第7章微生物遺傳

第七章微生物的遺傳與變異第一節(jié)基本概念1、遺傳（Heredity）生物體上一代將自己的一整套遺傳因子傳給下一代，從而保證子代和親代相似的行為和功能，具極其穩(wěn)定的特性。2、遺傳因子（Heredityfactor）即基因，能表達和產(chǎn)生基因產(chǎn)物的DNA序列，對少數(shù)RNA病毒為RNA序列。3、遺傳型（基因型，Genotype）一個生物個體所具有的一整套基因。1）結(jié)構(gòu)基因：關(guān)于蛋白質(zhì)的氨基酸組成信息；2）調(diào)節(jié)基因：基因的選擇性表達信息。4、表型（Phenotype）指某一生物體所據(jù)有的一切外表特征及內(nèi)在特征的總和，是遺傳型在合適環(huán)境下的具體表現(xiàn)，是一種現(xiàn)實性（可見）。遺傳型＋環(huán)境條件代謝發(fā)育表型5、變異（Variation）指生物體在某種外因或內(nèi)因的作用下所引起的遺傳物質(zhì)在結(jié)構(gòu)和數(shù)量上的改變，即遺傳型的改變。1）染色體數(shù)目改變n→2n（同源多倍體）2）染色體結(jié)構(gòu)改變（染色體畸變）①缺失②添加③倒位④易位3）基因突變（點突變）染色體堿基發(fā)生改變ⅰ)堿基置換a轉(zhuǎn)換b巔換ⅱ)移碼突變a缺失（1~2個）b添加（1~2個）6、飾變（Modification）指不涉及遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)改變而只發(fā)生在轉(zhuǎn)錄、翻譯水平上的表型變化。7、飾變與變異的比較①幾率：飾變高，變異低；②性狀改變幅度：飾變?。蛔儺惔?；③可遺傳性：飾變不可；變異可；④回復性：飾變高，變異低。各種基因突變的堿基變化示意圖一三個經(jīng)典實驗第二節(jié)遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ)（一）肺炎鏈球菌轉(zhuǎn)化試驗1、Griffith的轉(zhuǎn)化試驗（1928年）分別用降解DNA、RNA、蛋白質(zhì)的酶作用于有毒的S型菌細胞抽提物只有DNA被酶降解破壞的抽提物無轉(zhuǎn)化活性DNA是轉(zhuǎn)化所必需的轉(zhuǎn)化因子上圖結(jié)論：

只有DNA被酶降解破壞的抽提物無轉(zhuǎn)化活性→

DNA是轉(zhuǎn)化所必需的轉(zhuǎn)化因子。這些實驗說明，加熱殺死的S型細菌，在其細胞內(nèi)可能存在一種轉(zhuǎn)化物質(zhì)，它能通過某種方式進入R型細胞，并使R型細胞獲得穩(wěn)定的遺傳性狀。2、Avery的證實實驗（1944年）同時，還進行了體內(nèi)實驗，S-DNA加R型菌注射小鼠，結(jié)果小鼠死。證實：細菌的轉(zhuǎn)化因子是DNA。1、用含32P-DNA的phage侵染細菌（二）T2噬菌體感染實驗（1952年）2、用含35S-Pr的phage侵染細菌證明：DNA包含了合成Pr外殼的遺傳信息。后用純DNA感染細菌的轉(zhuǎn)化試驗證明DNA是phage遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ)。（三）TMV的重建實驗結(jié)論：上面的三個實驗，得出一個共同的結(jié)論：只有核酸才是負荷遺傳信息的物質(zhì)基礎(chǔ)。在RNA病毒中，遺傳物質(zhì)也是核酸，只不過是RNA。二遺傳物質(zhì)在微生物細胞中的存在方式1、細胞水平1）原核微生物①細菌：球菌1個核區(qū)，桿菌2個核區(qū)；②放線菌：菌絲細胞多個核區(qū)，孢子單個核區(qū)。2）真核微生物①酵母菌：單核；②真菌：菌絲多核，孢子單核。2、細胞核水平1）原核微生物①無核膜的裸露分子，一般不與蛋白質(zhì)結(jié)合；②質(zhì)粒。2）真核微生物①有核膜，DNA與組蛋白結(jié)合形成真正的染色體；②葉綠體、線粒體、中心體。3、染色體水平1）原核微生物2）真核微生物單倍體；1個染色體大多單倍體，少數(shù)有多倍體；多個染色體4、核酸水平1）原核微生物DNA含量占80％，RNA＋Pr占20％。2）真核微生物DNA含量占27％，RNA占6％，Pr占66％。5、基因水平1）原核微生物由操縱子和調(diào)節(jié)基因組成調(diào)控系統(tǒng)2）真核微生物①存在內(nèi)元（內(nèi)含子）、外元（外顯子）；②有細胞器基因。6、密碼子水平7、核苷酸水平三原核生物的質(zhì)粒是細胞質(zhì)中獨立于核基因組外，具有獨立復制的小型共價閉合環(huán)狀DNA（CCCDNA）。細菌質(zhì)粒的3種不同構(gòu)型椰毒假單胞菌（Pseudomonascocovenenans）的擬核染色體（A，B）和質(zhì)粒（B，箭頭所指）

