川白萸中3種香豆素含量測定

川白萸中3種香豆素含量測定

白鼠尾是一門辯證的學科，具有知縣和蕭山的作用。ethook.f.或杭州慈海a.dahuric（f.a.）尚胡姆，ethook.f.var.var.m（boiss.）shan和yuan的干燥根具有解外寒、驅風止痛、通鼻、除濕、止痛、排膿等功效。白芷作為常用中藥收載于《中國藥典》2010年版一部,定量指標僅歐前胡素一項。異歐前胡素、氧化前胡素也是白芷中的主要活性成分且含量較高,應同時作為其質量控制的指標才更具合理性。雖然有文獻報道采用HPLC測定白芷中歐前胡素、異歐前胡素、氧化前胡素的含量,但由于缺乏其中的對照品及分析成本過高等原因,限制了多指標成分進行質量控制的外標法的實際應用?！耙粶y多評”法作為一種對多指標質量控制的有效方法,克服了對照品短缺這一問題,即只測定某個代表性成分(易得、廉價、有效),同時可計算出其他待測有效成分的含量,是一種適合中藥特點的多指標質量評價的新模式。本實驗以歐前胡素對照品作為內標物,建立其與氧化前胡素、異歐前胡素的相對校正因子進行含量計算,并考察方法耐用性及系統(tǒng)適用性,以探討“一測多評”法在川白芷多指標質量控制中應用的適用性及可行性。1藥品、化學品與藥品Agilent1100高效液相色譜儀,Agilentchemstation工作站(美國安捷倫公司);ShimadzuLC-20A高效液相色譜儀,LCsolution工作站(日本島津公司);KQ-100型數(shù)控超聲機(昆山市超聲儀器有限公司)。對照品歐前胡素、異歐前胡素均購自中國藥品生物制品檢定所,批號分別為110826-200712,110827-201008,氧化前胡素為實驗室自制,HPLC(面積歸一化法)測定純度>98.5%。甲醇為色譜純,水為高純水,其余試劑均為分析純。川白芷藥材均采自主產地四川省遂寧市、達州市的不同區(qū)域,共20批,經成都中醫(yī)藥大學張藝研究員鑒定為傘形科植物杭白芷A.dahuricavar.formosana的干燥根。2結果與分析2.1方法研究2.1.1流動相-水法DikmaDiamonsilC18色譜柱(4.6mm×250mm,5μm);流動相甲醇(A)-水(B),梯度洗脫0~5min,55%~65%A;5~12min,65%A;12~30min,65%~83%A;流速1.0mL·min-1;柱溫30℃,檢測波長250nm。上述色譜條件下,各組分分離度良好,見圖1。2.1.2混合對照品溶液精密稱取歐前胡素、異歐前胡素、氧化前胡素適量,加甲醇制成質量濃度分別為0.133,0.042,0.127g·L-1的混合對照品溶液。2.1.3超聲強化處理取藥材粉末(過40目篩)約1g,精密稱定,置于50mL錐形瓶,精密加入甲醇25mL,稱重,超聲處理40min,放冷,用甲醇補重,搖勻,濾過,取續(xù)濾液經0.45μm濾膜濾過,即得。2.1.4進樣分析精密吸取上述混合對照品溶液2,5,10,15,20μL,進樣分析,每個濃度進樣3次,取平均值。以進樣量對峰面積積分值進行回歸處理,得歐前胡素、異歐前胡素、氧化前胡素的回歸方程,結果表明各化合物在相應范圍內線性關系良好,見表1。2.1.5采用回歸因子計算以歐前胡素為內標,按公式,計算歐前胡素對異歐前胡素、氧化前胡素的相對校正因子,結果見表2。2.1.6儀器精密度試驗精密吸取同一混合對照品溶液10μL,連續(xù)進樣6次,記錄歐前胡素、異歐前胡素、氧化前胡素的峰面積,其峰面積的RSD分別為1.2%,2.5%,0.94%,表明儀器精密度良好。