-谷甾醇對胃癌sgc-7501細(xì)胞殺傷作用機(jī)制的研究

-谷甾醇對胃癌sgc-7501細(xì)胞殺傷作用機(jī)制的研究

近年來，消化系腫瘤的發(fā)病率逐漸增加，治療主要以手術(shù)和放療為主。然而，晚期腫瘤患者失去了手術(shù)的機(jī)會，無法承受放療和放療的強烈毒副作用。因此，提高患者的生存率和生活質(zhì)量已成為治療的重點。隨著腫瘤免疫學(xué)的發(fā)展,腫瘤過繼免疫治療成為目前腫瘤治療的熱點。應(yīng)用多種細(xì)胞因子和刺激分子聯(lián)合誘導(dǎo)培養(yǎng)的人PBMC(共刺激細(xì)胞)是具有高度殺傷活性的免疫效應(yīng)細(xì)胞,劉軍權(quán)等報告,共刺激細(xì)胞對胃癌細(xì)胞SGC-7901、胰腺癌細(xì)胞SW-1990、結(jié)腸癌細(xì)胞SW-1116、人肺癌細(xì)胞株A549、乳腺癌細(xì)胞株MFC-7和人黑素瘤細(xì)胞株HME1殺傷活性明顯高于CIK細(xì)胞。β-谷甾醇(β-sitosterol)為植物甾醇類成分,存在于各種植物油、堅果等植物種子中,相關(guān)研究表明β-谷甾醇具有降低血清膽固醇、消炎解熱、抗腫瘤及提高機(jī)體免疫力等作用。并已證明β-谷甾醇可誘導(dǎo)結(jié)腸癌、前列腺癌和乳腺癌細(xì)胞的凋亡。為了解β-谷甾醇對免疫細(xì)胞的影響,我們將不同質(zhì)量濃度的β-谷甾醇在體外作用于共刺激細(xì)胞,以探討β-谷甾醇對人共刺激細(xì)胞殺傷SGC-7901細(xì)胞的影響極其可能的機(jī)制,以期為β-谷甾醇用于腫瘤的治療提供理論依據(jù)和實驗依據(jù)。1材料和方法1.1免疫、生化藥物和儀器β-谷甾醇(含量>98%,本實驗室制備);四甲基偶唑藍(lán)(MTT)、二甲亞砜(DMSO)均購自Sigma公司;CellCountingKit-8(CCK8)購自碧云天生物技術(shù)研究所;人胃癌SGC-7901細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所;RPMI1640培養(yǎng)基、小牛血清、胰蛋白酶均購自Gibco公司;淋巴細(xì)胞分離液(中國科學(xué)院血液病研究所);IL-1α、IL-2、IL-18(廈門特寶生物公司);IL-15和IL-21(購自R&D公司);CD3單抗(上海免疫研究所);CD28單抗(蘇州大學(xué)生物技術(shù)研究所);INF-γ購于Abender公司;FITC和PerCP標(biāo)記的抗人CD3、PE標(biāo)記的穿孔素、顆粒酶B和APC標(biāo)記的CD107a抗體,Fix&Perm破膜劑均購自杭州聯(lián)科生物公司(Immunotech,Franc);鼠抗人pERK1/2單克隆抗體,兔抗人Bcl-2單克隆抗體均購自santacruz公司;乳酸脫氫酶試劑盒(日本世諾臨床診斷制品株式會社);BCA蛋白質(zhì)量濃度測定試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所);Encore全自動生化分析儀(購自北京希亞克技術(shù)有限公司);流式細(xì)胞儀(美國BD公司);ABXpentra120全自動5分類血液分析儀(法國ABX公司)。1.2重組細(xì)胞的制備取10份健康獻(xiàn)血者外周抗凝血,10ml/每份,用淋巴細(xì)胞分離液分離單個核細(xì)胞(1500r/min,離心15min),吸取單個核細(xì)胞層,生理鹽水洗滌3次(1500r/min離心,10min/次),用RPMIl640培養(yǎng)液(含rhIFN-γ2×106U/L、100ml/L小牛血清、50ml/L人AB血清)調(diào)整細(xì)胞數(shù)為5×108/L,接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,每孔5ml,置37℃、5%CO2環(huán)境培養(yǎng)24h,然后加入IL-1α(10μg/L)、rhIL-2(5×104U/L)、CD3mAb(1mg/L)、IL-15(20μg/L)、IL-18(10μg/L)、IL-21(10μg/L)、CD28mAb(10mg/L),于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每2天半量換培養(yǎng)基(含相應(yīng)的細(xì)胞因子)1次,并調(diào)整細(xì)胞數(shù)為5×108/L。