可分：

高考倍數(shù)質(zhì)粒(highcopynumber)：每個細胞中有10～100個，與染色體的復制不同步——松弛型質(zhì)粒(relaxedplasmid)。

低考倍數(shù)質(zhì)粒(lowcopynumber)：每個細胞中有1～2個，與染色體的復制同步——嚴緊型質(zhì)粒(stringentplasmid)。窄宿主范圍質(zhì)粒(narrowhostrangeplasmid)：只能在一種特定的宿主細胞中復制。

廣宿主范圍質(zhì)粒(broadhostrangeplasmid)：可以在多種宿主細胞中復制。

1、F質(zhì)粒（致育因子Fertilityfactor，

F因子，性因子）

是決定性別并有轉(zhuǎn)移能力的質(zhì)粒，約100kb。

F因子能以游離狀態(tài)(F+)和以與染色體相結(jié)合的狀態(tài)(Hfr)存在于細胞中，所以又稱之為附加體(episome)。攜帶F質(zhì)粒的菌株稱為F+菌株（相當于雄性），無F質(zhì)粒的菌株稱為F-菌株（相當于雌性）。2、抗藥性質(zhì)粒（Resistantplasmid，抗性因子Resistancefactor，R因子）

攜帶有分解某種抗生素或藥物酶系的基因的質(zhì)粒，可以賦予宿主細胞耐或抗或分解或失活某種抗生素或藥物的性能。

包括抗藥性和抗重金屬二大類。抗性質(zhì)粒在細菌間的傳遞是細菌產(chǎn)生抗藥性的重要原因之一。3、大腸桿菌素質(zhì)粒（Colplasmid，Col因子）

攜帶有產(chǎn)生大腸桿菌素（colicin）酶系基因的質(zhì)粒，賦予大腸桿菌產(chǎn)生大腸桿菌素的能力。

細菌素一般根據(jù)產(chǎn)生菌的種類進行命名：由G+細菌產(chǎn)生的細菌素或與細菌素類似的因子與colicins有所不同，但通常也是由質(zhì)?；蚓幋a，有些甚至有商業(yè)價值，例如一種乳酸細菌產(chǎn)生的細菌素NisinA能強烈抑制某些G+細菌的生長，而被用于食品工業(yè)的保藏。4、誘癌（致瘤性）質(zhì)粒

(Tumorinducingplasmid)，毒性質(zhì)粒（Virulenceplasmid）

許多致病菌的致病性是由其所攜帶的質(zhì)粒引起的，這些質(zhì)粒具有編碼毒素的基因，其產(chǎn)物對宿主（動物、植物）造成傷害。

根癌土壤桿菌所含Ti質(zhì)粒是引起雙子葉植物冠癭瘤的致病因子1）Ti質(zhì)粒

蘇云金桿菌含有編碼δ內(nèi)毒素(伴孢晶體中)的質(zhì)粒2）Sym質(zhì)粒

是某些快生型根瘤菌細胞中存在的攜帶有某種可以識別、侵染相應豆科植物根系與之形成共生根瘤的基因的質(zhì)粒。

5、降解質(zhì)粒攜帶有分解或降解某種芳香族化合物為簡單化合物或無機物的酶系基因的質(zhì)粒，賦予宿主細胞降解某種芳香族化合物的能力。

將復雜的有機化合物降解成能被其作為碳源和能源利用的簡單形式，環(huán)境保護方面具有重要的意義。一

基因突變（Genemutatiom）

第三節(jié)

