第14章 植物基因工程與作物育種

第14章轉(zhuǎn)基因技術與作物改良第1節(jié)轉(zhuǎn)基因技術的概括第2節(jié)轉(zhuǎn)基因育種的關鍵技術第3節(jié)轉(zhuǎn)基因作物的遺傳特點第4節(jié)轉(zhuǎn)基因作物的選育第5節(jié)轉(zhuǎn)基因作物的生物安全性第1節(jié)轉(zhuǎn)基因技術的概括1、轉(zhuǎn)基因的概念2、轉(zhuǎn)基因的基本流程3、轉(zhuǎn)基因的作用4、轉(zhuǎn)基因的發(fā)展趨勢1.轉(zhuǎn)基因的概念

利用分子生物學技術，把從其它生物體分離的基因或人工構建的基因，通過適當?shù)幕蜣D(zhuǎn)化方法插入到植物基因組中，得到基因表達產(chǎn)物，并能遺傳至后代。通過遺傳轉(zhuǎn)化不但可以進行種間、屬間、科間遺傳物質(zhì)交流，還可以進行高等與低等植物，甚至動物與植物間遺傳物質(zhì)交流；同時可以定向而不改變原來的優(yōu)良性狀。傳統(tǒng)育種法:轉(zhuǎn)基因途徑:相關的品種亞種種基因轉(zhuǎn)移相關的品種亞種種動物

植物

噬菌體真菌

細菌

病毒

2轉(zhuǎn)基因的基本流程轉(zhuǎn)基因的基本流程1.目的基因的獲得；2.目的基因重組質(zhì)粒的構建；3.受體材料的選擇；4.外源基因的轉(zhuǎn)化；5.轉(zhuǎn)化體的篩選和鑒定；6.轉(zhuǎn)化體的安全性評價和育種利用。3.轉(zhuǎn)基因的作用

PopulationandfoodsecurityproblemAgriculturalsustainabilityproblemEnvironmentalproblemSpecificneedsforhumanlifePopulationandfoodsecurityproblemAverageannualincreaseinyieldsofrice,wheatandmaizeindevelopingcountriesbyperiods.(ConwayandToenniessen,1999,Nature)n

AgriculturalsustainabilityproblemVega-Sa′nchezetal.,Geneticandbiotechnologicalapproachesforbiofuelcropimprovement.CurrentOpinioninBiotechnology2010,21:218–224BiofuelFertilizedtodeath,Nosengo,2003,Naturen

EnvironmentalproblemReducethecost■

SpecificneedsfordevelopingcountriesBetternutritionfoodallergyPhamaceuticalproteinandvaccine4.Tradesofplantgeneticengineering◆rapidincreasingareasTimescaleofgeneticallymodifiedcharactersincropplants◆DiversetransgenictypesParticlebombardmentOvary-driptransformationvacuuminfiltrationofthematureembryo◆Simple,high-efficientplanttransformationmethods第2節(jié)轉(zhuǎn)基因育種的關鍵技術1植物遺傳轉(zhuǎn)化的受體系統(tǒng)2植物遺傳轉(zhuǎn)化的載體系統(tǒng)植物遺傳轉(zhuǎn)化主要方法轉(zhuǎn)基因植株檢測的主要方法1

植物遺傳轉(zhuǎn)化的受體系統(tǒng)

植物轉(zhuǎn)化的目的：讓外源基因穩(wěn)定地插入植物染色體組中，并再生出完整植株。作為轉(zhuǎn)化受體應符合兩個條件：

●能夠接收外源DNA；●必須具有脫分化和再生能力。。

細胞或組織類型轉(zhuǎn)化方法直接分化系統(tǒng)(子葉和胚軸等)農(nóng)桿菌介導，基因槍等原生質(zhì)體系統(tǒng)電擊法,PEG,脂質(zhì)體,微注射等愈傷組織系統(tǒng)基因槍，超聲波等胚狀體系統(tǒng)農(nóng)桿菌介導,基因槍,超聲波等種質(zhì)系統(tǒng)（花粉、卵細胞）花粉管通道，子房注射等不同的受體系統(tǒng)及其轉(zhuǎn)化方法1.1直接分化系統(tǒng)特點

