原生質(zhì)體融合(實(shí)驗(yàn)報(bào)告)

PAGE1-酵母原生質(zhì)體融合××××××××××酵母有發(fā)酵工業(yè)的靈魂之稱，其發(fā)酵性能的好壞直接影響發(fā)酵產(chǎn)品的質(zhì)量，同時(shí)也決定著發(fā)酵工藝流程和運(yùn)轉(zhuǎn)周期及運(yùn)轉(zhuǎn)費(fèi)用[1]。因此，選育優(yōu)良的酵母菌種在發(fā)酵工業(yè)中具有重要的意義[2]。對(duì)釀酒酵母的選育始終是釀酒工作者所要從事的重要工作之一。好的釀酒酵母能夠提高酒的質(zhì)量和產(chǎn)量，賦予酒良好的風(fēng)味；能夠簡(jiǎn)化工藝流程，減少設(shè)備投資；能夠縮短發(fā)酵周期，降低運(yùn)轉(zhuǎn)費(fèi)。原生質(zhì)體融合育種(protoplastfusion)是20世紀(jì)60年代發(fā)展起來的基因重組技術(shù)。通過兩個(gè)遺傳性狀不同的親株原生質(zhì)體融合從而達(dá)到雜交目的。1960年法國(guó)的Barsi研究小組在培養(yǎng)兩種不同動(dòng)物細(xì)胞混合時(shí)發(fā)現(xiàn)了自發(fā)融合現(xiàn)象，同時(shí)日本的Dkada發(fā)現(xiàn)仙臺(tái)病毒可誘發(fā)內(nèi)艾氏腹水病細(xì)胞彼此融合，從而開始了細(xì)胞融合的探索。國(guó)內(nèi)外對(duì)原生質(zhì)體融合技術(shù)的研究都比較成熟,一般認(rèn)為酵母菌原生質(zhì)體融合技術(shù)的關(guān)鍵點(diǎn)有原生質(zhì)體的制備和再生、原生質(zhì)體的融合以及融合子的篩選等。傳統(tǒng)的對(duì)釀酒酵母的選育方法主要有自然分離、連續(xù)培養(yǎng)和誘變育種[3]。近年來重組技術(shù)，基因工程和原生質(zhì)體融合技術(shù)迅速發(fā)展，得到了廣泛應(yīng)用。兩個(gè)或兩個(gè)以上的細(xì)胞經(jīng)過自然的或者人為的作用合并成為一個(gè)細(xì)胞叫融合細(xì)胞，這個(gè)過程就稱為細(xì)胞融合過程。用微生物作材料進(jìn)行細(xì)胞融合，必須消除細(xì)胞壁和細(xì)胞膜。通常采用酶解作用破除細(xì)胞壁，采用聚乙二醇促使細(xì)胞膜融合。細(xì)胞融合之后，還經(jīng)過細(xì)胞質(zhì)融合，細(xì)胞核重組，細(xì)胞壁再生等一系列過程才能形成具有生活能力的新菌株。融合后的細(xì)胞有兩種可能：一是染色體DNA不發(fā)生重組，兩種細(xì)胞的染色體共存于一個(gè)細(xì)胞內(nèi)，形成異核體，這是不穩(wěn)定的融合。另一類是兩親本細(xì)胞核染色體DNA真正發(fā)生重組。通過連續(xù)傳代分離純化可以區(qū)別這兩類融合。應(yīng)該指出，即便是真正的重組融合子，在傳代中也有可能發(fā)生分離，產(chǎn)生回復(fù)或新的遺傳重組體。因此，必須經(jīng)過多次分離純化才能夠獲得穩(wěn)定的融合子。本實(shí)驗(yàn)將通過釀酒酵母2.339與釀酒酵母2.70的融合，以期獲得具有更高發(fā)酵效率的釀酒酵母新品種并應(yīng)用于制酒工業(yè)，在節(jié)省釀酒糧食的投入量前提下提高發(fā)酵產(chǎn)量。以期獲得更好的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。材料與方法1.1材料釀酒酵母2.339；釀酒酵母2.701.2培養(yǎng)基和試劑1.馬鈴薯培養(yǎng)基：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，水1000ml.2.YEPD培養(yǎng)基：酵母粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，蒸餾水1000g，PH6.03.YEPD高滲培養(yǎng)基：在YEPD培養(yǎng)基中加入0.6mol/L，3%瓊脂。4.YNB高滲基本培養(yǎng)基：YNB基本培養(yǎng)基中0.6mol/LNaCl5.生理鹽水（0.85%）6.0.6mol/LNaCl7.無(wú)菌水8.其它化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。