食用菌的菌種生產(chǎn)

第二章食用菌菌種生產(chǎn)第一節(jié)菌種生產(chǎn)的基本設(shè)備第二節(jié)培養(yǎng)基的配制第三節(jié)消毒與滅菌第四節(jié)接種與培養(yǎng)第五節(jié)菌種的分離主要內(nèi)容重點1.培養(yǎng)基的配制2.消毒滅菌的一般方法3.無菌操作技術(shù)4.菌種轉(zhuǎn)接擴(kuò)繁技術(shù)難點1.菌種分離方法重點難點一、接種設(shè)備（一）接種室（二）接種箱（三）超凈工作臺（四）接種工具（五）酒精燈二、培養(yǎng)設(shè)備三、滅菌設(shè)備第一節(jié)菌種生產(chǎn)的基本設(shè)備（一）接種室

一、接種設(shè)備（二）接種箱（三）超凈工作臺（四）接種工具（五）酒精燈培養(yǎng)室二、培養(yǎng)設(shè)備恒溫培養(yǎng)箱高壓滅菌鍋三、滅菌設(shè)備手提式大型高壓滅菌鍋常壓滅菌鍋常壓滅菌鍋一、培養(yǎng)基1.概念：培養(yǎng)基是采用人工的方法，按照一定比例配制各種營養(yǎng)物質(zhì)，以供給食用菌生長繁殖的基質(zhì)。第二節(jié)培養(yǎng)基的配制類

型天然：天然有機(jī)物

合成：已知成分的化學(xué)藥品

半合成：？原料

來源狀態(tài)液體：營養(yǎng)液固體固體：天然固體原料

固化：加1.5%~2%瓊脂表面形狀斜面培養(yǎng)基平板培養(yǎng)基2.種類（物理性質(zhì)）：

液體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基固化培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基優(yōu)點是營養(yǎng)分布均勻，有利于菌絲吸收，理化條件易控制，便于機(jī)械化操作；菌絲生長迅速，產(chǎn)量高。固體培養(yǎng)基優(yōu)點是原材料廣泛價格低廉，配制容易。固化培養(yǎng)基是指將各種營養(yǎng)物質(zhì)按比例配成營養(yǎng)液后，再加入適量的凝固劑，冷卻后凝固。3.種類（營養(yǎng)物質(zhì)種類）天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基、半合成培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基的優(yōu)點是來源廣、價格便宜、營養(yǎng)豐富但不能用之進(jìn)行精密的科學(xué)實驗合成培養(yǎng)基成分清楚、重復(fù)性強、但價格較貴半合成培養(yǎng)基既有天然成分，又有無機(jī)鹽類，是食用菌生產(chǎn)中常用的培養(yǎng)基。培養(yǎng)基配制三原則：一、含有該菌生長發(fā)育所必需的營養(yǎng)物質(zhì)，且濃度配比要合理二、具有一定的生長環(huán)境三、必須經(jīng)過嚴(yán)格的滅菌二、培養(yǎng)基配制的一般原則三、常用培養(yǎng)基及配制方法

（一）母種培養(yǎng)基1.常用母種培養(yǎng)基配方馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基）：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，水1000ml。馬鈴薯綜合培養(yǎng)基：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，磷酸二氫鉀3g，硫酸鎂1.5g，維生B110mg，水1000ml。2.母種培養(yǎng)基的制作方法稱量調(diào)配馬鈴薯去皮切成小塊，加水煮沸30分鐘左右，過濾取汁加糖、瓊脂及其它營養(yǎng)pH測定與調(diào)整趁熱分裝試管，裝入試管的量為試管的1/5—1/4高度塞好棉塞，每7個捆成一捆，棉塞部位用牛皮紙或報紙包好滅菌擺斜面返回本節(jié)（二）原種和栽培種培養(yǎng)基1.培養(yǎng)基配方1）木屑培養(yǎng)基：闊葉樹鋸末78%，米糠或麩皮20%，石膏粉1%，蔗糖1%，加水至含水量50%－60%。2）棉子殼培養(yǎng)基：谷粒（玉米、麥粒等）1000克，石膏粉13克，碳酸鈣4克。2.培養(yǎng)基制作稱重拌料裝袋滅菌栽培種的裝袋返回本節(jié)第三節(jié)消毒與滅菌一、消毒與滅菌的概念消毒：用物理或化學(xué)的方法，殺死物料中、物體表面及環(huán)境中的一部分微生物，即一般以殺死有害微生物為目的，而不能殺死微生物的休眠體（細(xì)菌芽孢）。滅菌：用物理或化學(xué)的方法殺滅或除掉物料或設(shè)備中所有的有生命的有機(jī)體。二滅菌與消毒的方法1、常用的滅菌方法火焰滅菌用于金屬器具，火焰灼燒至紅（在火焰2/3處燒）干燥箱滅菌用于玻璃器皿（培養(yǎng)皿、試管、三角瓶、吸管）等。洗凈