外植體細胞可越過脫分化產(chǎn)生愈傷組織階段而直接分化出不定芽獲得再生植株:

1)省略了愈傷組織誘導過程，獲得再生植株的周期短，操作簡便;

2)由于直接分化，因此體細胞無性系變異小，外源基因能穩(wěn)定遺傳;

3)由于直接分化困難，轉(zhuǎn)化頻率較低;

4)不定芽的再生常起源于多細胞，易出現(xiàn)嵌合體.1.2原生質(zhì)體系統(tǒng)特點

原生質(zhì)體：去璧后的“裸露”細胞

1）無細胞璧，通透性好，外源DNA易于導入;

2）可適用的轉(zhuǎn)化方法多;

3）培養(yǎng)形成的細胞無性系變異強烈，穩(wěn)定性差;4）培養(yǎng)技術難度大，應用有局限。GeneralschemeforAgrobacterium-mediatedtransformationofcerealplants1.3愈傷組織系統(tǒng)特點愈傷組織：外植體經(jīng)組織培養(yǎng)產(chǎn)生的脫分化細胞團.1）由脫分化的分生細胞組成，外源DNA易于導入，轉(zhuǎn)化率高;2）培養(yǎng)技術難度小，可應用于多種植物;3）可繼代擴增，獲得大量轉(zhuǎn)化植株;4）培養(yǎng)形成的再生植株無性系變異大，轉(zhuǎn)化的目的基因遺傳穩(wěn)定性差.1.4種質(zhì)系統(tǒng)特點種質(zhì)系統(tǒng)：以生殖細胞為受體進行基因轉(zhuǎn)化的系統(tǒng)。1）接受外源DNA能力強，轉(zhuǎn)化率高;2）受體為單倍體，外源基因表達充分，易選擇，加倍后可簡化和縮短育種純化過程;3）遺傳操作只能在短暫的開花期進行。1.5胚狀體系統(tǒng)特點胚狀體：經(jīng)體細胞胚發(fā)生而形成的形態(tài)結(jié)構和功能上類似于有性胚的結(jié)構，較為理想的系統(tǒng)。1）接受外源DNA能力強，轉(zhuǎn)化率高;2）胚狀體多為單細胞發(fā)生，遺傳背景一致，無性系變異小，轉(zhuǎn)化率高;3）可以制成人工種子，利于轉(zhuǎn)基因植株的推廣.2用于植物遺傳轉(zhuǎn)化的載體系統(tǒng)載體：攜帶外源基因進入受體細胞的運載工具。

DNA片段+適合的載體DNA→重組DNA→在載體DNA的運載下，高效率地進入受體細胞，并在其中進行復制。

2.1載體的基本條件

1)能獨立的自我復制，而且能帶動攜帶的外源DNA片段一起復制。

2）具有多克隆位點，即具有多個限制酶切點。

3）至少有一個遺傳標記基因。

4）易于宿主細胞收回。1.2植物轉(zhuǎn)化載體的基本結(jié)構

1）具有細菌的復制起始點;

2）原核生物中表達的選擇標記基因;

3）多克隆位點;

4）能在植物中表達的標記基因:

標記基因和報告基因

1.3農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化載體系統(tǒng)以Ti質(zhì)粒為基礎構建的載體系統(tǒng)

目的基因克隆載體:保存和克隆目的基因，通常是多拷貝的大腸桿菌質(zhì)粒。

中間載體：中間克隆載體，大腸桿菌質(zhì)粒插入T-DNA片段及目的基因、標記基因等構成。中間表達載體，含植物特異啟動子的中間載體，作為構建轉(zhuǎn)化載體的質(zhì)粒。

