分子標記輔助育種在作物育種上的應用

分子標記輔助育種在作物育種上的應用

隨著現(xiàn)代生物學的發(fā)展，現(xiàn)代生物技術(shù)為作物育種提供了強有力的工具。分子標記輔助選擇（mas）是其中一項重要的技術(shù)。這不僅彌補了傳統(tǒng)選擇技術(shù)在作物育種中的缺陷，而且加速了育種過程。分子標記輔助育種的概念最早是由Lande和Thompson提出,它是將分子標記應用于作物改良的一種手段,其基本原理是利用與目標基因緊密連鎖或表現(xiàn)共分離的分子標記對選擇個體進行目標以及全基因組篩選,從而減少連鎖累贅,獲得期望的個體,達到提高育種效率的目的。分子標記輔助選擇是分子標記技術(shù)用于作物改良的重要領(lǐng)域,是傳統(tǒng)育種技術(shù)和現(xiàn)代生物技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物。1利用分子標記進行農(nóng)藝性狀的檢測大量理論研究發(fā)現(xiàn),MAS比以表現(xiàn)型為基礎(chǔ)的選擇更有效率,它不僅針對主基因有效,針對數(shù)量性狀位點(QTL)也有效;不僅針對異交作物有效,針對自花授粉作物也有效。MAS的優(yōu)越性可以體現(xiàn)在以下方面:1.1可以在植物發(fā)育的任何階段進行選擇,對目標性狀的選擇不受基因表達和環(huán)境的影響,可在早代進行準確的選擇,加速育種進程,提高育種效率;有很多重要性狀(如產(chǎn)量和后期葉部或穗部病害抗性等)只有在成熟植株上才能表現(xiàn)出來,因此采用傳統(tǒng)方法在播種后數(shù)月或數(shù)年均不能對其進行選擇。而利用分子標記就可以對幼苗(甚至對種子)進行檢測,從而大大節(jié)省培育植株所浪費的人力、物力和財力。1.2共顯性標記可區(qū)分純合體和雜合體,不需下代再鑒定,而且在分離世代能快速準確地鑒定植株的基因型。因而對分離群體中目標基因的選擇,尤其是對隱性農(nóng)藝性狀的選擇十分便利1.3可有效地對抗病性、抗逆性和根部性狀等表型鑒定困難的性狀進行基因型鑒定。有些表型如抗病蟲性、抗旱性或耐鹽性等只有在不易界定或控制的特定條件下才能表現(xiàn)出來。在育種項目的初期,育種材料較少,不允許做重復鑒定,或要冒一定風險。利用分子標記技術(shù)則可克服基因型鑒定的困難。1.4可聚合多個有利基因提高育種效率。基因聚合(genepyramiding)就是將分散在不同品種(材料)中的有用基因聚合到同一個基因組中,基因聚合育種就是通過傳統(tǒng)雜交、回交、復交技術(shù)將有利基因聚合到同一個基因組,在分離世代中通過分子標記選擇含有多個目標基因的單株,從中再選出農(nóng)藝性狀優(yōu)良的單株,實現(xiàn)有利基因的聚合,大大提高了育種效率。1.5克服不良性狀連鎖,有利于導入遠緣優(yōu)良基因。在回交育種時,可有效地識別并打破有利基因和不利基因的連鎖,快速恢復輪回親本的基因型。對于一些主效基因,利用回交結(jié)合MAS的方法,可以容易地將這些基因轉(zhuǎn)移到輪回親本中。2影響mas選擇效率的因素MAS雖是提高選擇效率的一種有效方法,但由于MAS研究涉及的內(nèi)容廣泛,影響MAS選擇效率的因素較為復雜,有很多遺傳的和生物學的因素影響其效率,包括標記與基因之間的距離、目標性狀的遺傳率、群體大小、選用分子標記數(shù)目以及選擇世代等。2.1標記選擇的可靠性回交選擇程序中的分子標記輔助選擇技術(shù)可分為前景選擇(foregroundselection)和背景選擇(backgroundselection)。前景選擇是在對回交群體的選擇中,通過對轉(zhuǎn)入受體中的與供體優(yōu)良基因座位緊密連鎖的標記或基因內(nèi)標記的檢測,從而篩選出攜帶目標基因的單株。