七個(gè)步驟教你通過反應(yīng)曲線排查生化儀系統(tǒng)誤差

七個(gè)步驟教你通過反應(yīng)曲線排查生化儀系統(tǒng)誤差目前生化檢驗(yàn)工作中自動(dòng)化分析儀的應(yīng)用十分普遍，自動(dòng)化分析取代了費(fèi)時(shí)費(fèi)力的手工操作，既提高了工作效率又便于生化檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化，大大推動(dòng)了生化檢測(cè)的發(fā)展。生化反應(yīng)曲線分析是每一個(gè)使用全自動(dòng)生化儀的檢驗(yàn)人員都應(yīng)該必備的技能，通過反應(yīng)曲線可快速有效地查找分析生化檢測(cè)中誤差、失控產(chǎn)生的原因，可幫助發(fā)現(xiàn)隱匿型失控如超出線性范圍，然后有針對(duì)性地找到解決問題的方法，從而保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確、有效。下圖是一個(gè)動(dòng)力學(xué)零級(jí)反應(yīng)雙試劑的正常反應(yīng)曲線（以GGT的一個(gè)正常曲線為例），今天我們就通過這個(gè)例子和大家共同學(xué)習(xí)一下全自動(dòng)生化分析儀的反應(yīng)曲線：圖1.動(dòng)力學(xué)法零級(jí)反應(yīng)（動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)法）雙試劑的反應(yīng)曲線反應(yīng)曲線概述反應(yīng)曲線的縱坐標(biāo)為吸光度，注意這里的數(shù)值是真正的吸光度乘以10000,上圖中吸光度為100的實(shí)際吸光度應(yīng)該是0.01A。反應(yīng)曲線的縱坐標(biāo)間隔，不同廠家的試劑和生化項(xiàng)目上都是不固定的，所以僅僅從反應(yīng)曲線我們無法確認(rèn)吸光度的波動(dòng)是否超限，必須配合上相應(yīng)的反應(yīng)數(shù)據(jù)才能進(jìn)行確認(rèn)。反應(yīng)曲線的橫坐標(biāo)為測(cè)量周期，根據(jù)參數(shù)有不同測(cè)量周期一般為8-12秒。不同反應(yīng)階段我們把一個(gè)正常的雙試劑反應(yīng)曲線可以認(rèn)為地分為6個(gè)部分，如圖中所示：A點(diǎn)加入試劑1（RI）;B段RI升溫；C點(diǎn)加入樣本（S）;D段S+Rl孵育時(shí)間；E點(diǎn)加入R2（試劑2）；F段反應(yīng)開始直到結(jié)束。單試劑的測(cè)試與雙試劑相比只是少了D、E兩步。A點(diǎn)加人試劑1反應(yīng)曲線測(cè)試周期為0的一點(diǎn)為杯空白，在A點(diǎn)即第1個(gè)測(cè)試周期，試劑l加入反應(yīng)杯中，這一點(diǎn)的吸光度應(yīng)該為試劑1的試劑空白。這一點(diǎn)和杯空白不同，所以第一點(diǎn)是杯空白，第二點(diǎn)是試劑空白。針對(duì)不同的試劑，A點(diǎn)的吸光度會(huì)有不同，我們要認(rèn)真閱讀試劑說明書。例如ALT的第一試劑中含有主要的吸光物質(zhì)NADH，而試劑說明書中對(duì)試劑空白的要求是必須大于1.0,這就決定了A點(diǎn)的吸光度在圖中的縱軸應(yīng)該在10000以上，常見的應(yīng)該在17000到20000之間；而Y—GT的第一試劑中并不含任何主要的吸光物質(zhì)，試劑說明書當(dāng)中對(duì)試劑空白的要求是小于1.3。