收集培養(yǎng)10d的貼壁細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞表面標(biāo)志物檢測和相關(guān)實驗。1.3細(xì)胞培養(yǎng)和分離將復(fù)蘇后的胃癌SGC-7901細(xì)胞放入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,加入10ml細(xì)胞培養(yǎng)液,在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng),2~3d更換細(xì)胞培養(yǎng)液,細(xì)胞鋪滿瓶底時,0.25%的胰酶消化脫壁,800r/min離心3min,棄去上清,收集細(xì)胞用于實驗。1.5供標(biāo)藥物復(fù)孔取對數(shù)生長期SGC-7901細(xì)胞,配成5×108/L,接種于96孔板中,0.2ml/孔,于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),24h后加入β-谷甾醇(終質(zhì)量濃度分別為0.15、0.3、0.6、1.25、2.5、5、10、20、40、80μg/ml),設(shè)不加藥物的對照組及空白對照,每組設(shè)5個復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)48h后加入MTT20μl,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4h,棄去上清,每孔加入DMSO150μl,輕輕震蕩10min,使沉淀產(chǎn)物完全溶解,在450nm波長酶標(biāo)儀上測定各孔光吸收值(OD),求其平均值后計算細(xì)胞抑制率。1.6cd擴(kuò)增因子tcd107a,gra-pes,cd113,pfp和ifn---2的檢測收集培養(yǎng)10d的共刺激細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,加入β-谷甾醇(終質(zhì)量濃度分別為0.15、0.6、2.5、10、40μg/ml),設(shè)不加藥物的為對照組,每組設(shè)3個復(fù)孔,培養(yǎng)72h,收集細(xì)胞,PBS洗滌3次,調(diào)整細(xì)胞數(shù)至1×1010/L,加入3只離心管,每管100μl細(xì)胞懸液,加入PerCP-Cy5.5標(biāo)記的CD3抗體和FITC標(biāo)記的CD56抗體各20μl,室溫避光孵育30min,PBS洗滌,加入100μl破膜劑A,室溫避光孵育15min,PBS洗滌,加入100μl破膜劑B,同時分別在試管中加入anti-GraB-PE、anti-PFP-PE、anti-CD107a-APC和anti-IFN-γ-APC各5μl,設(shè)置同型對照抗體管,共同孵育15min,PBS洗滌,然后加入PBS500μl,流式細(xì)胞儀檢測CD107a、GraB、PFP和IFN-γ的含量。每組實驗重復(fù)3次,取平均值。1.7活性單位的測定按已建立的LDH釋放法進(jìn)行檢測。將培養(yǎng)10d的共刺激細(xì)胞配成2×109/L的效應(yīng)細(xì)胞,加入6孔板,每孔3ml,加入β-谷甾醇(終質(zhì)量濃度分別為0.15、0.3、0.6、1.25、2.5、5、10、20、40μg/ml),設(shè)不加藥物的為對照組,每組設(shè)3個復(fù)孔,繼續(xù)培養(yǎng)72h,收集共刺激細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞,取對數(shù)生長期的SGC-7901細(xì)胞,配成2×108/L的靶細(xì)胞,將效靶按10∶1比例混合,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育6h后,1500r/min離心10min,收集上清液,全自動分析儀340nm波長下測定LDH的活性單位(U/L),殺傷活性=(測定管LDH單位-效應(yīng)細(xì)胞自然釋放LDH管)/(靶細(xì)胞最大釋放LDH管-靶細(xì)胞自然釋放LDH管)×100%。