凍干產(chǎn)品無菌工藝模擬試驗(yàn)方案改進(jìn)及實(shí)施研究

1、引言

無菌工藝模擬試驗(yàn)是指采用微生物培養(yǎng)基替代無菌產(chǎn)品，對(duì)整個(gè)無菌生產(chǎn)工藝進(jìn)行評(píng)估驗(yàn)證的技術(shù)，通常也被稱為“培養(yǎng)基灌裝試驗(yàn)”。需要把培養(yǎng)基灌裝于無菌容器中，并在無菌生產(chǎn)環(huán)境中進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)，通過模擬此無菌工藝的過程，最后將灌封有培養(yǎng)基的容器在適當(dāng)溫度下進(jìn)行培養(yǎng)，檢查容器內(nèi)微生物的生長(zhǎng)狀況，來對(duì)無菌工藝模擬試驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)，評(píng)價(jià)該試驗(yàn)是否在操作過程中產(chǎn)生了污染。通常將此試驗(yàn)應(yīng)用于非最終滅菌的無菌產(chǎn)品中，而對(duì)最終滅菌產(chǎn)品沒有強(qiáng)制的要求。根據(jù)《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（2010年修訂）》（GoodManufacturingPracticeofMedicalProducts，GMP）以及附錄1的“無菌要求”，無菌產(chǎn)品的生產(chǎn)應(yīng)當(dāng)進(jìn)行培養(yǎng)基灌裝試驗(yàn)。在無菌生產(chǎn)過程當(dāng)中，對(duì)于直接接觸藥物的設(shè)備、部件、灌裝容器以及原料，雖然已經(jīng)過滅菌，但是當(dāng)采用這些要素進(jìn)行無菌生產(chǎn)時(shí)，仍然會(huì)由于各種因素導(dǎo)致產(chǎn)品發(fā)生污染，從而影響了無菌產(chǎn)品的質(zhì)量。因此，無菌工藝的評(píng)估應(yīng)當(dāng)采用一種更合適的方式進(jìn)行。無菌工藝模擬試驗(yàn)，是對(duì)無菌工藝進(jìn)行評(píng)估的一種驗(yàn)證技術(shù)，采用培養(yǎng)基模擬完成實(shí)際無菌生產(chǎn)操作后，可以對(duì)結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)，借以確定實(shí)際生產(chǎn)中產(chǎn)品被污染的概率。Part2、無菌工藝模擬試驗(yàn)方案技術(shù)要求

廣西梧州制藥（集團(tuán)）股份有限公司生產(chǎn)的無菌產(chǎn)品為凍干制劑，故以凍干產(chǎn)品的無菌工藝模擬試驗(yàn)來模擬整個(gè)工藝過程，包括從部件、材料的滅菌準(zhǔn)備，一直到完成灌裝和軋蓋等整個(gè)過程。而對(duì)于無菌工藝模擬試驗(yàn)方案的設(shè)計(jì)中，工藝條件的選擇應(yīng)當(dāng)選取合理的“最差條件”，即整個(gè)工藝流程，應(yīng)采用最差條件來進(jìn)行試驗(yàn)。最差條件即在工藝規(guī)程允許范圍內(nèi)，正常生產(chǎn)會(huì)遇到的最差情況，其并不包括由偏差引起的超出工藝要求的特殊情形。如果在最差條件下培養(yǎng)基灌裝試驗(yàn)仍然取得好的結(jié)果，那么說明在比最差條件還要好的正常實(shí)際生產(chǎn)過程中，無菌保證水平會(huì)更有保證。2.1無菌工藝模擬試驗(yàn)最差條件設(shè)計(jì)

凍干產(chǎn)品的無菌工藝模擬試驗(yàn)最差條件設(shè)計(jì)，可以包括在準(zhǔn)備階段將物料、灌裝器具、設(shè)備等按照工藝要求在無菌條件下放置允許的最長(zhǎng)時(shí)間；灌裝時(shí)可以在關(guān)鍵區(qū)域保留最多的人員；模擬在工藝允許范圍內(nèi)更長(zhǎng)的灌裝時(shí)間；控制無菌工藝模擬試驗(yàn)灌裝速度等。2.2最差條件具體實(shí)施方式

