家蠶滯育激素dh的研究進(jìn)展

家蠶滯育激素dh的研究進(jìn)展

昆蟲是變溫動(dòng)物，其生命活動(dòng)受到環(huán)境條件的限制。極端的環(huán)境條件都會影響其正常生活,同時(shí)也威脅昆蟲種和個(gè)體的生命維持。在漫長的進(jìn)化過程中,昆蟲對環(huán)境條件的不斷適應(yīng)和環(huán)境對昆蟲個(gè)體的選擇,最終出現(xiàn)了昆蟲滯育的特性。所謂滯育是指周期性出現(xiàn),比休眠更深的新陳代謝受抑制的生理狀態(tài),是對于有節(jié)奏重復(fù)到來的不良環(huán)境條件歷史性的反應(yīng),是昆蟲對環(huán)境條件長期適應(yīng)的結(jié)果。在自然情況下滯育的解除要求一定的時(shí)間和一定的條件,并由激素控制。滯育在昆蟲種群的延續(xù)方面具有極為重要的作用:首先,滯育可使昆蟲度過不良環(huán)境,使得個(gè)體和種群得以生存;其次,滯育可以調(diào)節(jié)個(gè)體發(fā)育,使整個(gè)群體發(fā)育整齊以利于雌雄個(gè)體間的交配,保證了種的繁衍。滯育調(diào)控機(jī)理極其復(fù)雜,經(jīng)研究表明,外界的環(huán)境條件是通過影響昆蟲體內(nèi)的神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)而對滯育起到調(diào)控作用的。家蠶屬于卵滯育型昆蟲,其滯育激素(diapausehormoneDH)是由咽下神經(jīng)節(jié)(suboesophagealganglionSG)所分泌的一種神經(jīng)肽,在家蠶的滯育過程中起著關(guān)鍵性作用。1滯育激素的再發(fā)現(xiàn)在20世紀(jì)50年代初Fukuda和Hasegawa分別同時(shí)用實(shí)驗(yàn)形態(tài)學(xué)方法發(fā)現(xiàn)SG是控制滯育的內(nèi)分泌器官,Fukuda稱該分泌物為滯育因子(diapausefactor),Hasegawa稱為滯育激素(DH)。隨后的一系列研究發(fā)現(xiàn)SG的分泌活性受到腦的控制,還有報(bào)道心側(cè)體、前腦腺器官也與滯育決定相關(guān)。研究表明DH是控制家蠶胚胎滯育的激素,它由咽下神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)分泌細(xì)胞分泌。Hasegawa(1957)首次從SG抽提出具有生物活性的物質(zhì),命名為滯育激素,此后開始大規(guī)模的分離純化工作。首先科研人員用主要含有丙酮、甲醇、二氯甲烷、丁醇等的有機(jī)溶劑對家蠶雄蛾頭部進(jìn)行抽提,粗抽提物再經(jīng)葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠及其它一些分子篩柱洗脫,分步收集進(jìn)行DH活性鑒定。活性鑒定是把各洗脫組份注射到非滯育多化性品種(N4)的雌蛹體內(nèi),時(shí)間是化蛹后第4d(復(fù)眼開始著色時(shí))。羽化后和雄蛾交配,使之產(chǎn)卵。這些產(chǎn)下卵保護(hù)在25℃左右,觀察10d,滯育卵著色后不孵化,非滯育卵則繼續(xù)發(fā)育最后孵化。通過這種抽提和鑒定方法,70年代中后期終于分離得到DH的二種活性組份:DH-A;DH-B。根據(jù)蛋白酶的作用結(jié)果,表明DH屬于多肽類物質(zhì)。