晾干

包裝

放入干燥箱

升溫

160～170℃，保持1～2h

關(guān)閉電源，自然降溫

60℃以下打開干燥箱

取出滅菌物品，盡快使用。干熱滅菌濕熱滅菌常壓滅菌間歇滅菌第一次蒸，100℃保持1h

28-37℃下培養(yǎng)24h

第二次蒸，100℃，保持1h

培養(yǎng)24h

第三次蒸，100℃，保持1h。不常用的原因：滅菌一鍋需要3～4天時間，且冬天需要保溫。持續(xù)滅菌蒸，100℃保持12～14h（方法：攻頭，控中間，保尾）。普遍采用，特別用于大規(guī)模塑料袋制種和塑料栽培筒的滅菌。注意：常壓滅菌鍋要設(shè)計合理，主要是滅菌徹底與否、燃料費用、周轉(zhuǎn)速度、勞動強度、污染率的高低，直接影響經(jīng)濟(jì)效益。高壓滅菌手提式高壓滅菌鍋：用于一級菌種培養(yǎng)基滅菌。臥式或立式高壓滅菌鍋：用于二、三級菌種培養(yǎng)基滅菌。2、常用的消毒方法空間消毒藥液噴霧藥劑薰蒸紫外線照射0.25%的新潔爾滅，5%的石碳酸，0.25%的多菌靈等。用量不小于30ml/m3；霧粒越細(xì)越好；適時更換藥液（防止抗藥性）。10～20ml的甲醛+5～8g的高錳酸鉀/m3；氣霧消毒盒，2～6g/m3；照30min后，再過30min開照明燈器具消毒藥液浸泡煮沸消毒75%的酒精；藥物揩擦煮沸20min以上培養(yǎng)料消毒熟石灰拌料；殺菌劑拌料（0.1%~0.2%的多菌靈）；巴氏消毒（發(fā)酵）分離材料消毒75%的酒精棉球擦拭；0.1%升汞浸泡0.5~1min

無菌水沖洗3次

無菌紙吸干超凈工作臺紫外照射、酒精擦拭接種設(shè)備燒灼培養(yǎng)設(shè)備硫酸銅與石灰配制的波爾多液常用作菇房及床架的消毒。使用時用噴霧器噴灑，隨配隨用；福爾馬林、來蘇兒等常用于接種室、接種箱、培養(yǎng)室、栽培房等空間或地面的消毒。三、儀器設(shè)備滅菌四、母種培養(yǎng)基的滅菌

1．滅菌設(shè)備手提式高壓滅菌鍋

2．滅菌要求

1.1kg/cm2，121℃

保持20~30min手提式高壓滅菌鍋3．操作過程加水

裝鍋

蓋蓋

加熱

當(dāng)壓力升為0.5kg/cm2時排放冷空氣

正式升壓

保壓（1.1kg/cm2，121℃，保持20-30min）

停止加熱

自然降壓至零

排放余汽

開蓋

取出滅菌物品

趁熱擺斜面

檢驗滅菌效果（32℃空白培養(yǎng)48h）。（二）二、三級菌種培養(yǎng)基的滅菌

1．滅菌方法及要求

高壓蒸汽滅菌：壓力1.5kg/cm2，溫度126-128℃，時間1-2h（谷粒和經(jīng)過堆制發(fā)酵的糞草培養(yǎng)基應(yīng)達(dá)到2-2.5h）。