每檢測樣本設(shè)3個復(fù)管,重復(fù)3遍,取平均值。1.8凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉的制備β-谷甾醇(終質(zhì)量濃度分別為0.15、0.6、2.5、10、40μg/ml)與共刺激細(xì)胞共同培養(yǎng)72h后,離心收集共刺激細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞數(shù)為5×108/L,PBS洗滌3次,2000r/min離心10min,棄上清,加入細(xì)胞裂解液500μl,冰浴30min,4℃,12000r/min離心10min,收集上清作為細(xì)胞總蛋白,BCA試劑盒測蛋白質(zhì)量濃度,按100μg/孔上樣,進(jìn)行凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉。一抗、二抗孵育及顯色,掃描條帶,用ImageJ圖像分析軟件進(jìn)行灰度值分析,以GAPDH為內(nèi)參表示所測蛋白的相對表達(dá)強度。1.9統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理,計量資料使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間比較采用單因素方差分析(One-wayANOVA),檢驗水準(zhǔn)α=0.05,P<0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2結(jié)果2.1fcm檢測共刺激細(xì)胞表型cd3+cd65+表達(dá)體外培養(yǎng)10d后,共刺激細(xì)胞增殖能力明顯增加,增殖倍數(shù)為251±5.8,FCM檢測共刺激細(xì)胞表型CD3+CD56+表達(dá)由4.79%增加到38.47%,結(jié)果如圖1。2.2它對刺激細(xì)胞和星形細(xì)胞的生長有影響。gsc-rt12.2.1谷哌醇對g/ml-谷哌醇共刺激細(xì)胞增殖率的影響質(zhì)量濃度在0.15~10μg/ml時,β-谷甾醇促進(jìn)共刺激細(xì)胞增殖,質(zhì)量濃度大于20μg/ml時,共刺激細(xì)胞生長受抑制。統(tǒng)計分析顯示:與對照組比較,質(zhì)量濃度2.5~10μg/mlβ-谷甾醇作用24h后,共刺激細(xì)胞增殖率顯著提高(P<0.05),質(zhì)量濃度0.6~10μg/mlβ-谷甾醇作用48h后,共刺激細(xì)胞增殖率顯著提高(P<0.05),質(zhì)量濃度0.15~10μg/mlβ-谷甾醇作用72h后,共刺激細(xì)胞增殖率顯著提高(P<0.05),24、48、72h質(zhì)量濃度在5μg/ml時,增殖率達(dá)高峰。相同質(zhì)量濃度的β-谷甾醇作用后,隨著時間的延長,共刺激細(xì)胞的增殖率逐漸上升,72h達(dá)高峰,與24、48h組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖2)。2.2.2不同質(zhì)量濃度對1細(xì)胞生長的影響β-谷甾醇質(zhì)量濃度在10~80μg/ml時對SGC-7901細(xì)胞的生長起明顯的抑制作用,與對照組比較均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),且隨著質(zhì)量濃度的增加抑制率逐漸增大,3個時間段比較無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(圖3)。