Imai等(1991)改變了實(shí)驗(yàn)條件,以家蠶蛹的SG為材料,用沸水抽提法結(jié)合反相高效液相色譜(RP-HPLC),純化出500ngDH,發(fā)現(xiàn)DH是由24個(gè)氨基酸組成的多肽,分子結(jié)構(gòu)如下:Thr-Asp-Met-Lys一Asp-Glu-Ser-Asp一Arg一Gly-A1a-His-Ser-Glu-Arg一Gly-Ala-Leu-Cys-Phe-Gly-Pro-Arg一Leu-NH2,DH分子量是2645,在C末端被酰胺化。人工合成的DH顯示出和天然的活性相當(dāng),證實(shí)了測定結(jié)果的正確性。最初不能確定DH的第19位是什么氨基酸,最初推定為半胱氨酸,但后來的DHcDNA結(jié)構(gòu)表明第19位是色氨酸。第19位無論是半胱氨酸還是色氨酸,生物學(xué)活性無差別。人工合成的DH顯示出和天然分離的DH具有同樣的誘導(dǎo)活性,歷經(jīng)40年,家蠶DH結(jié)構(gòu)終被查明。2滯育激素對平臺性卵體代謝的作用蠶卵的滯育決定于咽下神經(jīng)節(jié)所分泌的滯育激素,而激素的主要作用在于調(diào)節(jié)物質(zhì)代謝。Chino在20世紀(jì)50年代末期發(fā)現(xiàn)了家蠶卵發(fā)育進(jìn)入滯育時(shí),出現(xiàn)特異的碳水化合物代謝,即剛產(chǎn)下的滯育卵中的糖原含量要比非滯育卵顯著多,一旦卵開始進(jìn)入滯育,則糖元轉(zhuǎn)化為山梨醇和甘油。在滯育解除時(shí),這二種糖醇再合成糖原。山下等(1969)同時(shí)進(jìn)行了摘除卵巢、給雄蠶移植卵巢和摘除咽下神經(jīng)節(jié),并分別測定其脂肪體等碳水化合物量的實(shí)驗(yàn),結(jié)果不但明確了滯育激素的靶器官是卵巢,而且還表明卵巢以血液海藻糖為原料合成卵巢糖原,而血液海藻糖則來源于脂肪體糖原。在自然條件下,或摘除咽下神經(jīng)節(jié)與注射滯育激素時(shí),往往同一蛾產(chǎn)下滯育與非滯育的混合卵,可見卵的滯育與否不是決定于整個(gè)卵巢,而是以每個(gè)卵為單位的。并確定了卵發(fā)育到500~600ug時(shí)是DH作用的有效時(shí)期,卵細(xì)胞發(fā)育的早期及成熟期均不受DH影響。20世紀(jì)70年代Yamashita等人確定DH是使血糖降低的一種激素。山下的進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明了滯育激素主要是通過減少cGMP的合成,即使鳥苷酸環(huán)化酶活性下降來調(diào)節(jié)cGMP的濃度,而海藻糖酶的活性在鳥苷酸環(huán)化酶活性下降開始上升。因而滯育激素對卵巢碳水化合物代謝的作用過程為:血液將SG分泌的DH運(yùn)送到卵巢,和存在于卵母細(xì)胞膜上的滯育激素受體結(jié)合;這種結(jié)合體作用于鳥苷酸環(huán)化酶,使之活性下降,使得cGMP合成受到抑制,結(jié)果cGMP的濃度下降提高了膜上海藻糖酶活性,酶分解血液海藻糖成葡萄糖的反應(yīng)加快,更多的葡萄糖通過膜進(jìn)入卵母細(xì)胞,在卵母細(xì)胞中合成糖元,最終在滯育卵中糖元轉(zhuǎn)化為山梨醇和甘油。糖醇的分子中含有較多的氫原子,這種化學(xué)變化有利于節(jié)約和儲存能量。另外,山梨醇和甘油的混合液具有高度的防凍作用,有利于蠶卵抵御冬天的低溫。