開放普通飲食誘導(dǎo)大鼠生長(zhǎng)和胰島素抵抗的實(shí)驗(yàn)研究

開放普通飲食誘導(dǎo)大鼠生長(zhǎng)和胰島素抵抗的實(shí)驗(yàn)研究

跟蹤生長(zhǎng)是身體對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育緩慢的快速報(bào)酬機(jī)制。它的目標(biāo)是減少或消除自育不良引起的損害。越來越多的研究資料顯示這一代償機(jī)制會(huì)對(duì)機(jī)體造成后續(xù)危害,導(dǎo)致中心性肥胖、2型糖尿病和心血管疾病。我們能尋找到的大量的有關(guān)追趕生長(zhǎng)的研究資料都是關(guān)注低出生體重及宮內(nèi)發(fā)育遲緩的個(gè)體,相關(guān)的動(dòng)物模型亦非常的成熟,但很少的研究關(guān)注正常出生體重者,在出生后由于各種因素所致生長(zhǎng)發(fā)育受阻,一旦糾正阻礙生長(zhǎng)發(fā)育的因素后是否也會(huì)出現(xiàn)追趕生長(zhǎng),且這種追趕生長(zhǎng)是否同樣會(huì)導(dǎo)致后期的胰島素抵抗及相關(guān)慢性疾病。我們?cè)O(shè)計(jì)并成功制造了限食后開放飲食所致的大鼠追趕生長(zhǎng)模型,同時(shí)關(guān)注追趕生長(zhǎng)與胰島素抵抗之間的關(guān)聯(lián)及相關(guān)的糖脂代謝變化。1材料和方法1.1高脂飼料的成型大鼠對(duì)照飼料購(gòu)自湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,含熱能1.29MJ/100g(308.98kcal/100g)。按照質(zhì)量百分比計(jì)算,蛋白質(zhì)占24.46%,脂肪占6.5%,碳水化合物占38.16%。按照熱能百分比計(jì)算,蛋白質(zhì)占31.67%,脂肪占18.94%,碳水化合物占49.39%。高脂飼料在上述飼料基礎(chǔ)上,添加20%豬油,10%白砂糖,0.1%膽鹽(w/w),含熱能1.99MJ/100g(475.67kcal/100g)。成型后的高脂飼料中各營(yíng)養(yǎng)成分的質(zhì)量百分比分別為蛋白質(zhì)17.12%,脂肪24.47%,碳水化合物36.74%;熱能百分比為蛋白質(zhì)15.72%,脂肪50.55%,碳水化合物33.73%。1.2高脂飼料的飼養(yǎng)華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供的6w齡雄性Wistar大鼠40只,體重為140~160g,隨機(jī)分為5組,每組8只。所有大鼠均適應(yīng)性喂養(yǎng)1w后進(jìn)入實(shí)驗(yàn),進(jìn)入實(shí)驗(yàn)時(shí)體重為160~190g。按照實(shí)驗(yàn)要求飼以對(duì)照飼料或高脂飼料,自由進(jìn)水。飼養(yǎng)室內(nèi)溫度為(21±1)℃,濕度(60±10)%,光照時(shí)間12h(8:00~20:00)。1.2.1對(duì)照組(NC):給對(duì)照飼料,每日稱進(jìn)食量,作為限食組大鼠進(jìn)食量的參照。喂養(yǎng)時(shí)間12w。1.2.2限食組(FR):進(jìn)食對(duì)照飼料,進(jìn)食量為對(duì)照組的一半,使其處于半饑餓狀態(tài),食物分為上、下午兩次等量投食。限食時(shí)間為4w。1.2.3限食后恢復(fù)正常飲食組(RN):按FR組方法限食4w后,給予開放的正常飼料喂養(yǎng)8w。1.2.4限食后給予高脂飲食組(RH):按FR組限食4w后,給予開放的高脂飼料喂養(yǎng)8w。1.2.5高脂組(HF):給予高脂飼料喂養(yǎng)12w,進(jìn)食量不限。1.3實(shí)驗(yàn)方法1.3.1bw麻醉大鼠輸注后穿刺心臟采血所有動(dòng)物禁食12h,1%戊巴比妥鈉按60mg/kgbw麻醉大鼠,1h后用1ml的靜脈注射器穿刺心臟采血。全血置于黃頭促凝管中,靜置40min左右,待其凝固后3500r/min離心,分離血清,放入-80℃冰箱保存待檢1.3.2腎周脂肪墊組戊巴比妥鈉過量處死動(dòng)物后,立即剪開腹壁皮膚和肌肉,完整剝離2側(cè)附睪脂肪腎周脂肪墊,電子天平稱重,并記錄。計(jì)算內(nèi)臟脂肪(以2側(cè)附睪脂肪和腎周脂肪之和代替)占體重的比例(g/g)。1.3.3體重、食性測(cè)定通過下列公式計(jì)算:以HOMAIR高于對(duì)照組為判斷胰島素抵抗的依據(jù)。1.3.4體重和進(jìn)食量的檢測(cè):體重每周稱量一次,并記錄;前4w每天稱量5組的進(jìn)食量,以NC組平均進(jìn)食量作為限食參考。限食結(jié)束后所有組進(jìn)食量均每周記錄一次。1.3.5血漿葡萄糖試劑胰島素檢測(cè)采用人胰島素放免試劑盒(天津九鼎醫(yī)學(xué)生物工程公司)。血漿葡萄糖使用葡萄糖氧化酶法試劑盒(北京北化康泰臨床試劑公司)。血脂和血清蛋白檢測(cè)使用OlympusAU-2700全自動(dòng)生化檢測(cè)儀及其配套的試劑。