基因突變和誘變育種

是變異的一類，泛指細胞內(nèi)遺傳物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)或數(shù)量突然發(fā)生的可遺傳的變化可自發(fā)或誘發(fā)產(chǎn)生。

自發(fā)突變：環(huán)境因素的影響，DNA復制過程的偶然錯誤等而導致，一般頻率較低，通常為10-6-10-9。

誘變：某些物理、化學因素對生物體的DNA進行直接作用，突變以較高的頻率產(chǎn)生。

突變率（Mutationrate）:每一細胞在每一世代中發(fā)生某一性狀突變的幾率。

突變率也可用每一單位群體在每一世代中產(chǎn)生突變株的數(shù)目來表示。eg:突變率為10-8，即指該細胞在一億次分裂中會發(fā)生一次突變。

eg:突變率為10-8，一個含108個細胞的群體分裂成2×108時平均發(fā)生一次突變的突變幾率。

1、營養(yǎng)缺陷型（auxotroph）一種缺乏合成其生存所必須的營養(yǎng)物的突變型，只有從周圍環(huán)境或培養(yǎng)基中獲得這些營養(yǎng)或其前體物才能生長。（一）可選擇突變株

1）特點

負選擇標記

不能合成某種或幾種生長因子，在選擇培養(yǎng)基（一般為基本培養(yǎng)基）上不生長。

2）表示方法

①

基因型：所需營養(yǎng)物的前三個英文小寫斜體字母表示；

②表型：同上，但第一個字母大寫，且不用斜體。

在具體使用時多用hisC-和hisC+，分別表示缺陷型和野生型

影印平板（Replicaplating）法是Lederberg夫婦在1952年建立2、抗藥性突變型（resistantmutant）1）特點2）表示方法所抗藥物的前三個小寫斜體英文字母加上“r”表示指野生型菌株因發(fā)生基因突變后，而產(chǎn)生對某種化學藥物或致死物理因子的抗性變異類型。

正選擇標記突變株可直接從抗性平板上獲得-----在加有相應抗生素的平板上，只有抗性突變能生長。所以很容易分離得到。3、條件致死突變型（conditionallethalmutant）指突變后，在某一條件下可正常生長、繁殖并呈現(xiàn)固有的表型，而在另一種條件下卻無法生長、繁殖的突變類型。

特點：負選擇標記這類突變型常被用來分離生長繁殖必需的突變基因（二）不可選擇性突變型

1、形態(tài)突變型（Morphologicalmutant）

指由突變引起的細胞個體或菌落形態(tài)的變異。

特點：非選擇性突變

突變株和野生型菌株均可生長，但可從形態(tài)特征上進行區(qū)分。

eg:有鞭毛→無鞭毛，細胞壁脫落或缺失等。

產(chǎn)蛋白酶缺陷突變株的篩選菌落顏色變化β半乳糖苷酶基因的插入失活，使重組子菌落為白色而與蘭色的非重組子分開。2、抗原突變型（Antigenicmutant）

指由于基因突變引起的細胞抗原結(jié)構(gòu)發(fā)生改變的突變類型。

特點：非選擇性突變

3、產(chǎn)量突變型（Metabolitequantitativemutant）

指引基因突變而產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物產(chǎn)量明顯有別于原始菌株的突變類型。

特點：非選擇性突變

二基因突變的特點1、不對應性指突變的發(fā)生與環(huán)境因子（如，物理、化學、生物等因子）沒有對應性?；蛲蛔兊男螤钆c引起突變的原因無直接的對應關(guān)系。2、自發(fā)性各種性狀的突變，可以在沒有人為誘變因素下自發(fā)發(fā)生。