滯育激素除影響卵的碳水化合物代謝外,與色素代謝、脂質(zhì)代謝及蛋白質(zhì)代謝等一切物質(zhì)代謝都有一定的關(guān)系。倉田(1980)發(fā)現(xiàn)滯育激素對DNA和RNA的影響也顯著,滯育卵中的核糖體和mRNA在體外表達(dá)中均無活性。滯育激素對各種物質(zhì)代謝的影響引起了蠶卵的滯育,也表明卵的代謝狀態(tài)不是在卵產(chǎn)下以后才開始決定的,而是卵在卵巢內(nèi)發(fā)育中已大致被決定。3化性的遺傳結(jié)構(gòu)20世紀(jì)初以來科研人員就對滯育的遺傳學(xué)方面進(jìn)行了大量的研究,推定了控制家蠶化性的基因在染色體上的位置。外山氏(1906)和Mccracken(1908)分別看到了化性的母性遺傳現(xiàn)象。蠶卵受精后,卵內(nèi)胚子是繼續(xù)發(fā)育到孵化,還是發(fā)育到一定階段后進(jìn)入滯育,這雖然是F1代的性狀,但實(shí)際上它在母體內(nèi)就已經(jīng)決定了。一般品種的化性表現(xiàn)母性遺傳,母蛾所產(chǎn)蠶卵的化性決定于母體的基因型及母體世代所處的環(huán)境條件,而與交配的雄蛾的化性基因型無關(guān)。梅谷(1925)最早發(fā)現(xiàn)了化性的伴性遺傳,化性的基因表達(dá)要推遲一代,因而表現(xiàn)母性遺傳,而決定化性的基因,既有長染色體基因,又有性染色體基因,因而既表現(xiàn)普通遺傳又表現(xiàn)母性遺傳,這兩者的綜合表現(xiàn)則是部分伴性遺傳。永友(1942)和諸星(1956)分別提出了有關(guān)化性的理論假設(shè)。諸星認(rèn)為蠶的化性主要受第6染色體上3個(gè)化性復(fù)等位主基因所控制,同時(shí)又受Z染色體上3個(gè)伴性復(fù)等位成熟基因的強(qiáng)烈影響,因而表現(xiàn)部分伴性遺傳。吉武等(1969)實(shí)驗(yàn)表明化性的決定涉及兩種因子,除了決定于咽下神經(jīng)節(jié)分泌激素的第一因子外,還決定于受精后產(chǎn)生的第二因子。這兩個(gè)因子呈互補(bǔ)關(guān)系,同時(shí)存在時(shí)蠶卵進(jìn)入滯育,缺少任何一個(gè)因子蠶卵就不能進(jìn)入滯育。但一般品種都具有第二因子,所以表面上看來,似乎化性只決定于第一因子。Pinyarat等人利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)結(jié)合經(jīng)典遺傳學(xué)方法研究DH在染色體上的定位,發(fā)現(xiàn)了3個(gè)DH等位基因,并且位于第11染色體上。這些結(jié)果和過去的不同之處有待今后深入研究。4家蠶停滯研究4.1dh分子的結(jié)構(gòu)用人工合成的DH為抗原,注射兔子獲取抗體,在蛹期DH分泌時(shí)期注射DH抗體。結(jié)果發(fā)現(xiàn)海藻糖酶活力下降,原來產(chǎn)滯育卵的則全部轉(zhuǎn)變?yōu)榉菧?。如果在注射抗體的同時(shí)加入DH或移植能分泌DH的SG,則原來產(chǎn)滯育卵的仍為滯育卵。這些事實(shí)說明DH是一個(gè)24個(gè)氨基酸組成的分子是正確的。DH分子的C瑞是否被酰胺化?Suwan等人合成了C瑞是游離的——COOH和被酰胺化的——CONH2,結(jié)果表明酰胺化的有高度誘導(dǎo)滯育活性,而游離羧基則沒有任何生物學(xué)活性。Saito等人合成了不同長度的DH分子,認(rèn)為C端是活性所必須的部位,缺乏C端則無活性。