1.3實(shí)驗(yàn)用具試管、三角瓶、搖床、恒溫培養(yǎng)箱、恒溫水浴鍋、離心機(jī)、接種環(huán)、移液管、酒精燈、分光光度計(jì)1.4方法1.4.1原生質(zhì)體的制備①收集菌體從斜面上取兩親本菌株各一環(huán)酵母菌分別接種于5ml含有YEPD培養(yǎng)基的試管中，25℃靜置培養(yǎng)24后，0.3-0.5ml，轉(zhuǎn)接至裝有50新鮮YEPD培養(yǎng)基的250三角瓶中，搖床25℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)早期（14-16h），細(xì)胞數(shù)達(dá)107-108/mL。離心（3000r/min，5min）收集菌體。②菌體的預(yù)處理菌體用生理鹽水洗兩次（3000r/min，5min），去上清液后，于離心管中加入預(yù)處理液（其用量約為每克濕重菌體用4mL處理液），25℃，30min，離心3000r/min），5min，取沉淀物。酶液處理去壁于上述離心管中加入新鮮配制的酶液5mL（酶液用量約為1%-2%），輕輕搖動(dòng)，懸浮細(xì)胞，然后于30℃搖床輕輕震蕩培養(yǎng)50min，每隔20min取樣于相差顯微鏡下觀察，繪圖并計(jì)數(shù)原生質(zhì)體的形成率（按下列公式計(jì)算）。待90%以上細(xì)胞都形成原生質(zhì)體后，離心去除酶液，并用0.6mol/LNaCl洗滌1次，用10mL0.6mol/LNaCl將原生質(zhì)體制成懸液，備用。原生質(zhì)體形成率=原生質(zhì)體數(shù)/（原生質(zhì)體數(shù)+完整細(xì)胞數(shù)）×100%1.4.2原生質(zhì)體的融合①加入助溶劑將雙親原生質(zhì)體懸液（5×107-10×107個(gè)/mL）各3mL混合于8ml的離心管，離心（3000r/min，10min）棄上清后，加入3mL助融劑，輕輕震蕩，懸浮原生質(zhì)體并置25℃恒溫水浴保溫20min。每隔3-4min輕輕搖動(dòng)一次，使助溶劑與原生質(zhì)體充分接觸，然后立即加入8mL高滲YEPD培養(yǎng)基，離心（6000r/min，10min），棄上清液可獲得融合沉淀物（即原生質(zhì)體融合物）。②稀釋及涂布用0.6mol/LNaCl懸浮以上獲得的原生質(zhì)體融合物，并進(jìn)行稀釋至10-3，分別從10-2、10-3中取0.1mL，涂于YNB基本培養(yǎng)基平板上。③選擇融合子及計(jì)算融合頻率將以上培養(yǎng)物于25℃培養(yǎng)2d，從長(zhǎng)出的菌落中選出融合子。另取等量稀釋液用相同方法于再生完全培養(yǎng)基（YEPD高滲培養(yǎng)基）中培養(yǎng)后，并計(jì)算菌落數(shù)。融合頻率=（融合子數(shù)×稀釋倍數(shù)）/再生完全培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的總菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)1.4.3原生質(zhì)體的再生將雙親原生質(zhì)體懸液用0.6mol/LNaCl稀釋至10-5，取0.2mL涂布于高滲YEPD培養(yǎng)基。對(duì)照用無(wú)菌水稀釋原生質(zhì)體，均勻涂布于YEPD培養(yǎng)基。25℃培養(yǎng)48h，分別記錄長(zhǎng)出的菌落數(shù)，計(jì)算原生質(zhì)體的再生率。原生質(zhì)體的再生率=（高滲YEPD長(zhǎng)出的菌落數(shù)-YEPD長(zhǎng)出的菌落數(shù)）/顯微鏡計(jì)數(shù)的原生質(zhì)體數(shù)結(jié)果與分析2.1原生質(zhì)體形成率用新鮮配制的去壁酶液5ml，輕輕搖動(dòng)，懸浮細(xì)胞，然后于30℃搖床輕輕震蕩培養(yǎng)50min，計(jì)數(shù)原生質(zhì)體的形成率：原生質(zhì)體形成率=原生質(zhì)體數(shù)/（原生質(zhì)體數(shù)+完整細(xì)胞數(shù)）×100%結(jié)果如表1所示。2.339和2.70兩種菌株的原生質(zhì)體的形成率分別為77.68%和96.51%，說明兩種菌株的原生質(zhì)體形成率相差不大。說明酶水解去壁取得了良好的效果。