第03章 基因工程載體精簡版

第三章基因工程載體概述質(zhì)粒載體噬菌體載體和粘粒載體人工染色體概述什么是載體所謂載體是指能夠攜帶外源DNA片段進(jìn)入受體細(xì)胞并具有自我復(fù)制功能的核酸分子。載體具備的基本條件在宿主細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立自我復(fù)制具有合適的限制酶切位點(diǎn)具有合適的選擇標(biāo)記基因載體的功能

1.運(yùn)送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞

2.為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力

3.為外源基因的擴(kuò)增或表達(dá)提供條件第一節(jié)質(zhì)粒載體什么是質(zhì)粒質(zhì)粒的生物學(xué)特性質(zhì)粒的分離與純化質(zhì)粒載體的構(gòu)建及類型質(zhì)粒載體的穩(wěn)定性什么是質(zhì)粒(plasmid)質(zhì)粒是染色體外的能自我復(fù)制的環(huán)狀核酸分子。不能獨(dú)立的存在，只能隨寄主細(xì)胞分裂而遺傳，能獨(dú)立進(jìn)行復(fù)制，廣泛的存在于原核生物或一些真核生物中質(zhì)粒的生物學(xué)特性質(zhì)粒的一般性質(zhì)質(zhì)粒編碼遺傳表型質(zhì)粒的結(jié)合轉(zhuǎn)移特性質(zhì)粒的不親和性質(zhì)粒的復(fù)制特性質(zhì)粒的一般分子特性細(xì)胞質(zhì)粒大多是環(huán)形DNA分子質(zhì)粒可以穩(wěn)定的存在于染色體外，在一定條件下也會整合到染色體上質(zhì)粒一般有三種構(gòu)型：共價(jià)閉合環(huán)形DNA；開環(huán)DNA；線形DNA自主復(fù)制型載體和附加載體的擴(kuò)增方式LinerDNAOpencircleDNASupercircleDNA質(zhì)粒編碼遺傳表型由于質(zhì)粒的存在賦予寄主細(xì)胞許多額外的表型如:抗藥性特征、代謝特征、修飾寄主生活方式的特征等在基因克隆過程中應(yīng)用較多的有抗藥性特征、促進(jìn)質(zhì)粒轉(zhuǎn)移的特征、產(chǎn)生大腸桿菌素的特征等，這些特征在重組子的篩選和表達(dá)載體的構(gòu)建過程中得到充分的應(yīng)用質(zhì)粒的復(fù)制類型嚴(yán)緊型(stringentplasmid)質(zhì)粒復(fù)制受宿主染色體DNA嚴(yán)格控制，拷貝數(shù)少，1-3個(gè)松弛型（relaxedplasmid)受宿主控制比較松拷貝數(shù)多，10-200個(gè)質(zhì)粒的不親和性（不相容性）不親和性（plasmidincompatibility):在沒有選擇壓力的情況下，兩種不同的質(zhì)粒不能在同一個(gè)宿主細(xì)胞系中穩(wěn)定共存的現(xiàn)象。在細(xì)胞的增殖過程中一種質(zhì)粒逐漸被排斥、稀釋掉，這樣的兩種質(zhì)粒稱為不親和質(zhì)粒。前提條件:A和B質(zhì)粒B質(zhì)粒進(jìn)入含A質(zhì)粒的寄主細(xì)胞B質(zhì)粒DNA并不受寄主細(xì)胞的限制體系所降解A和B質(zhì)粒不能長期共存不親合群彼此不相容的質(zhì)粒屬于同一個(gè)不親合群彼此相容的質(zhì)粒屬于不同的不親合群質(zhì)粒的不親和性機(jī)理質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移特性什么是質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移？是指接合型質(zhì)粒具有自主從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另外一個(gè)細(xì)胞的特性接合型與非接合型質(zhì)粒接合型：攜帶控制細(xì)菌配對和質(zhì)粒結(jié)合轉(zhuǎn)移的基因，能我轉(zhuǎn)移。非接合型：不能自我轉(zhuǎn)移關(guān)于F質(zhì)?？刂瀑|(zhì)粒結(jié)合轉(zhuǎn)移的因子主要是F因子，F(xiàn)因子稱為F質(zhì)粒。