1）變量實驗（fluctuationanalysis）SalvadorLuriaandMaxDelbruck（1943），1969獲諾貝爾生理和醫(yī)學獎

SalvadorLuriaMaxDelbruck2）Newcombe的涂布實驗（1949）

3）影印實驗（replicaplating）J．Lederberg1958年獲諾貝爾生理和醫(yī)學獎。

JoshuaLederberg3、稀有性自發(fā)突變的頻率是較低和穩(wěn)定的，一般在10-6~10-9間。

4、獨立性某一基因的突變既不提高，也不降低其它任何基因的突變。彼此獨立，互不干擾。5、誘變性通過誘變劑的作用，可提高自發(fā)突變的頻率，一般可提高10~105

倍。不論是自發(fā)突變或誘變突變得到的突變型，它們間并無本質(zhì)上的差別，誘變劑僅起到提高突變率的作用。

6、穩(wěn)定性7、可逆性三基因突變的機制

（一）誘變

1、堿基置換

1）堿基類似物

間接引起

e.g.:5-溴尿嘧啶（5-Bu）

2）亞硝酸

直接引起

氧化脫氨基作用，使C→U、A→H（次黃嘌呤）、G→X（黃嘌呤）。

3）羥胺（NH4OH）

4）烷化劑（如硫酸二乙酯C2H5O-SO2-OC2H5）不可逆改變

2、移碼突變（Frame(Phase)-shiftmutation）

指誘變劑使DNA分子中的一個或幾個核苷酸的增添或缺失，從而使該部位后面的全部遺傳密碼發(fā)生轉(zhuǎn)錄和翻譯錯誤的突變。

誘變劑（嵌入劑）：

①

吖啶類染料：吖啶橙、吖啶黃、溴化乙錠（EB）；

②

ICR類：烷化劑與吖啶類結(jié)合。

若干誘變劑的作用機制及誘變功能3、染色體畸變（

chromosomalaberration）

某些因子如

X射線等的輻射和烷化劑、亞硝酸等，引起DNA的大損傷，即染色體畸變，不僅可發(fā)生染色體拷貝數(shù)的變化，而且更重要的是導致染色體結(jié)構(gòu)上的缺失、重復、插入、易位、倒位等事件。

1）X射線

①

DNA骨架斷裂；

②

TT同鏈二聚體；

③

原菌體中水與氧結(jié)合成H2O2；

④

刺激細胞產(chǎn)生堿基類似物→引起誘變。

2）轉(zhuǎn)座因子

是生物體自身帶有的可跳動的DNA序列，可從一個染色體或質(zhì)粒跳到另一染色體或質(zhì)粒，甚至從一個細胞到另一細胞。

1940年McClintock在研究玉米粒斑點變異的遺傳研究時發(fā)現(xiàn)。

①插入序列（InsertionSequences，IS）剪貼式轉(zhuǎn)座②轉(zhuǎn)座子（Transposons，Tn）

是能夠插入染色體或質(zhì)粒不同位點的一段

DNA序列，大小2～25kb，具有轉(zhuǎn)座功能。能在染色體上和質(zhì)粒的許多位點上插入并改換位點，因此也稱跳躍基因（jumpinggenes），0.7~1.7kb。

復制轉(zhuǎn)座

轉(zhuǎn)座子兩末端的DNA堿基序列為反向重復序列。轉(zhuǎn)座子上攜帶有編碼某些細菌表型特征的基因，如抗卡那霉素和新霉素的基因，且本身也可自我復制。

a復合型Tn（含IS）：中間為抗藥基因

bTn3族（不含IS）：中間為轉(zhuǎn)座酶基因和抗藥基因，兩端反向重復。

③

轉(zhuǎn)座（誘變）噬菌體

Mu噬菌體：37kb，有反向重復，可隨意插到宿主DNA任何位置，引起基因突變

（二）自發(fā)突變

1、背景輻射和環(huán)境誘變

2、自身有害代謝物誘變

3、DNA復制過程中堿基錯配

自發(fā)脫氨C→U，互變異構(gòu)。

四

誘變育種

1、誘變育種基本環(huán)節(jié)