前景選擇的準確性主要取決于標記與目標基因的連鎖強度,標記與基因連鎖得愈緊密,依據(jù)標記進行選擇的可靠性就愈高。若只用一個標記對目標基因進行選擇,則標記與目標基因連鎖必須非常緊密,才能達到較高正確率。理論上,在F2代通過標記基因型MM選擇目標基因型QQ的正確概率P和標記與基因間重組率r有如下關(guān)系:P=(1-r)2,若要求選擇P達到95%以上,則r不能超過2.5%,當r超過10%時,則P降至81%以下。如果用兩側(cè)相鄰標記對目標基因進行跟蹤選擇,可大大提高選擇正確率。在單交換間無干擾的情況下,在F2代通過標記基因型M1M1和M2M2選擇目標基因型QQ的P值和r有如下關(guān)系:P=(1-r1)2(1-r2)2/[(1-r1)(1-r2)+r1r2]2,即使r1、r2均達20%時,同時使用兩個標記P值也仍可達88.5%。潘海軍等在水稻MAS(Xa23)中,用單標記RpdH5和RpdS1184的準確率分別為91.10%和87.13%,同時使用這兩個標記MAS準確率則達99.0%,可見雙標記選擇效率比單標記高。此外,重組值r也影響到由該標記位點等位基因分離產(chǎn)生遺傳方差的大小,r值越小,遺傳方差越大,數(shù)量性狀的選擇效率越高。2.2性狀遺傳率對mas效率的影響性狀的遺傳率極大地影響MAS選擇效率。遺傳率較高的性狀,根據(jù)表型就可對其實施選擇,此時分子標記提供的信息量較少,MAS效率隨性狀遺傳率增加而顯著降低。在群體大小有限的情況下,低遺傳率的性狀,進行MAS的相對效率較高,但存在一個最適的群體大小,在此限之下MAS效率會降低。如遺傳率在0.1~0.2時,MAS效率會更高,但出現(xiàn)負面試驗頻率也高一些(如QTL檢測能力下降等)。因此,利用MAS技術(shù)所選性狀的遺傳率應在中度(0.3~0.4)為好。2.3mas群體大小群體大小是制約MAS選擇效率的重要因素之一。一般情況下,MAS群體大小不應小于200個。選擇效率隨著群體增加而提高,特別是在低世代,遺傳率較低的情況下尤為明顯,所需群體數(shù)的大小隨QTL數(shù)目的增加呈指數(shù)上升。2.4標記數(shù)對mas效率的影響理論上標記數(shù)越多,從中篩選出對目標性狀有顯著效應標記機會就越大,因而應有利于MAS。事實上,MAS效率隨標記數(shù)增加先增后減。MAS效率主要取決于對目標性狀有顯著效應的標記,因而選擇時所用標記數(shù)并非越多越好。Gimelfarb和Lande的研究表明,利用6個標記時,MAS效率明顯高于3個標記,但用12個甚至更多時,MAS效率在低世代時反而降低,在高世代時增幅很小。一條染色體上有多個標記時,存在一個最適標記密度,在此之上則相對效率降低。2.5各時代背景選擇的優(yōu)化回交育種中除了目的基因的轉(zhuǎn)移外,主要目標是盡可能快速地恢復輪回親本基因組。對基因組中除了目的基因之外的其它部分的選擇,即背景選擇(BackgroundSelection)。背景選擇目標之一是減少目標等位基因載體染色體上供體基因組的比例;目標之二是減少非目標等位基因載體染色體上的供體基因組。背景選擇盡可能覆蓋整個基因組,進行全基因組的選擇。在早代變異方差大,重組個體多,中選幾率大。因此背景選擇應在育種早期世代進行,隨著世代的增加,背景選擇效率會逐漸下降。在早期世代,分子標記與QTL的連鎖非平衡性較大;隨著世代的增加,效應較大的QTL被固定下來,MAS效率隨之降低。2.6標記選擇的影響模擬研究發(fā)現(xiàn),隨著QTL增加,MAS效率降低。當目標性狀由少數(shù)幾個基因(1~3)控制時,用標記選擇對發(fā)掘遺傳潛力較為有效;然而當目標性狀由多個基因控制時,由于需要選擇世代較多,加劇了標記與QTL位點間的重組,降低了標記選擇效果;在少數(shù)QTL可解釋大部分變異的情況下,MAS效率較高。