反之,DH分子的N端去掉幾個(gè)氨基酸,則對生物學(xué)活性幾乎沒有什么影響。4.2drh基因及gsnp神經(jīng)肽表達(dá)Sato等人(1992、1993)完成了家蠶滯育激素cDNA一級結(jié)構(gòu)的測定。為了從分子水平上闡明滯育激素的功能和作用機(jī)理,徐衛(wèi)華(1995)首次以家蠶DHcDNA為探針,用32P—dCTP作標(biāo)記,篩選和克隆了家蠶滯育激素基因。利用部分DNA序列測定,鑒定了家蠶DH基因克隆。從cDNA和基因克隆結(jié)果看,DH的第十九位氨基酸是色氨酸,蛋白測序時(shí)第十九位推定為半胱氨酸,這兩種DH分子生物學(xué)活性幾乎沒有什么差別。從cDNA結(jié)構(gòu)看,滯育激素的mRNA不僅編碼滯育激素,還編碼性信息素合成激活肽(Pheromonebiosynthesisactivatingneuropeptide,PBAN)以及功能尚不清楚的α-、β-、γ-SGNP3個(gè)短肽。在昆蟲界,一個(gè)mRNA同時(shí)編碼多個(gè)功能蛋白,家蠶是首例。比較DH、PBAN及三個(gè)SGNP,發(fā)現(xiàn)它們具有一個(gè)共同的、保守的C端五肽結(jié)構(gòu),它們都具有一定的DH活性,顯示出DH分子在進(jìn)化過程中的多態(tài)性。DH基因由5個(gè)內(nèi)含子和6個(gè)外顯子組成,長達(dá)6kb,而外顯子(mRNA)僅0.8kb,表現(xiàn)出真核基因結(jié)構(gòu)的高度復(fù)雜性。DH基因的5’上游有數(shù)個(gè)可能的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)部位。DHmRNA定量分析表明,滯育與否不是取決于SG是否分泌DH,而是取決于SG分泌DH的數(shù)量。DH基因由于編碼多個(gè)功能蛋白,基因表達(dá)一定有非同尋常之處,XuW-H等(1995)通過胚子保育溫度與DH基因表達(dá)的相關(guān)研究,發(fā)現(xiàn)了溫度控制的DH基因表達(dá)和發(fā)育時(shí)期依賴的基因表達(dá)二種類型,這是昆蟲基因表達(dá)研究的重大突破。徐衛(wèi)華等(1998)通過Northern雜交和PCR擴(kuò)增的DHmRNA長度多態(tài)性分析,發(fā)現(xiàn)同時(shí)編碼五個(gè)神經(jīng)肽的DH基因先轉(zhuǎn)錄形成一個(gè)0.8kb的前體mRNA,再翻譯形成一個(gè)大的前體多肽后經(jīng)蛋白水解酶的作用,釋放出DH、PBAN及三個(gè)SGNP神經(jīng)肽。分子雜交顯出家蠶胚子用高溫(25℃)催青,在胚期DH基因表達(dá),次代卵滯育。用低溫(15℃)催青,則胚期DH基因不表達(dá),次代卵不滯育。不僅如此,XuW-H等(1998)還利用RT-PCR方法,從高溫催青家蠶卵中克隆到DHcDNA,測序結(jié)果證明了催青溫度與DH基因表達(dá)的關(guān)系。這就表明了催青溫度是通過誘導(dǎo)DH基因表達(dá)最終致使次代卵滯育的。此外,徐衛(wèi)華等還以野蠶、柞蠶、天蠶、蟋蟀、家蠅以及無脊椎動(dòng)物線蟲等等為材料,進(jìn)行了基因組Southern實(shí)驗(yàn)并得到清晰的區(qū)帶。說明滯育激素基因不僅存在于家蠶,還有可能廣泛地存在于其它昆蟲或無脊椎動(dòng)物的染色體上。