2.2.1控制物料、器具、設(shè)備等放置時(shí)間凍干工藝所采用的西林瓶、膠塞、鋁蓋、灌裝器具、配料系統(tǒng)和凍干柜，將其滅菌并放置工藝規(guī)程允許的最長(zhǎng)時(shí)間后使用，如表1所示。表1包材、器具與設(shè)備滅菌后放置時(shí)間記錄表其中，為了考察其放置最長(zhǎng)時(shí)間后的無菌水平，西林瓶、膠塞和鋁蓋在放置結(jié)束后，均取樣進(jìn)行了無菌性檢查，結(jié)果均符合無菌工藝要求，可繼續(xù)用于無菌工藝模擬試驗(yàn)。2.2.2控制灌裝人數(shù)參與無菌工藝模擬試驗(yàn)的關(guān)鍵區(qū)域人員，均按表2所示進(jìn)行人員控制。進(jìn)行無菌工藝模擬試驗(yàn)時(shí)，實(shí)際操作人員數(shù)量均按工藝規(guī)程允許的最大人員數(shù)量進(jìn)行。其中，各潔凈室組成人員，可由操作工、維修人員和檢測(cè)人員組成，操作人員負(fù)責(zé)無菌模擬試驗(yàn)的生產(chǎn)操作，檢測(cè)人員負(fù)責(zé)微生物取樣、環(huán)境監(jiān)控等操作，維修人員負(fù)責(zé)對(duì)設(shè)備進(jìn)行模擬維修或突發(fā)情況的處理。表2培養(yǎng)基灌裝試驗(yàn)人員控制記錄表2.2.3灌裝速度與時(shí)間控制在灌裝運(yùn)行速度上，基于風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，應(yīng)對(duì)灌裝速度進(jìn)行評(píng)估并說明所定速度的理由。一般來說，對(duì)于廣口的容器，可采用在無菌生產(chǎn)區(qū)暴露較長(zhǎng)時(shí)間的工藝，即降低灌裝速度，考察無菌過程是否受到污染；而對(duì)于瓶口較小的容器，可采用高速運(yùn)行的方式來評(píng)估，在高速運(yùn)行中進(jìn)行大量手工操作干擾，用于評(píng)估無菌生產(chǎn)工藝是否受到污染。培養(yǎng)基灌裝的持續(xù)時(shí)間控制是方案設(shè)計(jì)時(shí)必須考慮的重要問題，綜合考慮生產(chǎn)操作、操作干擾和實(shí)際無菌操作的周期后，盡管最準(zhǔn)確的方法是模擬全批量的操作時(shí)間，因?yàn)槠渥钅芊从硨?shí)際生產(chǎn)運(yùn)行的情況，但也可以有其他合理且適當(dāng)?shù)哪Ｊ?，預(yù)估模擬試驗(yàn)的時(shí)間一般不少于正常實(shí)際操作生產(chǎn)的時(shí)間，以更好地反映整個(gè)過程所帶來污染的風(fēng)險(xiǎn)。Part3、試驗(yàn)先決條件檢查

3.1廠房設(shè)施設(shè)備以及公用系統(tǒng)的準(zhǔn)備

廠房設(shè)施設(shè)備以及公用系統(tǒng)的準(zhǔn)備具體內(nèi)容如下[1]。進(jìn)行凍干產(chǎn)品無菌工藝模擬試驗(yàn)，需要確認(rèn)工藝設(shè)備、公用系統(tǒng)和輔助設(shè)施都已經(jīng)按照預(yù)期進(jìn)行了相應(yīng)的驗(yàn)證，且物品、廠房和設(shè)施所使用的消毒劑和消毒方式也完成了相應(yīng)的驗(yàn)證。對(duì)于藥液及產(chǎn)品所接觸到的氣體、設(shè)備組件、容器、器具滅菌工藝都應(yīng)完成相應(yīng)的驗(yàn)證，無菌生產(chǎn)區(qū)域的環(huán)境，應(yīng)達(dá)到設(shè)計(jì)要求，能夠持續(xù)穩(wěn)定地運(yùn)行。3.2人員的培訓(xùn)

參與無菌工藝模擬試驗(yàn)的人員，應(yīng)接受藥品GMP、無菌操作、微生物知識(shí)以及實(shí)施無菌模擬試驗(yàn)的相關(guān)培訓(xùn)，且進(jìn)入無菌潔凈區(qū)的全部人員，都應(yīng)通過無菌更衣程序的確認(rèn)，確認(rèn)每位參與者可進(jìn)入的區(qū)域以及其所允許的無菌操作項(xiàng)目。3.3培養(yǎng)基及相關(guān)包材的準(zhǔn)備