3分子標記的輔助選擇前提和基礎(chǔ)3.1建立標記連鎖圖譜分子標記連鎖圖譜也稱為“框架圖譜”,因為真正的基因?qū)⒈欢ㄎ挥谶@個圖譜上。進行基因定位時,需要構(gòu)建將分子標記以線性形式排列的標記連鎖圖譜,顯然只有建立相對飽和的連鎖圖譜,才能進行基因的精細定位。目前在水稻、玉米、小麥、大麥、番茄、馬鈴薯等多數(shù)作物上都建立了相當飽和的遺傳圖譜。3.2目標性狀基因與標記的重組率基因標記(genetagging)即是建立目標基因與分子標記之間的連鎖關(guān)系。分子標記輔助選擇的可靠程度取決于目標性狀基因座位與標記座位之間的重組率,可見二者之間的距離越近越好。如果在目標基因的兩側(cè)均能找到與之連鎖的標記會大大提高選擇的可靠性。值得注意是目標性狀與標記座位間的重組率在不同的群體中有一定的差異,且往往目標性狀的標記群體不是育種群體,因此在實際應用中,要求用于輔助選擇的分子標記與目標性狀的重組率必須較低3.3rapd和ssr標記方法在育種實踐中的應用植物育種中可利用的分子標記有許多種,常用的有RFLP、RAPD、SSR和AFLP等。RFLP、SSR和AFLP,大多是共顯性標記,可區(qū)分純合和雜合型。其中基于分子雜交的RFLP分析需要的總DNA多,檢測過程復雜,而且費用大,難以在育種實踐中推廣應用;RAPD需要DNA量少,分析程序簡單,但大多是顯性標記,不能區(qū)分純合和雜合型,且重復性差,在實際應用中也存在一定的局限;AFLP的優(yōu)點是多態(tài)性好,準確性高,靈活性強,但它的分析程序較復雜,而且成本較高,一般的育種單位難于接受。SSR則結(jié)合了前面三種方法的優(yōu)點,需要DNA量較少,多態(tài)性好,分析程序簡單,重復性較高以及成本相對較低,是分子標記輔助育種中較理想的一種分子標記。在實際育種實踐中,要根據(jù)實際情況選擇使用分子標記,而以上選擇標準也并非絕對。例如有的RAPD標記在某些植物分析中表現(xiàn)出共顯型,且重復性很好,就可以用于標記輔助選擇?？傊?用于分子標記輔助育種的標記最好是基于PCR技術(shù)的分子標記,成本較低,技術(shù)較簡單,在兩個親本之間有較好的多態(tài)性且?guī)颓逦?代理選擇技術(shù)的應用研究4.1在對作物回交繁殖的研究中，分子標記的應用4.1.1玉米花葉病毒的mv1基因定位分子標記輔助選擇技術(shù)利用與目標基因緊密連鎖的分子標記對是否帶有目標基因的單株進行前景選擇,大大加快了育種進程。Ming等把抗玉米花葉病毒(MMV)的mv1基因定位在第3染色體上后,利用RFLP標記PHP20508和UMC102作輔助手段把抗病基因轉(zhuǎn)移到30個感病自交系中,既降低了成本,又縮短了時間。Hansen等利用4個RAPD標記,在10個BC1F2家系的4605個單株中快速選出了oguCMS恢復位點純合的906個單株,此法大大節(jié)省了測交的工作量及時間,充分展現(xiàn)了分子標記輔助選擇的優(yōu)越性。4.1.2分子標記連鎖圖在回交育種中,分子標記輔助選擇技術(shù)可以快速選出以輪回親本基因組為主要遺傳背景的單株。孟金陵等認為,通過分子標記輔助選擇技術(shù),借助于飽和的分子標記連鎖圖,對各選擇單株進行整個基因組的組成分析,進而可以選出帶有多個目標性狀而且遺傳背景良好的理想個體。Tanksley等通過計算機模擬分析,結(jié)果表明,如果從每個回交世代含有目標基因的30個單株中,通過分子標記輔助選擇選出1株帶有輪回親本基因組比率最高的個體作為下一次回交的親本,則幾乎完全恢復到輪回親本基因組的基因型只需3代,而在傳統(tǒng)的育種方法中,要達到99%的輪回親本恢復比率則需要6.5±1.7代。