發(fā)酵工程應(yīng)用實(shí)例 谷氨酸發(fā)酵

谷氨酸發(fā)酵一、谷氨酸產(chǎn)生菌

1.種類(lèi)：谷氨酸棒桿菌、黃色短桿菌、乳糖發(fā)酵短桿菌、嗜氨小桿菌、硫殖短桿菌。我國(guó)使用的生產(chǎn)菌株是北京棒桿菌AS1.299、北京棒桿菌D110、鈍齒棒桿菌AS1.542、棒桿菌S-914和黃色短桿菌T6~13等。谷氨酸棒桿菌呈一端膨大的棒狀，折斷分裂形成“八”字狀排列2.形態(tài)上共同特點(diǎn)（芽孢桿菌除外）:（1）革蘭氏陽(yáng)性（2）菌體為球形、短桿至棒狀（3）不形成芽孢（4）沒(méi)有鞭毛，不能運(yùn)動(dòng)（5）都是生物素缺陷型（6）都是需氧型微生物二、谷氨酸合成途徑1.谷氨酸合成的方式（1）氨基轉(zhuǎn)移作用

-酮戊二酸+氨基酸谷氨酸+

-酮酸（2）還原氨基化作用

-酮戊二酸+NH4++NADPH2谷氨酸+NADPH+H2O2、谷氨酸合成途徑

谷氨酸的生物合成過(guò)程中的幾個(gè)途徑

主要有：（1）糖酵解途徑（EMP途徑）（2）磷酸己糖途徑（HMP途徑）（3）三羧酸循環(huán)途徑（TCA循環(huán)）（4）乙醛酸循環(huán)途徑（DCA循環(huán)）（5）伍德-沃克反應(yīng)（CO2固定反應(yīng)）（6）α-酮戊二酸的還原氨基化反應(yīng)這6條途徑之間是相互聯(lián)系和相互制約的，如圖所示：葡萄糖

②HMP3-磷酸甘油醛丙酮酸乙酰輔酶ACO2草酰乙酸檸檬酸蘋(píng)果酸異檸檬酸延胡索酸琥珀酸NADPHα-酮戊二酸NADPHNH4+谷氨酸乳酸乙酰輔酶A④乙醛酸循環(huán)乙醛酸①EMP③TCA谷氨酸⑤CO2固定透過(guò)細(xì)胞膜⑥α-酮戊二酸的還原氨基化的幾個(gè)途徑谷氨酸的生物合成過(guò)程中三羧酸循環(huán)（TCA）4.谷氨酸產(chǎn)生菌的生化特征（1）CO2固定能力強(qiáng)。（2）

-酮戊二酸氧化能力微弱:

-酮戊二酸脫氫酶喪失或活性低。（3）異檸檬酸裂解酶活力微弱。（4）谷氨酸脫氫酶活性強(qiáng)。（5）還原性輔酶Ⅱ(NADPH+H+)進(jìn)入呼吸鏈能力缺陷或微弱。（6）不利用谷氨酸。（7）耐高糖耐高谷氨酸。（8）解除谷氨酸反饋抑制。（9）具有向胞外分泌谷氨酸的能力。

谷氨酸的大量積累不是由于生物合成途徑的特異，而是：（一）菌體代謝調(diào)節(jié)控制（二）細(xì)胞膜通透性的特異調(diào)節(jié)（三）發(fā)酵條件的適合三、谷氨酸代謝的調(diào)控（一）菌體代謝調(diào)節(jié)控制