表1原生質(zhì)體形成率結(jié)果類別數(shù)目原生質(zhì)體數(shù)完整細(xì)胞數(shù)原生質(zhì)體形成率2.3391.165×1099.05×10877.68%2.71.245×1091.29×10996.51%2.2原生質(zhì)體再生將雙親原生質(zhì)體懸液用0.6mol/LNaCl稀釋至10-5，取稀釋液涂布于高滲YEPD培養(yǎng)基。對(duì)照用無(wú)菌水稀釋原生質(zhì)體，均勻涂布于YEPD培養(yǎng)基。25℃培養(yǎng)48h，分別記錄長(zhǎng)出的菌落數(shù)，計(jì)算原生質(zhì)體的再生率：原生質(zhì)體的再生率=[（高滲YEPD長(zhǎng)出的菌落數(shù)-YEPD長(zhǎng)出的菌落數(shù)）/顯微鏡計(jì)數(shù)的原生質(zhì)體數(shù)]×100%結(jié)果如表2所示。2.339由于菌株在平板上長(zhǎng)得非常密集導(dǎo)致無(wú)法計(jì)數(shù)，使原生質(zhì)體再生率無(wú)法計(jì)算。2.7菌株原生質(zhì)體的再生率為75.2%，說明2.339菌株的原生質(zhì)體再生率要更優(yōu)于2.70菌株。表2原生質(zhì)體的再生結(jié)果表釀酒酵母菌株YEPD長(zhǎng)出的平均菌落數(shù)高滲YEPD長(zhǎng)出的平均菌落數(shù)顯微鏡計(jì)數(shù)的原生質(zhì)體數(shù)原生質(zhì)體的再生率2.339無(wú)數(shù)44801.165×109無(wú)法計(jì)算2.70124218121.245×10945.78×10-62.3原生質(zhì)體融合頻率將雙親原生質(zhì)體懸液混合于離心管，離心棄上清后，加入3mL助融劑，輕輕震蕩，懸浮原生質(zhì)體并置25℃恒溫水浴保溫20min。每隔3-4min輕輕搖動(dòng)一次，然后立即加入高滲YEPD培養(yǎng)基，離心，棄上清液即得原生質(zhì)體融合物：融合頻率=[（融合子數(shù)×稀釋倍數(shù)）/再生完全培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的總菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)]×100%融合結(jié)果如表3所示。兩菌株融合后，稀釋度為10-2的菌株原生質(zhì)體融合頻率為27.07%，稀釋度為10-3的菌株原生質(zhì)體融合頻率為42.55%，說明稀釋度為10-3的菌株原生質(zhì)體融合頻率更高。表3原生質(zhì)體融合結(jié)果稀釋倍數(shù)融合子數(shù)平均數(shù)再生完全培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的平均總菌落數(shù)融合頻率稀釋10-21440532027.07%稀釋10-3868204042.55%討論原生質(zhì)體融合技術(shù)為遺傳操縱、分子生物學(xué)和基礎(chǔ)理論研究提供了一種重要工具,也為遺傳育種提供了一種有效手段,已廣泛應(yīng)用于微生物育種工作的各個(gè)方面。近年來,滅活原生質(zhì)體融合、離子束細(xì)胞融合、非對(duì)稱細(xì)胞融合以及基因重排分子育種等新方法相繼提出并應(yīng)用于微生物育種,這是原生質(zhì)體融合技術(shù)的新發(fā)展。相信隨著技術(shù)的不斷完善,原生質(zhì)體融合在生物育種中占有的地位會(huì)越來越重要。原生質(zhì)體融合技術(shù)在生產(chǎn)實(shí)踐中的應(yīng)用產(chǎn)生的效益,已是舉世矚目,它已成為高新技術(shù)開發(fā)的重要領(lǐng)域。該技術(shù)不僅為核質(zhì)相互關(guān)系、基因調(diào)控、遺傳互補(bǔ)、腫瘤發(fā)生、基因定位、衰老控制理念等領(lǐng)域的研究提供了有力的手段,而且在遺傳學(xué)、動(dòng)植物遠(yuǎn)緣雜交育種、發(fā)生生物學(xué)、免疫醫(yī)學(xué)以及醫(yī)藥、食品、農(nóng)業(yè)等方面都有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。通過原生質(zhì)體融合進(jìn)行細(xì)胞雜交已成為細(xì)胞工程研究的重要內(nèi)容之一。參考文獻(xiàn)：[1]杜金華,