2.1.7樣品穩(wěn)定性試驗分別于配制后的0,1,2,4,8,24h,精密吸取同一供試品溶液10μL進樣測定峰面積,歐前胡素、異歐前胡素、氧化前胡素穩(wěn)定性的RSD分別為1.2%,2.9%,1.1%,表明處理后的樣品在24h內穩(wěn)定。2.1.8重復性實驗結果取同一批藥材粉末(40目)約1g,共6份,精密稱定,按2.1.3項方法制備樣品,測定歐前胡素、異歐前胡素、氧化前胡素的平均含量分別為2.644,0.7733,2.669mg·g-1,RSD分別為1.4%,1.6%,1.9%,表明該方法重復性良好。2.1.9加樣回收率試驗取同一批已知含量的樣品粉末約0.5g,精密稱定,平行6份,分別精密加入一定量的混合對照品溶液,按2.1.3項下方法制備供試品溶液,測定并計算各成分的加樣回收率及RSD,結果見表3。2.2重建因子的再現(xiàn)研究2.2.1相對校正因子的確定取2.1.2項下混合對照品溶液,進樣2,5,10,15,20μL測定,按2.1.5項下計算歐前胡素對異歐前胡素、氧化前胡素的相對校正因子。實驗考察了Agilent1200,ShimadzuLC-20A2種高效液相色譜系統(tǒng),DikmaDiamonsilC18(4.6mm×250mm,5μm),DikmaPlatisilODS(4.6mm×250mm,5μm),PhenomenexLunaC18(4.6mm×250mm,5μm),PhenomenexGeminiC18(4.6mm×250mm,5μm),WatersRP18(4.6mm×250mm,5μm)5種色譜柱,相對校正因子的RSD<0.8%,說明相對校正因子在不同色譜柱和儀器下的耐用性較好,見表4。采用建立的“一測多評”試驗方法在2個實驗室進行試驗,采用DikmaDiamonsilC18色譜柱(4.6mm×250mm,5μm),結果見表5。不同實驗室測得的相對校正因子相差不大RSD<0.6%,說明該方法耐用性較好。2.3組分色譜峰的定位通過保留時間差、相對保留值結合各組分的紫外吸收特征進行待測組分色譜峰的定位,結果見表6。由表6可知,各待測成分的相對保留值RSD≤5.0%,保留時間差則差異較大,通過相對保留值結合各色譜峰的紫外吸收特征,可正確判斷出目標峰的準確峰位置。2.4外標和外標兩種方法所需藥材組分含量的對比精密吸取供試品溶液10μL注入高效液相色譜儀,測定。采用“一測多評”法與外標一點法計算川白芷中歐前胡素、異歐前胡素、氧化前胡素的含量,結果均以干燥品計,見表7。結果顯示,2種方法所得的各批次藥材的含量不存在顯著性差異。由此說明“一測多評”法應用于川白芷的多成分質量評價是可行的。3檢測波長的確定以甲醇為溶劑,比較超聲、回流提取2種方法,結果超聲提取效果更好?？疾炝思状肌⒁颐?種溶劑對川白芷中3種香豆素的提取效率的影響,乙醚更易于揮發(fā)對提取結果影響較大,故選擇甲醇。以甲醇為溶劑,分別超聲30,40,50min,結果40,50min均較30min提取完全,40,50min差異不大,故確定以甲醇超聲提取40min,3種香豆素提取率較高,分離度較好,干擾的雜質峰較少,且方法簡單,成本較低。對歐前胡素、氧化前胡素及異歐前胡素進行全波長掃描,其紫外吸收峰相似,均在250nm處有最大吸收,故選擇250nm為檢測波長。為了驗證所建立的3種香豆素成分的一測多評法的適用性及可行性,進行了方法學考察,方法耐用性以及系統(tǒng)適應性試驗。通過在Agilent和Shimadzu2臺液相色譜儀,5根不同品牌及型號的色譜柱以及2個不同實驗室的考察,結果表明歐前胡素與氧化前胡素、異歐前胡素之間的相對校正因子具有