1.谷氨酸生物合成的調(diào)節(jié)機(jī)制琥珀酸

-酮戊二酸脫氫酶（弱）

-酮戊二酸

谷氨酸脫氫酶（強(qiáng)）谷氨酸透過(guò)細(xì)胞膜谷氨酸（二）細(xì)胞膜通透性的特異調(diào)節(jié)用能積累谷氨酸菌株做如下實(shí)驗(yàn):生物素充足時(shí),細(xì)胞內(nèi)含大量谷氨酸,但培養(yǎng)液里幾乎不含谷氨酸用溶菌酶消化細(xì)胞壁得到的原生質(zhì)體仍不分泌谷氨酸當(dāng)把原生質(zhì)體放入低滲溶液里,將其漲破,谷氨酸才排出生物素亞適量時(shí),培養(yǎng)液里含大量谷氨酸,細(xì)胞里含量少結(jié)論:谷氨酸的分泌是由細(xì)胞膜控制控制細(xì)胞膜通透性的方法：控制磷脂的合成；控制細(xì)胞壁的合成：選育溫敏突變株

1.控制磷脂的合成

①生物素營(yíng)養(yǎng)缺陷型作用機(jī)制:生物素是脂肪酸生物合成最初反應(yīng)的關(guān)鍵酶乙酰CoA羧化酶的輔酶,參與了脂肪酸的合成,進(jìn)而影響脂肪酸的合成。當(dāng)磷脂合成量少到正常的1/2左右時(shí),細(xì)胞變形,Glu向膜外漏出，積累于發(fā)酵液中?？刂脐P(guān)鍵:使用該類(lèi)突變株必須限制發(fā)酵培養(yǎng)基中生物素亞適量(5-10

g/L).在發(fā)酵初期(0-8小時(shí)),細(xì)胞正常生長(zhǎng),當(dāng)生物素耗盡后,在菌的再次倍增時(shí),開(kāi)始出現(xiàn)異常形態(tài)細(xì)胞,即完成了細(xì)胞從生長(zhǎng)型到積累型轉(zhuǎn)換.突變株

②油酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型作用機(jī)制:油酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型喪失了合成油酸的能力,通過(guò)控制油酸使磷脂合成量減少到正常量的1/2左右.控制關(guān)鍵:保證在培養(yǎng)基中油酸亞適量,完成細(xì)胞從生長(zhǎng)型到生產(chǎn)型的轉(zhuǎn)換.突變株③甘油缺陷型作用機(jī)理：?jiǎn)适-甘油-3-磷酸(NADP氧化還原酶)，不能合成a-磷酸甘油和磷脂，只有添加甘油才能生長(zhǎng)。在甘油限量供應(yīng)下，由于控制了細(xì)胞膜中與滲透性有直接關(guān)系的磷脂的含量，使谷氨酸得以積累?？刂频年P(guān)鍵：添加亞適量的甘油或甘油衍生物。甘油過(guò)少，菌株生長(zhǎng)不夠好;甘油過(guò)量，磷脂合成正常，產(chǎn)谷氨酸低。突變株添加表面活性劑(如吐溫60)或不飽和脂肪酸(C16-18),也能造成細(xì)胞滲漏,積累谷氨酸。機(jī)理:兩者在脂肪酸合成時(shí)對(duì)生物素有拮抗作用,導(dǎo)致磷脂合成不足,形成不完整的細(xì)胞膜。關(guān)鍵:控制好脂肪酸或表面活性劑的時(shí)間和濃度,必須在藥劑加入后,在這些藥劑存在下進(jìn)行分裂,形成產(chǎn)酸型細(xì)胞。其他④添加表面活性劑⑤添加青霉素機(jī)理:青霉素抑制谷氨酸生產(chǎn)菌細(xì)胞壁后期的合成,細(xì)胞膜在失去保護(hù),在滲透壓的作用下受損,向外泄露谷氨酸.控制關(guān)鍵:一般在進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的早期(3-6小時(shí))添加.添加青霉素后倍增的菌體不能合成完整的細(xì)胞壁,完成細(xì)胞功能的轉(zhuǎn)換.