如果一旦出現(xiàn)吸光度不滿足試劑的性能要求，可以考慮試劑失效（請(qǐng)丟棄）；另一方面，大部分設(shè)備的吸光度檢測(cè)范圍都不超過2.5，因?yàn)樯瘍x的檢測(cè)原理為Lambert-Beer定律，它只適合于均勻非散射的低濃度介質(zhì)，一般比色法測(cè)量值推薦的吸光范圍在0.3-0.7以內(nèi)，如果A點(diǎn)的吸光度達(dá)到了50000以上（唯一例外的是CO2的試劑要求是不小于1.2A），要考慮是否有可能在反應(yīng)杯中出現(xiàn)了污染物或者氣泡，此時(shí)取出相應(yīng)的反應(yīng)杯進(jìn)行肉眼觀察是最好的辦法。B段試劑1升溫試劑一在升溫的過程中吸光度應(yīng)該是沒有什么變化的，其中某些試劑在此過程中吸光度會(huì)緩慢上升共計(jì)200（0.02A）左右也是有的，但是連續(xù)的兩個(gè)檢測(cè)周期吸光度的波動(dòng)范圍正常的是在20以內(nèi)。如果遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過這個(gè)限制，比如100以上，要考慮：a）反應(yīng)杯中有干擾因素：常見的是氣泡或杯子不干凈。可以通過肉眼觀察進(jìn)行驗(yàn)證。同時(shí)這種波動(dòng)也局限于個(gè)別杯子中，其他大部分杯子會(huì)是好的。b）采集時(shí)間和光路配合不好：常見的是光電采集位置參數(shù)變化或反應(yīng)盤轉(zhuǎn)動(dòng)不穩(wěn)定。這種波動(dòng)會(huì)在幾乎所有的杯子中出現(xiàn)。而且波動(dòng)的程度也相對(duì)較大。c）光路本身不穩(wěn)定：常見原因是光源燈老化。光源燈使用2000小時(shí)以上便無法再保證性能?？梢酝ㄟ^更換光源燈進(jìn)行確認(rèn)。C點(diǎn)加入樣本在加入樣本的一瞬間，由于樣本本身是有顏色的，必然導(dǎo)致這一點(diǎn)吸光度的上升。根據(jù)樣本顏色的深淺這一點(diǎn)的吸光度會(huì)比之前一點(diǎn)（加入樣本之前）升高200到1000左右，唯一的例外是我們用蒸餾水作樣本的時(shí)候，吸光度反而會(huì)下降200左右。如果我們?cè)诜磻?yīng)曲線或者反應(yīng)數(shù)據(jù)中可以清楚的觀察到這一點(diǎn)的吸光度變化，我們就可以確認(rèn)樣本是加進(jìn)反應(yīng)杯中了。同時(shí)比較重復(fù)性測(cè)試的幾個(gè)相同測(cè)試的反應(yīng)曲線變化值。我們就可以大致確認(rèn)樣本的加入量是否一致。樣本加入出現(xiàn)的問題一般是由于樣本針?biāo)?、樣本針液面檢測(cè)故障、液路泄漏、樣本注射器位置不固定導(dǎo)致的加樣量不足。D段S+RI孵育時(shí)間這段時(shí)間里，樣本和試劑一在37弋的環(huán)境下會(huì)進(jìn)行孵育的反應(yīng)。從而吸光度會(huì)有一些變化，根據(jù)項(xiàng)目的不同，變化的情況會(huì)不一樣，但是基本上變化的程度都不大，而且這段的反應(yīng)曲線應(yīng)該是平穩(wěn)的或者是連續(xù)變化的。如果出現(xiàn)明顯的波動(dòng)（相鄰的采樣周期吸光度波動(dòng)超過50），要考慮是否攪拌桿有打杯的情況。E點(diǎn)加入試劑2加入試劑2的瞬間．理論上這一刻的吸光度應(yīng)該是雙試劑的試劑空白+樣本光吸收的吸光度的和，但是由于儀器的檢測(cè)時(shí)間和加入試劑的時(shí)間有一定的延遲，導(dǎo)致吸光度偏離我們的理論值（加入時(shí)反應(yīng)就開始了但是周期檢測(cè)不一定馬上檢測(cè)了）。盡管有一定的偏差，這一刻的吸光度應(yīng)該依然會(huì)有一個(gè)合理的變化。