進(jìn)行無菌工藝模擬試驗(yàn)，應(yīng)充分考慮模擬介質(zhì)與無菌工藝的適宜性，應(yīng)結(jié)合被模擬產(chǎn)品的特點(diǎn)以及模擬介質(zhì)的可過濾性、澄清度、滅菌方式等方面來選擇培養(yǎng)基，盡可能地模擬無菌生產(chǎn)工藝流程，且不應(yīng)該選擇具有抑菌性的模擬介質(zhì)，以確認(rèn)模擬試驗(yàn)的可信度。通?？梢圆捎玫呐囵B(yǎng)基為胰酪胨大豆肉湯（TrypticSoytoneBroth，TSB），其無抑菌作用，且滅菌方式簡(jiǎn)單易操作；易溶解和擴(kuò)散（若溶解性不好，懸浮在培養(yǎng)基中的模擬介質(zhì)使培養(yǎng)基發(fā)生渾濁，容易影響結(jié)果的判斷）；易清潔，對(duì)設(shè)備沒有腐蝕性，對(duì)人體無害，不會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染。培養(yǎng)基在使用前已進(jìn)行除菌過濾，其滅菌方式應(yīng)經(jīng)過驗(yàn)證。無菌工藝模擬試驗(yàn)所用到的包裝材料，應(yīng)按相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)合格，具備檢驗(yàn)合格報(bào)告單。Part4、無菌工藝模擬試驗(yàn)方案的實(shí)施

4.1檢測(cè)儀器與設(shè)備

ApexZ50激光塵埃粒子計(jì)數(shù)器、MAS-100NT浮游菌采樣儀。4.2材料與試劑

TSB培養(yǎng)基、TSA培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿（55mm、90mm）、西林瓶（7mL）、膠塞、鋁蓋。4.3無菌工藝模擬試驗(yàn)實(shí)施過程