其他（三）發(fā)酵條件的控制（1）發(fā)酵溫度谷氨酸發(fā)酵前期(0~12h):30-32℃。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期:菌體濃度迅速增大（12h），糖耗快，維持溫度30-32℃在發(fā)酵中、后期:是谷氨酸大量積累的階段，而催化谷氨酸合成的谷氨酸脫氫酶的最適溫度在32-36℃。

（2）

pH值1）pH值對(duì)谷氨酸產(chǎn)生菌生長(zhǎng)的影響2）pH值對(duì)谷氨酸積累的影響發(fā)酵液的pH影響微生物的生長(zhǎng)和代謝途徑。發(fā)酵前期如果pH偏低，則菌體生長(zhǎng)旺盛，長(zhǎng)菌而不產(chǎn)酸；如果pH偏高，則菌體生長(zhǎng)緩慢，發(fā)酵時(shí)間拉長(zhǎng)。在發(fā)酵前期將pH值控制在7.5~8.0左右較為合適。而在發(fā)酵中、后期將pH值控制在7.0~7.6左右對(duì)提高谷氨酸產(chǎn)量有利。（3）通風(fēng)在谷氨酸發(fā)酵過(guò)程中，發(fā)酵前期以低通風(fēng)量為宜；發(fā)酵中、后期以高通風(fēng)量為宜。實(shí)際生產(chǎn)上，以氣體轉(zhuǎn)子流量計(jì)來(lái)檢查通氣量，即以每分鐘單位體積的通氣量表示通風(fēng)強(qiáng)度。另外發(fā)酵罐大小不同，所需攪拌轉(zhuǎn)速與通風(fēng)量也不同。

（4）

泡沫的控制在發(fā)酵過(guò)程中由于強(qiáng)烈的通風(fēng)和菌體代謝產(chǎn)生的CO2，使培養(yǎng)液產(chǎn)生大量的泡沫，不僅使氧在發(fā)酵液中的擴(kuò)散受阻，影響菌體的呼吸和代謝。給發(fā)酵帶來(lái)危害，必須加以消泡。消泡方法：機(jī)械消泡(耙式、離心式、刮板式、蝶式消泡器)化學(xué)消泡(天然油脂、聚酯類(lèi)、醇類(lèi)、硅酮等)（5）