1.4統(tǒng)計(jì)方法應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包。組間比較采用單因素方差分析,多組間兩兩比較,采用q檢驗(yàn)。2結(jié)果2.1兩組的《反應(yīng)總HF組和NC組的進(jìn)食量曲線交替上升,但大部分情況HF組的進(jìn)食量低于NC組。RN組和RH組在恢復(fù)飲食最初2w內(nèi),進(jìn)食量迅速增長(zhǎng),但隨后慢慢減少,在實(shí)驗(yàn)8~9w(回復(fù)飲食4~5w)恢復(fù)至與對(duì)照組相近水平。2.2體重大小對(duì)大鼠體重的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),高脂組體重較對(duì)照組略輕,但二者在統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒有明顯差異(P=0.195)。限制飲食后開放飲食組(RN組和RH組)體重均未追趕上正常對(duì)照組和高脂喂養(yǎng)組(P<0.05)。2組追趕生長(zhǎng)組,在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),體重沒有明顯差異(P>0.05)。FR組在限食結(jié)束時(shí),體重較試驗(yàn)前無明顯變化,而同齡的NC組,平均體重約增長(zhǎng)100g,FR組的生長(zhǎng)發(fā)育明顯遲滯。2.3大鼠內(nèi)臟脂肪/體重的比較RH組內(nèi)臟脂肪的堆積速度非常迅速,其內(nèi)臟脂肪與體重的比例(g/g)與HF組接近(0.0375±0.006vs0.0368±0.006),二者沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異(P>0.05)。RN組內(nèi)臟脂肪/體重比與NC組接近。NC組大鼠的平均體重在5個(gè)實(shí)驗(yàn)組中是最高的,但其內(nèi)臟脂肪/體重比明顯低于HF組和RH組。經(jīng)過4w的限食FR組內(nèi)臟脂肪明顯低于NC組。2.4兩組12w組成的血脂水平比較如表1所示,實(shí)驗(yàn)前,各組大鼠的TC和TG沒有明顯差異。經(jīng)過12w喂養(yǎng),HF組和RH組TG和TC均明顯高于NC組;HF組和RH組之間的血脂水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;RN組TC和TG與NC組比較沒有明顯差異。FR組TG明顯降低,但TC沒有明顯變化。2.5大鼠血清總蛋白的測(cè)定如圖4所示,高脂飲食以及限食后開放飲食(無論開放為正常飲食還是高脂飲食),均對(duì)大鼠血清總蛋白沒有明顯影響。而只有限食組的血清總蛋白(TP)明顯低于正常組,出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。2.6兩組fins、homair比較RH組空腹血糖最高,但經(jīng)組間比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。HF組、RN組和RH組的FIns水平均明顯高于NC組,其中RH組的FIns還明顯高于HF組。RH和RN組HOMAIR均明顯高于NC組(P<0.01),與HF組比也有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。FR組與NC組比這3項(xiàng)指標(biāo)均無明顯差異(表2)。3追生長(zhǎng)和追酶學(xué)損害的關(guān)系限制大鼠食物熱量的攝入(半自由攝食量)會(huì)導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)不良(主要是蛋白營(yíng)養(yǎng)不良和低TG血癥)及發(fā)育遲滯,若在其后給予開放自由進(jìn)食,這種營(yíng)養(yǎng)供給的劇烈變化最終導(dǎo)致追趕生長(zhǎng)的發(fā)生,雖然最終體重未能追趕上,但內(nèi)臟的脂肪的堆積卻非常迅速。在本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行之前,對(duì)追趕生長(zhǎng)的研究一直較多關(guān)注低出生體重(SGA,體重低于正常平均水平10%)個(gè)體,即使在國(guó)外,也少有文章報(bào)道出生后各種原因所致生長(zhǎng)遲緩后是否也能出現(xiàn)追趕生長(zhǎng)。追趕生長(zhǎng)是一種生理性的適應(yīng)機(jī)制,其本來目的是為了削弱生長(zhǎng)發(fā)育受阻導(dǎo)致的機(jī)體健康損害。但是,在過去的數(shù)年中,幾個(gè)大型的臨床研究結(jié)果提示,低出生體重或者幼年期的生長(zhǎng)發(fā)育遲緩者,一旦出現(xiàn)追趕生長(zhǎng),有很強(qiáng)的易患肥胖(腹型)以及易患2型糖尿病的傾向。EsterFlanders前瞻性孿生調(diào)查顯示那些SGA的成年人的皮下脂肪厚度以及腰/臀比要大于出生時(shí)體重偏高的個(gè)體。