2、誘變育種中考慮的幾個原則

1）選擇簡便而高效的誘變劑

①

紫外線20s～10min；

②

NTG（N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍）。

2）處理單細胞懸液

①

使誘變劑與細胞充分接觸；

②

避免長出不純菌落，盡量選單核細胞。

表型延遲：這種基因型雖已突變，但表型卻要經(jīng)染色體復制、分離和細胞分裂后才表現(xiàn)出來的現(xiàn)象。

球菌選指數(shù)期營養(yǎng)細胞，桿菌選芽胞，酵母菌選指數(shù)期營養(yǎng)細胞，放線菌和真菌選孢子。

3）選擇合適的誘變劑量

4）充分利用復合處理的協(xié)同效應

5）利用和創(chuàng)造形態(tài)、生理與產(chǎn)量間的相關(guān)指標

6）其它（見書）

3、營養(yǎng)缺陷型的篩選

［－］基本培養(yǎng)基：僅能滿足某微生物野生型菌株生長需要的最低成分的組合培養(yǎng)基。

［＋］完全培養(yǎng)基：能滿足某微生物的全部的營養(yǎng)缺陷型生長的天然的或半組合培養(yǎng)基。

［A］或［B］補充培養(yǎng)基：僅能滿足某一微生物的某一營養(yǎng)缺陷型生長的組合或半組合培養(yǎng)基。

有關(guān)的三種培養(yǎng)基

有關(guān)的三類遺傳型

野生型：指從自然界中分離到的未發(fā)生營養(yǎng)缺陷型突變的原始菌株，可在上三種培養(yǎng)基中生長。

營養(yǎng)缺陷型：野生型菌株經(jīng)誘變后由于喪失了某種酶的合成能力而只能在加有該酶合成產(chǎn)物的培養(yǎng)基上生長。

原養(yǎng)型：營養(yǎng)缺陷型菌株經(jīng)回復突變或基因重組后產(chǎn)生的在營養(yǎng)要求上和野生型相同的菌株。

1、誘變劑處理

2、淘汰野生型

1）抗生素法

①

青霉素法

適用于細菌，殺死正常生長的野生型（抑制細胞壁合成），濃縮處于休止的營養(yǎng)缺陷型

②

制霉菌素法

適用于酵母菌、霉菌、真菌，與細胞壁上的甾醇作用，從而使細胞膜損傷（只作用于生長著的細胞），濃縮缺陷型。

2）菌絲過濾法

適用于放線菌、霉菌，將野生型和缺陷型菌株的孢子接種于［－］上，野生型孢子萌發(fā)成菌絲，過濾，數(shù)次后濃縮缺陷型。

3、檢出缺陷型

1）影印培養(yǎng)

2）夾層培養(yǎng)

3）限量補充法

4）逐個檢出法

4、鑒定缺陷型

生長普法：指在混有供試菌的平板表面點加微量營養(yǎng)物，視其營養(yǎng)物周圍有否長菌來確定該供試菌的營養(yǎng)要求的一種快速直觀的方法。

1）用無菌水洗滌離心營養(yǎng)缺陷型，除去培養(yǎng)基，配成107～108個/ml濃度的懸液；

2）取0.1ml與［—］培養(yǎng)基搖勻后注入培養(yǎng)皿，凝固干燥后，在皿背面劃幾個區(qū)域；

3）在培養(yǎng)皿中按區(qū)加營養(yǎng)粉末；

4）經(jīng)培養(yǎng)后，如發(fā)現(xiàn)某一營養(yǎng)物周圍有生長圈，就說明此菌就是該營養(yǎng)物的營養(yǎng)缺陷型突變株。

第四節(jié)

基因重組和雜交育種

一

基因重組是雜交育種的理論基礎(chǔ)