2.3-谷哌醇對grab、ifn-表達(dá)的影響質(zhì)量濃度為0.15~10μg/ml的β-谷甾醇與共刺激細(xì)胞共同培養(yǎng)72h后,共刺激細(xì)胞PFP、GraB、IFN-γ的表達(dá)率均明顯高于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),提示上述質(zhì)量濃度的β-谷甾醇能夠上調(diào)共刺激細(xì)胞PFP、GraB、IFN-γ的表達(dá),當(dāng)β-谷甾醇質(zhì)量濃度為40μg/ml時,PFP的表達(dá)率低于對照組(P<0.05),提示高質(zhì)量濃度的β-谷甾醇能夠下調(diào)共刺激細(xì)胞的功能。共刺激細(xì)胞中CD107a的表達(dá)水平在β-谷甾醇作用前后無明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),結(jié)果見表1、圖4。2.4-谷哌醇對gc-711細(xì)胞的殺傷活性質(zhì)量濃度為0.3~2.5μg/ml的β-谷甾醇作用72h后,共刺激細(xì)胞對胃癌SGC-7901細(xì)胞的殺傷活性隨著β-谷甾醇質(zhì)量濃度的增加而逐漸增強,質(zhì)量濃度為2.5μg/ml時達(dá)高峰(59.24%),與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),當(dāng)質(zhì)量濃度超過2.5μg/ml時,殺傷活性開始下降,以上結(jié)果顯示適當(dāng)質(zhì)量濃度的β-谷甾醇能夠提高共刺激細(xì)胞對胃癌SGC-7901細(xì)胞的殺傷活性(圖5)。2.5-谷哌醇作用后,2次給藥后,52.0.5%p-erk1/2的表達(dá)β-谷甾醇作用72h后,共刺激細(xì)胞中p-ERK1/2、Bcl-2蛋白的表達(dá)如圖6,灰度值分析結(jié)果顯示:質(zhì)量濃度0.15~2.5μg/ml的β-谷甾醇作用后的共刺激細(xì)胞p-ERK1/2表達(dá)高于對照組,質(zhì)量濃度為40μg/ml時p-ERK1/2的表達(dá)顯著高于對照組,2者與對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);質(zhì)量濃度0.15~40μg/ml的β-谷甾醇作用后共刺激細(xì)胞Bcl-2表達(dá)顯著高于對照組(P<0.05),與對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖6)。3cd8和cd2β-谷甾醇為植物甾醇類成分,主要存在于自然界中的各種植物油、堅果等植物種子中,因其具有低毒、較強的抗腫瘤活性,因此成為腫瘤治療的主要藥物成分。王莉等研究表明不同質(zhì)量濃度的β-谷甾醇作用于宮頸癌細(xì)胞可抑制細(xì)胞的增殖。李慶勇等研究發(fā)現(xiàn)β-谷甾醇可能通過線粒體途徑誘導(dǎo)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞發(fā)生凋亡。本實驗通過不同質(zhì)量濃度的β-谷甾醇在體外誘導(dǎo)人共刺激細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn)β-谷甾醇質(zhì)量濃度在0.15~10μg/ml范圍時,可明顯促進(jìn)其增殖,當(dāng)質(zhì)量濃度為5μg/ml時,3個時間段細(xì)胞增殖率均達(dá)高峰,當(dāng)β-谷甾醇質(zhì)量濃度大于20μg/ml時,共刺激細(xì)胞的增殖出現(xiàn)明顯的抑制,提示β-谷甾醇對共刺激細(xì)胞的增殖具有質(zhì)量濃度窗現(xiàn)象。胃癌在腫瘤中致死率較高,我國是胃癌的高發(fā)國家,每年新發(fā)病例占全球的40%,治療主要以手術(shù)、放化療為主,但對于失去手術(shù)時機(jī)及不能耐受放化療的患者,尋求新的治療方法迫在眉睫。腫瘤免疫治療是調(diào)動機(jī)體的免疫系統(tǒng),增強腫瘤微環(huán)境的抗腫瘤能力,從而控制和殺傷腫瘤細(xì)胞的方法。