常壓蒸汽滅菌：100℃，保持10-12h（攻頭，控中，保尾）臥式高壓蒸汽滅菌鍋2．滅菌效果檢驗隨機(jī)取幾瓶（袋）置于25-30℃溫度下空白培養(yǎng)4-6天，會出現(xiàn)以下情況：全部感雜少數(shù)感雜全部沒有雜菌

3、高壓蒸汽滅菌鍋的使用方法

示范操作！分析原因？菌種擔(dān)孢子或子囊孢子野生擴(kuò)大繁殖后的純次生菌絲體栽培來歷野生菌馴化

原菌株改良

生物技術(shù)創(chuàng)新優(yōu)良

菌株擴(kuò)大

繁殖用于

生產(chǎn)實行純培養(yǎng)

不含任何雜菌基本

要求第四節(jié)接種與培養(yǎng)

二、菌種類型一級菌種二級菌種

三級菌種級別按保藏用種實驗用種

生產(chǎn)用種目的狀態(tài)：固體菌種、液體菌種（一）級別不同的菌種1.一級種（母種）用分離法首次得到的

純次生菌絲體

概念概況培養(yǎng)環(huán)境試管、斜面培養(yǎng)基用途再生母種擴(kuò)大原種

保藏用種菌絲弱而少、不可直接栽培特點2.二級種（原種）母種擴(kuò)大至粗放培養(yǎng)基上形成的菌種概念概況培養(yǎng)環(huán)境菌絲較多而壯、適應(yīng)性較強特點用途擴(kuò)大栽培種大口瓶、較粗放的

液體或固體培養(yǎng)基3.三級種（栽培種）將原種擴(kuò)大至粗放培養(yǎng)基上

由二級菌種擴(kuò)大繁殖成的菌絲體，是直接用于栽培的菌種。概念概況培養(yǎng)環(huán)境菌絲多而壯、適應(yīng)性強特點用途栽培生產(chǎn)菌種袋、較粗放的

液體或固體培養(yǎng)基不可再擴(kuò)三者之間的關(guān)系菌種類型制種容器培養(yǎng)基菌株來源用途要求一級菌種（試管種、母種）試管PDA、PSA種菇（孢子或菌肉組織）擴(kuò)制二級種菌種保藏純度高，質(zhì)量好，絕對無雜菌二級菌種（原種）菌種瓶固體培養(yǎng)基一級菌種擴(kuò)制三級菌種純度高，質(zhì)量好，無雜菌三級菌種（栽培種）罐頭瓶、菌種袋固體培養(yǎng)基二級菌種用于栽培高純度，高質(zhì)量，無雜菌（二）狀態(tài)不同的菌種

用固體基質(zhì)培養(yǎng)的菌種1.固體

菌種概念特點設(shè)備、工藝簡單

菌齡長而不一

發(fā)酵率較低用液體基質(zhì)培養(yǎng)的菌種2.液體

菌種概念特點設(shè)備、工藝較復(fù)雜

菌齡短而一致

發(fā)酵率高

易老化和自溶生長勢的區(qū)別液體菌種固體菌種菌種生產(chǎn)流程種菇一級菌種二級菌種三級菌種栽培菌種為何要經(jīng)過三級逐步擴(kuò)大培養(yǎng)？三、菌種生產(chǎn)工藝流程斜面一級種培養(yǎng)基制備高壓滅菌接種培養(yǎng)篩選提純原始種鑒定后確定一級種保存孢子或組織分離一級種轉(zhuǎn)管、擴(kuò)大菌種瓶二級種培養(yǎng)基制備高壓滅菌接種培養(yǎng)二級菌種罐頭瓶菌種袋三級種培養(yǎng)基制備高壓或常壓滅菌接種三級菌種栽培培養(yǎng)菌種制作流程一級菌種（配制培養(yǎng)基→滅菌→接種→培養(yǎng)）↓二級菌種（配制培養(yǎng)基→滅菌→接種→培養(yǎng)）↓三級菌種（配制培養(yǎng)基→滅菌→接種→培養(yǎng)）↓栽培二、接種工具及用品接種環(huán)、接種針、接種鋤、鑷子、酒精、藥棉、酒精燈、火柴，廢液缸、記號筆。三、接種前準(zhǔn)備接種工具和培養(yǎng)基應(yīng)提前放入接種箱內(nèi)；紫外燈照射20-30min；關(guān)閉紫外20分鐘后再進(jìn)行接種。第四節(jié)接種與培養(yǎng)一支試管可以擴(kuò)繁為20－30支試管四、一級菌種制作流程1．概念一級菌種是第一次用孢子分離法、組織分離法或基內(nèi)菌絲分離法獲得的純菌絲體及其經(jīng)過轉(zhuǎn)管擴(kuò)大后的菌絲體。2．用途及要求一級菌種是菌種生產(chǎn)的基礎(chǔ)，一級菌種質(zhì)量的優(yōu)劣，直接關(guān)系到二級菌種和三級菌種的質(zhì)量，對食用菌生產(chǎn)產(chǎn)生根本的影響。3、制種過程：主要包括下列幾個程序：培養(yǎng)基的配制