卸甲載體：解除武裝（切除致瘤基因）的Ti或Ri質(zhì)粒，是構建轉(zhuǎn)化載體的受體質(zhì)粒。

植物基因轉(zhuǎn)化載體：最后用于目的基因?qū)胫参锛毎妮d體，由中間表達載體和卸甲載體構建而成。分一元載體系統(tǒng)和二元載體系統(tǒng)。大腸桿菌質(zhì)粒（克隆載體）＋T-DNA片段＋目的基因＋標記基因中間克隆載體中間表達載體植物基因轉(zhuǎn)化載體（一元載體和二元載體）卸甲載體+＋植物特異啟動子Ti或Ri質(zhì)粒

●一元載體(共整合載體，intergratedvectors)這個系統(tǒng)包括兩個質(zhì)粒，一個用作克隆外源基因（中間表達載體），另一個是具有Vir區(qū)的卸甲載體，但這兩個質(zhì)粒具有一段同源序列，在農(nóng)桿菌中重組整合成一個載體。A,Co-integration/exchangesystemsB,T-DNAbinaryvectorsystems

●雙元載體(binaryvectors)：同一個農(nóng)桿菌細胞中含有兩個彼此相容的Ti質(zhì)粒。①輔助質(zhì)粒（helperplasmid）：缺失T-DNA序列的Ti質(zhì)粒，但有毒性功能的Vir區(qū)。②克隆質(zhì)粒（穿梭質(zhì)粒）：含有T-DNA序列的寄主廣泛的DNA轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒。既能在大腸桿菌中復制，又能在農(nóng)桿菌中復制。按照標準的DNA操作方法可將任何目的基因插入T-DNA區(qū)，構成克隆載體。

含有雙元載體的根癌農(nóng)桿菌細胞侵染植物時，就可將含有外源目的基因的T-DNA整合進入植物染色體中。1.4植物病毒衍生的載體系統(tǒng)3植物遺傳轉(zhuǎn)化方法3.1農(nóng)桿菌介導的基因轉(zhuǎn)移3.2基因槍轉(zhuǎn)化系統(tǒng)3.3其他基因轉(zhuǎn)化方法AgrobacteriumremainedthefavouredDNAdeliverymethodforthetransformationofplantsby57%,followedbyparticlebombardment(25%)anddirecttransferofDNAintoprotoplasts(14%).3.1、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的方法1）實現(xiàn)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的條件●植物外植體能夠產(chǎn)生乙酰丁香酮等可誘導Vir基因的活性物質(zhì)?！褶r(nóng)桿菌能夠接近具有再生能力的感受態(tài)植物細胞。TzviTzfiraandVitalyCitovsky,2002,TrendsinCellBiol.12(3),121-129CellularprocessofAgrobacterium–hostinteraction2）農(nóng)桿菌介導的主要步驟

●目的（或外源）基因克隆到Ti質(zhì)粒載體上,構成重組質(zhì)?！裰亟M質(zhì)粒轉(zhuǎn)化土壤農(nóng)桿菌●土壤農(nóng)桿菌菌株與植物組織或者是細胞共培養(yǎng)、除菌●轉(zhuǎn)化細胞的培養(yǎng)和再生●再生植株的鑒定和檢測ProductionoftransgenicplantsIsolateandclonegeneofinterestAddDNAsegmentstoinitiateorenhancegeneexpressionAddselectablemarkersIntroducegeneconstructintoplantcells(transformation)SelecttransformedcellsortissuesRegeneratewholeplants3）常用的轉(zhuǎn)化方法△葉圓片法（Horsch，1985）●用打空器取葉圓片●浸泡在農(nóng)桿菌溶液中過夜●在培養(yǎng)基上培養(yǎng)2～3天●在選擇性培養(yǎng)基上，使轉(zhuǎn)化細胞直接再生△共培養(yǎng)法步驟：●將外植體與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)24～48h●洗去農(nóng)桿菌，在含有抑菌劑的培養(yǎng)基上培養(yǎng)●選擇轉(zhuǎn)化體Agrobacterium-mediatedtransformationofsoybeancotyledonarynodesystem.△直接接種法步驟：●用農(nóng)桿菌接種離體培養(yǎng)的枝條●感染后，取瘤狀組織或毛狀根繼代培養(yǎng)●選擇轉(zhuǎn)化體