發(fā)酵時(shí)間不同的谷氨酸產(chǎn)生菌對(duì)糖的濃度要求也不一樣，其發(fā)酵時(shí)間也有所差異。低糖(10%~12%)發(fā)酵，其發(fā)酵時(shí)間為36~38h，中糖(14%)發(fā)酵，其發(fā)酵時(shí)間為45h。五、谷氨酸發(fā)酵工藝整個(gè)過(guò)程可簡(jiǎn)單的分為2個(gè)階段:1.菌體生長(zhǎng)階段;2.產(chǎn)酸階段,谷氨酸得以大量積累。發(fā)酵過(guò)程參數(shù)測(cè)定還原糖的測(cè)定谷氨酸的測(cè)定菌體形態(tài)觀察菌體濃度測(cè)定發(fā)酵過(guò)程參數(shù)的控制OD值pH溫度攪拌速度發(fā)酵發(fā)酵液冷卻接種三角瓶培養(yǎng)固體斜面培養(yǎng)上罐實(shí)消培養(yǎng)基的配制谷氨酸發(fā)酵的工藝流程簡(jiǎn)圖1.菌種擴(kuò)大培養(yǎng)斜面培養(yǎng)→一級(jí)種子培養(yǎng)→二級(jí)種子培養(yǎng)→發(fā)酵（1）斜面培養(yǎng)菌種都是需氧微生物，都需要以生物素為生長(zhǎng)因子。斜面培養(yǎng)基蛋白胨牛肉膏氯化鈉pH7.0~7.2瓊脂在32℃培養(yǎng)18～24h經(jīng)質(zhì)量檢查合格，即可放冰箱保存?zhèn)溆?。?）一級(jí)種子培養(yǎng)培養(yǎng)基葡萄糖玉米漿尿素磷酸氫二鉀硫酸鎂硫酸鐵硫酸錳pH6.5～6.8在32℃培養(yǎng)12h，如無(wú)雜菌與噬菌體感染，質(zhì)量達(dá)到要求，即可貯于4℃冰箱備用。以1000mL三角瓶裝液體培養(yǎng)基200～250mL進(jìn)行振蕩培養(yǎng)。（3）二級(jí)種子培養(yǎng)二級(jí)種子用種子罐培養(yǎng)，料液量為發(fā)酵液投料體積的1％，培養(yǎng)基組成和一級(jí)種子相仿，主要區(qū)別是用水解糖代替葡萄糖，一般于32℃下進(jìn)行通氣培養(yǎng)7～10h經(jīng)質(zhì)量檢查合格即可移種（或冷卻至10℃?zhèn)溆茫７N子質(zhì)量要求，首先是無(wú)雜菌及噬菌體感染，在這個(gè)基礎(chǔ)上進(jìn)一步要求菌體大小均勻，呈單個(gè)或八字形排列。二級(jí)種子培養(yǎng)結(jié)束時(shí)還要求活菌數(shù)為108～109個(gè)細(xì)胞/mL。3.谷氨酸發(fā)酵發(fā)酵初期，即菌體生長(zhǎng)的遲滯期，糖基本沒(méi)有利用，尿素分解放出氨使pH值略有上升。一般為2～4h。接著進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，代謝旺盛，糖耗快，尿素大量分解，pH值很快上升，但隨著氨被利用pH值又下降；溶氧濃度急劇下降，然后又維持在一定水平上；菌體濃度（OD值）迅速增大，菌體形態(tài)為排列整齊的八字形。這個(gè)時(shí)期，為了及時(shí)供給菌體生長(zhǎng)必需的氮源及調(diào)節(jié)培養(yǎng)液的pH值至7.5～8.0，必須流加尿素；又由于代謝旺盛，泡沫增加并放出大量發(fā)酵熱，故必須進(jìn)行冷卻，使溫度維持30～32℃。菌體繁殖的結(jié)果，菌體內(nèi)的生物素含量由豐富轉(zhuǎn)為貧乏。這個(gè)階段主要是菌體生長(zhǎng)，幾乎不產(chǎn)酸，一般為12h左右。3.谷氨酸發(fā)酵當(dāng)菌體生長(zhǎng)基本停滯就轉(zhuǎn)入谷氨酸合成階段，此時(shí)菌體濃度基本不變，糖與尿素分解后產(chǎn)生的α－酮戊二酸和氨主要用來(lái)合成谷氨酸。這一階段，為了提供谷氨酸合成所必需的氨及維持谷氨酸合成最適的pH7.2～7.4，必須及時(shí)流加尿素，又為了促進(jìn)谷氨酸的合成需加大通氣量，并將發(fā)酵溫度提高到谷氨酸合成最適的溫度34～37℃。發(fā)酵后期，菌體衰老、糖耗緩慢、殘?zhí)堑?，此時(shí)流加尿素必須相應(yīng)減少。當(dāng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)耗盡酸濃度不再增加時(shí)，需及時(shí)放罐，發(fā)酵周期一般為30多小時(shí)。4.谷氨酸提取從谷氨酸發(fā)酵液中提取谷氨酸的方法，一般有等電點(diǎn)法、離子交換法、金屬鹽沉淀法、鹽酸鹽法和電滲析法，以及將上述某些方法結(jié)合使用的方法。發(fā)酵液↓起晶中和點(diǎn)pH4～4.5↓育晶2h↓等電攪拌pH3～3.22↓靜置沉淀4～6h↓離心分離↓谷氨酸200波美鹽酸母液菌體及細(xì)小的谷氨酸（1）等電點(diǎn)法操作方便，設(shè)備簡(jiǎn)單，一次收率達(dá)