比如ALT是一個(gè)吸光度下降的反應(yīng)，第二試劑中沒有NADH，而總體積變大，所以在加入第二試劑這一刻，吸光度應(yīng)該比D段有一個(gè)明顯的下降；而Y—GT是一個(gè)吸光度上升的反應(yīng)，第二試劑中的有效成分會(huì)導(dǎo)致吸光度呈現(xiàn)一個(gè)明顯的上升。如果E點(diǎn)的吸光度沒有變化，我們可以考慮第二試劑是否沒有加入。如果E點(diǎn)的吸光度變化太大，比如升到50000以上，我們必須考慮是否有可能是試劑加入過程中產(chǎn)生了氣泡或者有污染物帶入。當(dāng)然，攪拌桿打杯也會(huì)導(dǎo)致類似的情況。F段反應(yīng)開始直到結(jié)束這一階段是連續(xù)監(jiān)測(cè)法線性反應(yīng)期（一般酶活力的監(jiān)測(cè)方法），這時(shí)的曲線變化完全取決于當(dāng)前測(cè)試的方法。終點(diǎn)法、動(dòng)力學(xué)法、固定時(shí)間法都應(yīng)該符合各自典型的反應(yīng)曲線，同時(shí)要注意說明書中對(duì)反應(yīng)上升和下降的描述．如果出現(xiàn)與預(yù)期的方法學(xué)和反應(yīng)方向完全不匹配的反應(yīng)曲線．我們要考慮是否試劑失效、試劑擺放錯(cuò)誤、對(duì)試劑說明書解讀錯(cuò)誤。這一段反應(yīng)曲線是生化儀獲得反應(yīng)度并計(jì)算出濃度的基礎(chǔ)，如果這段反應(yīng)曲線出現(xiàn)不正常的波動(dòng)，常常會(huì)導(dǎo)致結(jié)果的錯(cuò)誤常見錯(cuò)誤有：a） 反應(yīng)度不足：比如葡萄糖的測(cè)試，作為終點(diǎn)法，F(xiàn)段最后一點(diǎn)的吸光度和D段后端的吸光度的差值就是我們要測(cè)量的反應(yīng)度。5.55g/L的反應(yīng)度應(yīng)該在0.3A這個(gè)數(shù)量級(jí)，從反應(yīng)曲線上看吸光度的變化量應(yīng)該在3000以上，如果出現(xiàn)反應(yīng)度在不同的數(shù)量級(jí)，比如500或者20000，都應(yīng)該考慮是否試劑失效或其他異常情況。b） 反應(yīng)曲線波動(dòng)：除了試劑樣本的加入以外任何時(shí)候反應(yīng)點(diǎn)的狀態(tài)應(yīng)該是穩(wěn)定變化且平滑的反應(yīng)曲線的波動(dòng)應(yīng)該不會(huì)大于20，由于不同的試劑配方和反應(yīng)的不盡相同，很難給出一個(gè)確定的值來界定波動(dòng)的范圍。但是一般測(cè)試的波動(dòng)如果大于100，就很有可能會(huì)有問題。例如攪拌桿打杯、氣泡等等。同時(shí)，由于各個(gè)測(cè)試的反應(yīng)度不同，吸光度的波動(dòng)對(duì)測(cè)試的影響就不盡相同。反應(yīng)越小收到的影響越大，當(dāng)攪拌桿打杯引起的吸光度波動(dòng)一般在50到300之間，對(duì)于葡萄糖（反應(yīng)度為3000以上）就影響很小，但是對(duì)總膽和直膽的影響就很大，因?yàn)檫@兩個(gè)項(xiàng)目在使用雙試劑的時(shí)候反應(yīng)度只有300左右。所以我們?cè)跈z查儀器狀態(tài)的時(shí)候，除了看結(jié)果，一定要看的是反應(yīng)曲線的波動(dòng)情況。結(jié)語檢驗(yàn)工作一旦出現(xiàn)失控必須進(jìn)行失控分析。產(chǎn)生失控的原因很多可能是隨機(jī)誤差也可能是系統(tǒng)誤差。針對(duì)于全自動(dòng)生