5有關(guān)延遲的研究5.1ea4蛋白表達(dá)Kai(1986)、徐世清(1999)通過實(shí)驗(yàn)方法得到了純度很高的酯酶A4(EsteraseA4,EA4)蛋白質(zhì),對其進(jìn)行測序確定EA4酶蛋白的氨基酸一級結(jié)構(gòu)由His到Tyr的155個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成,蛋白質(zhì)部分的分子量為16684。Kai(1972a,1987,1988b)、橫山岳(1987)及徐世清(1994)的實(shí)驗(yàn)表明EA4的活性出現(xiàn)可能不存在酶蛋白質(zhì)的改造和修飾。甲斐進(jìn)一步認(rèn)為糖基沒有直接參與EA4的生物活性。在EA4純化過程中,分離到一種小分子量的多肽,能有效抑制EA4的活性,這種多肽被稱為多肽抑制因子(peptidicinhibitoryneedle,PIN)。徐世清(1999b,1999c,2000c)通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明PIN能夠與EA4結(jié)合,從而抑制EA4的活性,而且鹽酸處理可能直接使結(jié)合于EA4酶蛋白的PIN脫落,從而迅速激活EA4。甲斐還認(rèn)為PIN只能抑制完整的EA4的活性,無糖基EA4的活性不受PIN影響。5.2海藻糖酶基因片段的擴(kuò)增和復(fù)配DH通過一系列反應(yīng)導(dǎo)致卵巢海藻糖酶(trehalase)活性提高,使血液中的海藻糖分解成葡萄糖,葡萄糖進(jìn)入卵母細(xì)胞進(jìn)一步合成糖原誘導(dǎo)卵滯育,故海藻糖酶是滯育激素調(diào)控代謝過程中的關(guān)鍵酶。80年代末開始試圖克隆家蠶海藻糖酶,闡明調(diào)控代謝的分子機(jī)理。SuZ-H等(1993)根據(jù)大腸桿菌和兔小腸的海藻糖酶保守的氨基酸序列,合成引物擴(kuò)增出家蠶海藻糖酶基因片段。進(jìn)而以此基因片段為探針篩選家蠶蛹中腸構(gòu)建的cDNA庫,得到cDNA完整分子,這才弄清海藻糖酶是由564個(gè)氨基酸組成,分子量為64899。體內(nèi)和體外的生物學(xué)分析結(jié)果表明,DH能誘導(dǎo)海藻糖酶活性的增加。體外分析也表明伴隨海藻糖酶活性的增加,滯育卵增加。SuZ-H等(1994)進(jìn)一步的研究表明,將DH注射進(jìn)除去SG的蛹體,卵巢海藻糖酶mRNA增加7倍,不除SG的蛹海藻糖酶mRNA僅增加3倍。體外保育卵巢證實(shí)DH能提高海藻糖酶mRNA水平。以上結(jié)果清楚顯示DH是通過促進(jìn)海藻糖酶的mRNA的轉(zhuǎn)錄來提高海藻糖酶的數(shù)量,從而達(dá)到提高酶活性,最終改變代謝途徑,誘導(dǎo)卵滯育。5.3滯育卵sdh基因轉(zhuǎn)錄及分子機(jī)理研究蠶卵內(nèi)山梨醇含量與滯育開始、持續(xù)和解除的過程具有密切的平行關(guān)系。促使人們希望通過對山梨醇含量變化的研究,揭示蠶卵滯育及滯育解除的奧秘。但迄今為止,只發(fā)現(xiàn)山梨醇具有防凍的功能,在蠶卵越冬或冷藏期間,可以穩(wěn)定亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能。于是,研究注意力轉(zhuǎn)移到與山梨醇轉(zhuǎn)化成糖原有關(guān)的調(diào)節(jié)酶上。近年來注意力放在山梨醇脫氫酶(sorbitoldehydrogenase,SDH)的基因研究方面,Niimi(1992,1993)等人查明了伴隨滯育卵的解