凍干產(chǎn)品的無菌工藝模擬試驗(yàn)?zāi)M的是整個(gè)工藝過程，包括培養(yǎng)基準(zhǔn)備過程、灌裝過程、凍干過程、軋蓋過程和培養(yǎng)基微生物的培養(yǎng)過程，應(yīng)在與實(shí)際生產(chǎn)相同條件下盡量模擬實(shí)際生產(chǎn)完成的相應(yīng)操作，還應(yīng)充分考慮生產(chǎn)時(shí)可能造成污染的各種因素，對(duì)各種干擾活動(dòng)進(jìn)行模擬，模擬無菌灌裝期間遇到的最差狀況下的操作。4.3.1培養(yǎng)基準(zhǔn)備過程試驗(yàn)所使用的培養(yǎng)基應(yīng)是經(jīng)過微生物促生長(zhǎng)能力檢測(cè)合格的培養(yǎng)基，培養(yǎng)基（TSB）配制完成后，經(jīng)除菌過濾至無菌儲(chǔ)罐中，并在無菌儲(chǔ)罐中貯存工藝允許的最長(zhǎng)時(shí)間，貯存結(jié)束后，進(jìn)行下一步的模擬灌裝試驗(yàn)。4.3.2灌裝過程灌裝前，應(yīng)按正常生產(chǎn)操作進(jìn)行灌裝部件的組裝，并進(jìn)行裝量的調(diào)節(jié)。由于培養(yǎng)基灌裝量較大（約9萬支），且為瓶口較小的7mL西林瓶，故采用高速灌裝，并在灌裝過程中穿插干擾操作的模式來進(jìn)行模擬，根據(jù)洗烘灌聯(lián)動(dòng)線的整體性能，把灌裝速度控制在350支/min，灌裝第2h和第4h，分別模擬一次灌裝干擾操作，綜合考慮生產(chǎn)操作、各種干擾和實(shí)際無菌操作的周期后，決定總灌裝時(shí)長(zhǎng)約為6h。4.3.3灌裝干擾操作實(shí)施與改進(jìn)在無菌工藝模擬試驗(yàn)過程中，必須模擬所有正常操作的活動(dòng)，包括取樣、稱重、沉降菌換皿、層流車轉(zhuǎn)運(yùn)和產(chǎn)品出入凍干柜等，而除了這些計(jì)劃的活動(dòng)以外，還存在非計(jì)劃卻不可避免發(fā)生的活動(dòng)，比如西林瓶倒瓶、爆瓶的處理，灌裝異常的處理，各種灌裝機(jī)故障維修等，因此本次無菌工藝模擬試驗(yàn)在進(jìn)行所有正常操作的活動(dòng)外，通過改進(jìn)方案，需進(jìn)行非正常的突發(fā)事件的處理來模擬最差生產(chǎn)狀況[2]。表3可以作為本次無菌模擬試驗(yàn)干擾項(xiàng)目和頻次的參考。4.3.4凍干過程灌裝完的西林瓶運(yùn)送至凍干柜內(nèi)，關(guān)閉凍干柜門后，放置10h后，模擬抽真空補(bǔ)氣操作2次（每次抽真空至500～600mbar），引發(fā)柜內(nèi)空氣流動(dòng)，再通過無菌空氣達(dá)到氣流平衡。4.3.5軋蓋過程凍干結(jié)束后，打開柜門擺放至少2h，西林瓶出柜，放置密閉車至少6h，然后進(jìn)行軋蓋，軋蓋完成后，所有培養(yǎng)基產(chǎn)品全部制備完畢。4.3.6目檢過程軋蓋后的產(chǎn)品轉(zhuǎn)移至目檢操作間，人工進(jìn)行目檢檢查。4.3.7微生物的培養(yǎng)已灌裝的培養(yǎng)基應(yīng)當(dāng)在適當(dāng)?shù)臈l件下進(jìn)行培養(yǎng)，以檢出微生物，且培養(yǎng)溫度應(yīng)適宜于一般微生物及環(huán)境分離菌的恢復(fù)生長(zhǎng)。（1）陰性對(duì)照。在模擬灌裝過程中，抽取16支灌裝并半加塞的培養(yǎng)基，進(jìn)行壓塞密封，作為陰性對(duì)照品，其中8支于30℃～35℃條件下培養(yǎng)14天，另8支于20℃～25℃條件下培養(yǎng)14天，其陰性對(duì)照不應(yīng)出現(xiàn)渾濁。（2）陽(yáng)性對(duì)照。為了確認(rèn)培養(yǎng)基的促菌生長(zhǎng)能力，在模擬灌裝試驗(yàn)中，抽取25支灌裝后半加塞的培養(yǎng)基，壓塞密封，作為陽(yáng)性對(duì)照品，其中5支接種金黃色葡萄球菌混懸液，5支接種銅綠假單胞菌混懸液，5支接種枯草桿菌混懸液，5支接種白色念珠菌混懸液，5支接種黑曲霉懸浮液，各菌種混懸液均為0.1mL，濃度＜100cfu/0.1mL。接種后，按藥典規(guī)定進(jìn)行菌種的培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后，觀察陽(yáng)性對(duì)照品的生長(zhǎng)情況，應(yīng)被證實(shí)有菌生長(zhǎng)則為合格。（3）試驗(yàn)樣品的培養(yǎng)及調(diào)查。無菌工藝模擬試驗(yàn)的全部樣品應(yīng)當(dāng)在適宜的溫度條件下培養(yǎng)14天，先于較低溫度（20℃～25℃）下培養(yǎng)至少7天，然后在較高溫度（30℃～35℃）下培養(yǎng)至少7天，在低溫和高溫的培養(yǎng)過程中和培養(yǎng)結(jié)束后，分別觀察一次，并記錄檢查結(jié)果，若發(fā)現(xiàn)污染應(yīng)明確記錄樣品數(shù)量，若出現(xiàn)破損應(yīng)記錄并檢查破損原因。由于灌裝數(shù)量超過10000支，若出現(xiàn)1支污染，需進(jìn)行調(diào)查；出現(xiàn)2支污染，需調(diào)查后進(jìn)行再驗(yàn)證。培養(yǎng)基灌裝的標(biāo)準(zhǔn)允許少量污染瓶的存在，但這絕對(duì)不是允許投放市場(chǎng)的無菌產(chǎn)品中可以存在受污染的狀況，無菌工藝的目的就是防止污染，發(fā)現(xiàn)任何污染樣品均應(yīng)進(jìn)行調(diào)查，分離到的污染微生物更應(yīng)鑒別到種。若培養(yǎng)基灌裝反復(fù)出現(xiàn)污染，即使每次都符合標(biāo)準(zhǔn)，也必須采取更嚴(yán)格的防污染措施[3]。4.3.8過程取樣及環(huán)境監(jiān)控?zé)o菌工藝模擬試驗(yàn)過程中，需對(duì)過程中的無菌包材進(jìn)行取樣，并對(duì)環(huán)境進(jìn)行監(jiān)控，以考察生產(chǎn)操作的實(shí)際情況，不應(yīng)采取特別的生產(chǎn)控制和預(yù)防措施，制造特別良好的工藝環(huán)境，這樣會(huì)導(dǎo)致不準(zhǔn)確的評(píng)估結(jié)論，造成工藝條件良好的假想，過程取樣及環(huán)境監(jiān)控如表4所示。Part5、結(jié)束