠微柱置于離心機(jī)中,以2000r·min-1離心3min,除去柱中部分水分待用;取0.2mL樣品置于微柱頂端,以2400r·min-1離心5min,再用0.2mL蒸餾水洗脫離心并重復(fù)3次,即可。取空白醇質(zhì)體按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備。2.3.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密量取“2.2.1”項(xiàng)下100μg·mL-1酮康唑?qū)φ掌焚A備液0.5,1.0,2.0,4.0,