這種方法簡便、試驗周期短，因培養(yǎng)基不與農(nóng)桿菌直接接觸，故污染較小。3.2基因槍轉(zhuǎn)化系統(tǒng)

基因槍（genegunorparticlegun)最初由Sanfort等(1987)設計?；驑尫ㄊ且环N全新的基因?qū)爰夹g，它把遺傳物質(zhì)或其他物質(zhì)附著于高速微彈直接射入細胞、組織和細胞器，是目前國際上最先進的基因?qū)爰夹g?；驹恚豪没鹚幈ɑ蚱渌鼊恿铀賹薉NA溶液的金屬粒子（如鎢粒、金粒等）射入植物細胞，同時也把DNA帶入植物細胞。1）、基因槍轉(zhuǎn)化的特點▲克服了農(nóng)桿菌介導的寄主限制；▲

對靶細胞幾乎沒有要求；

▲簡化了質(zhì)粒的構建；▲簡化了轉(zhuǎn)化方法；▲

避免了農(nóng)桿菌污染造成的假陽性；▲

可以獲得持續(xù)時間較長的瞬時表達。2）、基因槍的類型▲火藥驅(qū)動的基因槍▲電驅(qū)動的基因槍▲壓縮空氣驅(qū)動的基因槍

基因槍的種類多樣，不同的受體植物、不同的組織、器官外植體材料應選用不同類型類型的基因槍。3)、基因槍轉(zhuǎn)化的主要用途（1）瞬間表達，測定外源基因結(jié)構與產(chǎn)物活性（2）介導質(zhì)粒與線粒體轉(zhuǎn)化（農(nóng)桿菌T-DNA只能定位到細胞核中）（3）農(nóng)桿菌T-DNA轉(zhuǎn)化難以成功的頑固性植物的遺傳轉(zhuǎn)化（4）多基因轉(zhuǎn)移之便利方法，已應用于代謝工程和多基因抗性的獲得3.3其他基因轉(zhuǎn)化方法

植物基因的轉(zhuǎn)移雖然可以用大腸桿菌質(zhì)粒、農(nóng)桿菌質(zhì)粒、病毒等等作為載體，但是這些方法都不同程度的存在一些限制因素，像農(nóng)桿菌的質(zhì)粒對于禾谷類單子葉植物的侵染率很低，難以在基因轉(zhuǎn)移中實際應用。轉(zhuǎn)化方法PEG法電擊法微針注射法花粉管通道法受體材料原生質(zhì)體原生質(zhì)體原生質(zhì)體卵細胞宿主范圍無無無有性繁殖植物組培條件復雜復雜復雜無嵌合體比例無無無無操作復雜性簡單復雜復雜簡單設備要求便宜昂貴昂貴便宜工作效率低低低低單子葉植物應用可行可行可行廣泛原理——在高壓脈沖條件下，細胞膜出現(xiàn)短暫的可逆性開放小孔，為外源物質(zhì)提供了通道，可以導入外源DNA分子。孔道的形成的數(shù)量和大小與電場強度有關，關系到攝入DNA的量。1)、電激法介導的基因轉(zhuǎn)化優(yōu)點：操作簡單、基因轉(zhuǎn)化效率高、特別適于瞬間表達的研究缺點：造成原生質(zhì)體的損傷，使植板效率低，且儀器也昂貴。2)、顯微注射法

該法在動物細胞的基因轉(zhuǎn)化中應用的比較成熟。它借助于顯微注射儀，將外源DNA或mRNA通過機械方法直接注射到受體細胞。用于植物基因轉(zhuǎn)化的植物樣品有游離細胞、原生質(zhì)體、分生組織和胚胎組織等多細胞結(jié)構。使用顯微注射儀把外源DNA溶液注入到子房或胚囊中,卵細胞的吸收使外源DNA進入受精的卵細胞中，從而獲得轉(zhuǎn)基因植物。胚囊、子房注射法Ovary-drip

transformationPollen-tubepathwaymethod:DNAsolutionwasappliedtothecutstyles.