共刺激細(xì)胞是在人外周血單個核細(xì)胞(PBMC)中添加多種細(xì)胞因子(IFN-γ、IL-1α、IL-2、IL-15、IL-18和IL-21)和刺激分子(CD3mAb、CD28mAb)共同培養(yǎng)的異質(zhì)群免疫效應(yīng)細(xì)胞,這群細(xì)胞高表達(dá)CD45RO+(記憶性T細(xì)胞)和CD3+CD56+(NK樣T細(xì)胞)。培養(yǎng)體系中的IL-15能抑制T淋巴細(xì)胞的凋亡,并促進(jìn)記憶性CD8+T細(xì)胞的存活。IL-21還能有效增強IL-15對前體T細(xì)胞的活化作用,增強細(xì)胞毒性T細(xì)胞的細(xì)胞毒活性并促其分泌IFN-γ,Williams等在體外對HIV患者外周血單個核細(xì)胞培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn),IL-21可以增加CD8+T淋巴細(xì)胞表達(dá)穿孔素。CD28是迄今為止公認(rèn)的最基本的共刺激信號,其在降低T細(xì)胞活化及阻止T細(xì)胞失能等方面均具有重要作用。Vasir等研究表明,CD28可以增加T細(xì)胞的活化,促進(jìn)T細(xì)胞IL-2生成和抗原特異性的T細(xì)胞的增殖。另外效應(yīng)性T細(xì)胞經(jīng)CD28抗體激發(fā)后大量活化增殖,FoxP3+Treg的比例相對下調(diào),細(xì)胞的衰老表達(dá)明顯減少。Paul等在進(jìn)行人的PBMC培養(yǎng)體系中分別或聯(lián)合加入CD3mAb、IL-2、IL-15和CD28mAb后發(fā)現(xiàn),聯(lián)合培養(yǎng)的免疫效應(yīng)細(xì)胞增殖倍數(shù)和分泌的細(xì)胞因子IFN-γ明顯高于單用CD3mAb、IL-2誘導(dǎo)培養(yǎng)的細(xì)胞(CD3AK細(xì)胞),其細(xì)胞CD45RO+和CD3+CD56+表型標(biāo)記也高于CD3AK細(xì)胞;我們的研究結(jié)果顯示,應(yīng)用多種細(xì)胞因子和刺激分子聯(lián)合培養(yǎng)的共刺激細(xì)胞結(jié)果與Paul等報道的結(jié)果類似。PFP是一種糖蛋白,能以鈣離子依賴方式在靶細(xì)胞膜上形成穿孔素管狀通道,進(jìn)而導(dǎo)致靶細(xì)胞滲透性溶解破壞。GraB是具有天冬氨酸酶活性的絲氨酸蛋白酶,它能夠通過caspase依賴途徑、不依賴caspase的胞質(zhì)途徑及直接入核途徑殺傷靶細(xì)胞。IFN-γ主要由活化的T細(xì)胞產(chǎn)生,具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用,在多種疾病和癌癥中發(fā)揮作用。吳江雪等研究發(fā)現(xiàn),IFN-γ對鼻咽癌細(xì)胞有抗腫瘤作用。本研究的FCM結(jié)果顯示,質(zhì)量濃度為0.15~10μg/ml的β-谷甾醇作用后,共刺激細(xì)胞表面的PFP、GraB、IFN-γ的表達(dá)率均明顯高于對照組(P<0.05),提示上述質(zhì)量濃度的β-谷甾醇能夠上調(diào)細(xì)胞PFP、GraB、IFN-γ的表達(dá),當(dāng)β-谷甾醇質(zhì)量濃度為40μg/ml時,PFP的表達(dá)率低于對照組(P<0.05),提示高質(zhì)量濃度的β-谷甾醇能夠下調(diào)共刺激細(xì)胞的功能。細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(ERK1/2)是ERK家族的重要成員,其活化形式是磷酸化細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(p-ERK),通常認(rèn)為ERK磷酸化代表ras/raf/MAPK信號通路的活化。我們的實驗研究發(fā)現(xiàn),β-谷甾醇質(zhì)量濃度在0.15~2.5μg/ml時,共刺激細(xì)胞中p-ERK1/2蛋白的表達(dá)量顯著高于對照組(P<0.05),提示β-谷甾醇能夠上調(diào)細(xì)胞中p-ERK1/2的表達(dá),