同樣,在NHANEⅢ中,SGA個(gè)體在發(fā)生追趕生長(zhǎng)后,體重不會(huì)超過正常出生體重兒,但是皮下脂肪以及臀圍卻明顯高于正常組。這說明,出現(xiàn)追趕生長(zhǎng)的低出生體重兒,脂肪組織的追趕要高于非脂肪組織。芬蘭進(jìn)行的一項(xiàng)中年人群的調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)這些增長(zhǎng)的脂肪尤以腹部脂肪為多。這和我們的研究結(jié)果也是一致的,發(fā)生追趕生長(zhǎng)的RH組和RN組,直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束,體重也未能追趕上NC組,但是RH組的內(nèi)臟脂肪/體重比卻高于NC組,甚至超過高脂喂養(yǎng)12w的HF組,RN組的內(nèi)臟脂肪/體重比雖然和NC組接近,但是該組自由進(jìn)食的時(shí)間較NC組短,說明追趕生長(zhǎng)后內(nèi)臟脂肪的堆積速度非常迅速。因此,許多學(xué)者認(rèn)為這種追趕生長(zhǎng)稱為追趕肥胖更為合適。為什么追趕生長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致肥胖的發(fā)生?1962年首次提出“節(jié)儉基因”假說,大量的研究試圖尋找出“節(jié)儉基因”,但至今未發(fā)現(xiàn)任何基因能吻合這一假說。也有研究認(rèn)為出生后早期的營(yíng)養(yǎng)不良會(huì)抑制骨骼肌的產(chǎn)熱作用,在追趕生長(zhǎng)出現(xiàn)后,肌肉對(duì)葡萄糖的利用仍處于低水平,導(dǎo)致葡萄糖大量轉(zhuǎn)移至脂肪組織,使脂肪組織迅速堆積,產(chǎn)生肥胖和胰島素抵抗。目前公認(rèn),糖負(fù)荷后的高胰島素血癥在SGA者嬰兒及兒童時(shí)期就可以出現(xiàn),晚近的研究更是證實(shí),SGA的嬰兒,一旦出現(xiàn)追趕生長(zhǎng),血中胰島素水平會(huì)急劇增高。這些發(fā)現(xiàn)和一個(gè)前瞻性智力研究一起說明,追趕生長(zhǎng)和胰島素敏感性下降,可以早在1歲的嬰兒中發(fā)現(xiàn)。高度暗示在追趕生長(zhǎng)引起的后期代謝紊亂中,胰島素抵抗是一個(gè)早期的階段。在我們的研究中,亦發(fā)現(xiàn)追趕生長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致胰島素敏感性下降。雖然在本實(shí)驗(yàn)中空腹血糖沒有受到明顯影響,但RN組和RH組FIns和HOMAIR均明顯高于NC組,RH組的這2項(xiàng)指標(biāo)更是高于HF組。雖然RN組的FIns水平與HF組比較沒有統(tǒng)計(jì)差異,但是其HOMAIR卻明顯高于HF組。說明追趕生長(zhǎng)與胰島素抵抗密切相關(guān)。肥大的內(nèi)臟脂肪細(xì)胞分泌過多的游離脂肪酸及其它脂源性細(xì)胞因子如瘦素、抵抗素、纖溶酶原激活物抑制物等,損傷組織器官,從多方面參與胰島素抵抗的發(fā)生;而胰島素抵抗和胰島素作用相對(duì)不足,會(huì)導(dǎo)致激素敏感性脂酶活性降低,影響TG水解,形成高TG血癥,并反過來促使內(nèi)臟脂肪細(xì)胞分解更多的FFA,惡性循環(huán),加重胰島素抵抗。在我們實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn),RH組和HF組TG水平高于NC組,這與這2組明顯的胰島素抵抗是一致的。但是RN組的內(nèi)臟脂肪/體重比和TG水平,均在正常范圍,與NC組接近,也出現(xiàn)了胰島素抵抗;而RH組的內(nèi)臟脂肪/體重比及TG水平與HF組接近,但胰島素抵抗程度卻能明顯高于HF組,說明內(nèi)臟脂肪堆積以及血脂的升高和追趕生長(zhǎng)后胰島素抵抗程度有一定關(guān)聯(lián),但卻不能完全解釋這一現(xiàn)象。也有觀點(diǎn)認(rèn)為,出現(xiàn)在生長(zhǎng)發(fā)育期間的食物短缺或者營(yíng)養(yǎng)不良,可能會(huì)導(dǎo)致機(jī)體某些代謝組織永久的結(jié)構(gòu)功能改變,從而影響神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的功能。本實(shí)驗(yàn)中,也發(fā)現(xiàn)限食組大鼠出現(xiàn)低蛋白血癥,可能會(huì)影響到某些參與糖代謝的組織的結(jié)構(gòu)發(fā)育,并對(duì)胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑產(chǎn)生影響,關(guān)于這一猜測(cè),需要更進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)。在本研究中,我們確認(rèn)(1)不僅是SGA個(gè)體出生后會(huì)出現(xiàn)追趕生長(zhǎng),正常