Ovary-dripmethod:DNAsolutionwasappliedtotheovarieswithentirelydecapitatedstyles

●植物的胚囊結(jié)構是八核胚囊，是一個擁有較大空隙的空腔，能夠吸入一定的外源DNA溶液；●卵細胞有一側(cè)沒有細胞壁，只有一層質(zhì)膜，能夠吸入外源DNA；●正常的花粉管進入胚囊后也是在胚囊中破裂，釋放出的雄配子DNA也在胚囊中；●受精后的細胞能正常發(fā)育成胚及種子；●外源DNA溶液注入胚囊后對卵細胞造成一個較大的滲透壓，迫使外源DNA進入卵細胞；●如將外源DNA注入子房中，通過花粉管進入胚珠的通道，能夠使外源DNA從子房引入胚囊；●注入的外源DNA可以是已重組構建的帶目的基因及啟動子的DNA，因此，導入卵細胞后可以整合到核DNA中并得到表達。

優(yōu)點：（1）是一種純粹的物理方法，適用于各種植物和各種材料，無局限性；（2）整個操作過程對受體細胞無藥物等毒害，有利于轉(zhuǎn)化細胞的生長發(fā)育；（3）轉(zhuǎn)化細胞的培養(yǎng)過程無需特殊的選擇系統(tǒng)。缺點：

需要精細操作的技術以及低密度培養(yǎng)的基礎，注射速度慢,效率低。3）花粉管通道法原理：將外源DNA片斷在自花授粉后的特定時期注入柱頭或花柱，外源DNA沿花粉管通道或傳遞組織通過珠心進入胚囊，轉(zhuǎn)化不具備正常細胞壁的卵、合子或早期胚胎細胞。這一技術可用于任何開花植物。特點：參與了被轉(zhuǎn)化植物的生殖過程，直接操作于整體植株，避免了傳統(tǒng)的基因槍法和土壤農(nóng)桿菌法轉(zhuǎn)化要求的組織培養(yǎng)技術，轉(zhuǎn)化方法簡單，易操作，但雙子葉植物都可應用，育種時間較短，具有很強的適用性。4）浸泡法介導基因轉(zhuǎn)化

植物細胞能夠不斷地與周圍環(huán)境進行物質(zhì)運輸，吸收水分和有機物質(zhì)，特別是種子萌發(fā)吸漲過程中吸收大量水分。外源DNA能夠隨著植物細胞的物質(zhì)運輸一起進入受體細胞。原理：供試外植體（如種子、胚、胚珠、子房、花粉粒、幼穗懸浮細胞培養(yǎng)物等）直接浸泡在外源DNA溶液中，利用滲透作用把外源DNA基因?qū)胧荏w細胞并穩(wěn)定地表達。轉(zhuǎn)基因植株檢測的主要方法3.1.

1

PCR檢測初步確定外源基因是否已整合到受體細胞的染色體。以被檢組織DNA為模板，以外源基因序列設計引物進行擴增，然后用瓊脂糖凝膠電泳分離擴增產(chǎn)物。若被檢植株基因組DNA中含有外源基因，則可得到特異性擴增帶。3.1外源基因整合的檢測ArneHolst-Jensenetal.PCRtechnologyforscreeningandquantificationofgeneticallymodifiedorganisms(GMOs).AnalBioanalChem(2003)375:985–993AschematicrepresentationofatypicalgeneconstructandfourtypesofPCR-basedassaysshowingincreasingspecificity(fromtoptobottom).HhostgenomicDNA,Ppromoterelement,Eenhancerel