F因子又叫致育因子，是雄性決定因子。是單拷貝接合型質(zhì)粒，94kbF+：含F(xiàn)因子

的細(xì)胞，是雄性細(xì)胞

F―：不含F(xiàn)因子的細(xì)胞，是雌性細(xì)胞F質(zhì)粒轉(zhuǎn)移機(jī)制F+F―

混合培養(yǎng)F+表面的性須結(jié)構(gòu)作用

雌、雄細(xì)胞配對F因子進(jìn)入F―細(xì)胞通過性須結(jié)構(gòu)F―細(xì)胞變成F+細(xì)胞F質(zhì)粒轉(zhuǎn)移機(jī)制非接合型質(zhì)粒不能自我轉(zhuǎn)移只攜帶自主復(fù)制所必需的遺傳信息不具有細(xì)菌配對和質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的基因分子量小屬于松弛型質(zhì)粒載體的構(gòu)建理想的質(zhì)粒載體分子量小，拷貝數(shù)高。有多克隆位點(diǎn)（mcs)有兩種以上的選擇標(biāo)記基因缺失mob基因和tra基因重組質(zhì)粒易導(dǎo)入宿主細(xì)胞多克隆位點(diǎn)（mcs):multiplecloningsite是載體上人工合成的含有緊密排列的多種限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)的DNA片斷。

HindIIISphISse83871PstIHincIIAccISalIXbaIBamHISmaIXmaIKpnISacIEcoRI

pYES2質(zhì)粒載體的多克隆位點(diǎn)

質(zhì)粒載體的構(gòu)建載體必須具備復(fù)制必需區(qū)選擇標(biāo)記基因克隆位點(diǎn)載體的類型

克隆質(zhì)粒載體表達(dá)質(zhì)粒載體多功能質(zhì)粒載體穿梭質(zhì)粒載體克隆質(zhì)粒載體pBR322pBR322表達(dá)質(zhì)粒載體pGEM3Z載體的結(jié)構(gòu)及外源DNA的轉(zhuǎn)錄胞內(nèi)表達(dá)載體分泌型表達(dá)載體原核細(xì)胞表達(dá)載體真核細(xì)胞表達(dá)載體大腸桿菌表達(dá)載體具備:強(qiáng)啟動(dòng)子核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列強(qiáng)轉(zhuǎn)錄終止序列信號肽編碼序列表達(dá)載體與克隆載體之區(qū)別植物表達(dá)載體多功能載體具有體外轉(zhuǎn)錄、克隆、基因表達(dá)、測序等功能穿梭載體(shuttleplasmidvector)具有兩種不同復(fù)制起點(diǎn)和篩選標(biāo)記，可在兩種不同的宿主中存活復(fù)制的質(zhì)粒載體

穿梭質(zhì)粒類型大腸桿菌—土壤農(nóng)桿菌大腸桿菌—釀酒酵母大腸桿菌—枯草芽孢桿菌大腸桿菌—?jiǎng)游锛?xì)胞

第二節(jié)噬菌體載體與粘粒載體λ噬菌體載體粘粒載體一、λ噬菌體載體λ噬菌體作為克隆載體的優(yōu)越性λ噬菌體的分子生物學(xué)概述λ噬菌體載體的構(gòu)建λ噬菌體載體的類型λ噬菌體的體外包裝λ噬菌體作為克隆載體的優(yōu)越性克隆容量大：噬菌體載體與質(zhì)粒載體相比具有更強(qiáng)的容納外源DNA的片段的能力。噬菌體載體最大可以克窿23Kb外源DNA感染率高：每個(gè)噬菌體顆粒的感染率幾乎是100%，而質(zhì)粒DNA分子大約僅有0.1%的轉(zhuǎn)化率噬菌體基因組可以整合到寄主染色體上與寄主染色體一起復(fù)制安全：噬菌體較質(zhì)粒的宿主范圍要窄的多，因而也就更加安全λ噬菌體的

生物學(xué)特性λ噬菌體的生活周期溶菌周期溶源周期烈性噬菌體溫和噬菌體溶菌周期（裂解周期）溶源周期λ噬菌體的分子生物學(xué)概述基因組的結(jié)構(gòu)λ噬菌體線形的DNA分子的長度是48502bp在λ噬菌體DNA分子的兩端，各有一條由12個(gè)核苷酸組成的彼此完全互補(bǔ)的5′單鏈末端,噬菌體進(jìn)入菌體細(xì)胞后，粘末端配對形成雙連環(huán)狀DNA,這個(gè)由粘末端結(jié)合形成的雙鏈區(qū)段稱為--COS位點(diǎn)。λ噬菌體基因組上的基因是按功能聚集在一起的,有四個(gè)功能區(qū)分別控制頭部、尾部組裝，以及復(fù)制和重組四個(gè)功能區(qū)Cos位點(diǎn)λ噬菌體的基因組分區(qū)λ噬菌體DNA的復(fù)制噬菌體感染的早期，環(huán)形的DNA分子按θ形式從雙向進(jìn)行復(fù)制感染的晚期，按滾環(huán)式復(fù)制合成出由一系列線性排列的基因組DNA組成的長多連體分子

λ噬菌體載體的構(gòu)建消除多余的限制性酶切位點(diǎn)切掉非必要區(qū)段，減小分子量構(gòu)建選擇標(biāo)記cI標(biāo)記法LacZ基因功能選擇法Spi-正向選擇法引入無義突變λ噬菌體載體的