4.1.3分子標記輔助選擇在回交育種中,連鎖累贅現(xiàn)象是影響回交育種的一個主要限制因素。傳統(tǒng)的解決方式一般是通過擴大選擇群體或增加回交次數(shù)來解決。Stam等的研究表明,即使回交20代后,還能發(fā)現(xiàn)相當大的與目標基因連鎖的供體染色體片段,而在大多數(shù)植物基因組中10cM的DNA序列足夠包含數(shù)百個基因。通過分子標記輔助選擇可以快速減輕連鎖累贅。Tanksley等的研究表明,用位于目標基因兩側(cè)1cM的兩個分子標記進行輔助選擇,通過兩個世代就可獲得含目標基因長度不大于2cM的個體。這樣的結(jié)果如果采用傳統(tǒng)的育種方式則需要100代才能達到。因此,分子標記輔助選擇可以對目標基因附近發(fā)生了重組的個體進行鑒定。4.2分子標記輔助鑒定基因聚合是將多個有利基因通過育種途徑聚合到一個品種(材料)之中,使其在多個性狀上同時得到改良,產(chǎn)生更有實用價值的育種材料。在抗病育種中經(jīng)常應用基因聚合技術(shù),育種家將多個控制垂直抗性的基因聚合在同一品種中可以提高作物抗病的持久性。在傳統(tǒng)的抗病性檢測中,通過接種鑒定不僅程序復雜,而且常常影響植株的生長發(fā)育,加之一些抗性基因很難找到相應的鑒定小種。采用與抗性基因緊密連鎖的分子標記或相應基因的特異引物進行分子標記輔助選擇,可加速抗源篩選和抗性基因的鑒定,提高育種選擇效率,縮短育種周期。特別是在多個抗性基因的聚合選育和轉(zhuǎn)移數(shù)量抗性基因方面具有廣泛的應用前景。Huang等.用RFLP和PCR標記在一個分離群體中篩選出同時含有4個抗白葉枯病基因Xa4、Xa5、Xa13和Xa21的單株。柳李旺等利用與CMS恢復基因Rf1緊密連鎖的3個SSR標記和Bt基因的PCR標記開展分子標記輔助選擇,培育聚合有Rf1和Bt的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉恢復系。何光明等采用分子標記輔助選擇與生物學鑒定相結(jié)合的方法,將IPT基因與Xa23及抗稻瘟病基因進行聚合,最終在4個水稻BC2F1回交組合中獲得了7株攜帶IPT基因與Xa23基因的植株。4.3抗旱性標記的分子圖譜的建立作物中大部分的農(nóng)藝性狀是由多基因控制的數(shù)量性狀,每個基因?qū)δ繕诵誀钪槐憩F(xiàn)微效作用,沒有明顯的顯隱性之分,而且表現(xiàn)型受環(huán)境條件影響很大,因而采用傳統(tǒng)的育種途徑對這些性狀進行選擇有較大的難度。分子標記輔助選擇為數(shù)量性狀的改良提供了新的研究思路。Paterson等認為高密度分子遺傳圖譜的建立,使覆蓋全基因組的分子標記將控制數(shù)量性狀的微效多基因分解成孟德爾遺傳因子,并定位到分子標記所在的染色體上,進而按照經(jīng)典遺傳模式進行研究。這就使得利用與QTL緊密連鎖的分子標記對這些QTL進行轉(zhuǎn)移以達到對這些數(shù)量性狀的改良成為可能。CIMMYT于1994年開始玉米耐旱性的標記輔助選擇,對不耐旱的高配合力自交系CML247進行改良。用耐旱供體與其雜交,然后在回交2代自交2代過程中,利用已鑒定的和耐旱性有關(guān)的QTL在5個染色體區(qū)域進行輔助選擇,將得到的70個BC2F3用2個測驗種測交。結(jié)果這70個測驗種的產(chǎn)量在干旱條件下的均值顯著高于對照(未改良CML247的測交組合);在水分充足條件下產(chǎn)量沒有下降。Jean-Marcel介紹了MAS的實例和取得的進展,在改良多基因控制的數(shù)量性狀方面,如抗玉米條紋病毒(MSV)和耐旱育種,把控制數(shù)量性狀的主效QTL轉(zhuǎn)入目標自交系,獲得了良好的預期效果。5標記輔助選擇、雜交親本保護與育種群體近十多年來,分子標記輔助育種已