1、基因重組（Generecombination）

把兩個不同形狀個體內(nèi)的遺傳基因轉(zhuǎn)移在一起，重新組合形成新的遺傳型個體的方式。

2、方式

1）高等動植物：只有通過有性生殖；2）真菌：

有性生殖、準性生殖；

3）細菌：

轉(zhuǎn)化、接合、轉(zhuǎn)導、原生質(zhì)體融合；

4）人工技術(shù)：

基因工程。

二

原核生物的基因重組

（一）轉(zhuǎn)化（Transformation）

受體菌直接吸收了來自供體菌的DNA片段，通過交換把它整合到自己的基因組中，從而獲得部分新的遺傳性狀的現(xiàn)象。

感受態(tài)細胞（competentcell）：具有攝取外源DNA能力的細胞。

自然感受態(tài)：細胞在一定生長階段出現(xiàn)的生理特性，受細菌自身的基因控制。

人工感受態(tài)：通過人為誘導的方法，使細胞具有攝取DNA的能力，或人為地將DNA導入細胞內(nèi)。

1、自然遺傳轉(zhuǎn)化（Naturalgenetictransformation）

1）進行自然轉(zhuǎn)化，需要二方面必要的條件

①

建立了感受態(tài)的受體細胞；

②

外源游離DNA分子。

2）轉(zhuǎn)化過程

3）特點

①

轉(zhuǎn)化發(fā)生在完整DNA雙鏈分子和一個ssDNA片段之間；

②

不接觸，不需要活的DNA供體細胞；

③

轉(zhuǎn)化是否成功及轉(zhuǎn)化效率的高低主要取決于轉(zhuǎn)化（DNA）供體菌株和轉(zhuǎn)化受體菌株之間的親源關(guān)系；

④

通常情況下質(zhì)粒的自然轉(zhuǎn)化效率要低得多。

2、人工轉(zhuǎn)化（Artificialtransformation）

在自然轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)上發(fā)展和建立的一項細菌基因重組手段，是基因工程的奠基石和基礎(chǔ)技術(shù)。

常用的人工轉(zhuǎn)化手段：用CaCl2處理細胞，電穿孔等。

3、轉(zhuǎn)染(Transfection)把噬菌體或其他病毒的DNA/RNA抽提出來，讓它去感染感受態(tài)的宿主細胞，并進而產(chǎn)生正常噬菌體或病毒后代的現(xiàn)象。

與轉(zhuǎn)化的不同：

是病毒或噬菌體，并非遺傳的供體菌；

中間也不發(fā)生任何遺傳因子的交換或整合；

最后也不產(chǎn)生具有雜種性質(zhì)的轉(zhuǎn)化子。（二）轉(zhuǎn)導（Transduction）

通過缺陷型噬菌體的媒介，把供體細胞的DNA

片斷攜帶到受體細胞中，通過交換整合使后者獲得前者部分遺傳性狀的現(xiàn)象。

1、普遍性轉(zhuǎn)導（Generalizedtransduction）

轉(zhuǎn)導噬菌體：能將一個細菌宿主的部分染色體或質(zhì)粒DNA帶到另一個細菌的噬菌體。

普遍性轉(zhuǎn)導三種后果流產(chǎn)轉(zhuǎn)導完全轉(zhuǎn)導外源DNA被降解，轉(zhuǎn)導失敗1）完全普遍轉(zhuǎn)導（Completetransduction）

2)流產(chǎn)轉(zhuǎn)導（Abortivetransduction）

2、局限性轉(zhuǎn)導（Specialized（Restricted）transduction）

通過某些部分缺陷的溫和噬菌體把供體菌的少數(shù)特定基因轉(zhuǎn)移到受體菌中，并與后者的基因組整合、重組形成轉(zhuǎn)導子的現(xiàn)象。

1）低頻轉(zhuǎn)導

用不正常切離（10-4～10-6）形成的λdgal或λdbio感染受體菌（gal－或bio－），整合后形成能穩(wěn)定遺傳的局限轉(zhuǎn)導子。

2）高頻轉(zhuǎn)導

缺陷噬菌體（λdgal）和正常噬菌體（λE）同時感染受體菌，形成雙重溶源菌，被誘導正常切離，形成50％λdgal和50％λE