培養(yǎng)基的滅菌

菌種的分離

純化（提純）

轉(zhuǎn)管擴(kuò)大

培養(yǎng)

一級菌種五、一級菌種轉(zhuǎn)管及培養(yǎng)轉(zhuǎn)管過程取直徑3-5mm的母種塊移入新斜面中部轉(zhuǎn)管目的擴(kuò)大繁殖，增加母種數(shù)量，以滿足生產(chǎn)需要注意種塊勿太大原老種塊勿再接入傳代次數(shù)勿太多母種培養(yǎng)設(shè)備注意條件經(jīng)常檢查，及時剔除污染管控制菌齡（即將長滿斜面）外觀檢查：菌絲白、整齊、粗壯、有彈性、萌發(fā)快則質(zhì)量好，否則質(zhì)量差電熱恒溫培養(yǎng)箱25℃左右、干凈、干燥、黑暗、通風(fēng)六、二、三級菌種制作配制培養(yǎng)基滅菌二級菌種培養(yǎng)接種培養(yǎng)接種滅菌配制培養(yǎng)基三級菌種一級菌種二級菌種（一）制作流程(二、三級菌種制作過程大同小異)一支試管可以擴(kuò)繁為五瓶原種（二）二、三級菌種的接種概念：菌種移至新培養(yǎng)基上的過程

關(guān)鍵：無菌操作接種接種環(huán)境消毒滅菌酒精棉球消毒雙手操作器具消毒滅菌開啟的管口、瓶口靠近燈焰拔出的棉塞勿觸及任何地方動作快、準(zhǔn)、穩(wěn)無菌操作要點接種方法二級種三級種用接種耙取蠶豆大母種放于瓶中料面上用接種匙（鑷、鏟）取棗大原種放于袋中或瓶中料面上注意：1、嚴(yán)格挑選待接的菌種質(zhì)量；

2、勿接入表面老菌絲及老種塊。（三）二、三級菌種的培養(yǎng)菌種的培養(yǎng)實際就是對菌絲體的培養(yǎng)培養(yǎng)條件場所清潔空氣清新光線暗溫度約25℃空氣濕度60%~70%培養(yǎng)條件勿堆放過擠及時剔除污染瓶（袋）栽培種的菌袋缺氧時可刺孔增氧控制菌齡（菌絲長滿7-01天后使用）一瓶原種可以接30－40瓶栽培種第五節(jié)菌種的分離一、菌種分離的概念

菌種分離：用無菌操作的方法將所需要的食用菌從混雜的微生物群體中單獨分離出來的過程。通過菌種分離得到的純菌絲體即為一級菌種。

二、菌種分離的關(guān)鍵——無菌操作

無菌操作：任何一個操作過程都要注意避免把其它任何無關(guān)的菌體帶入到培養(yǎng)基中。

注意二點：1．嚴(yán)格樹立無菌觀念；

2．嚴(yán)格遵循無菌操作規(guī)程。三、菌種分離的方法（常用三種）組織分離法將食用菌的部分組織移接到斜面培養(yǎng)基上獲得純培養(yǎng)的方法簡單易行保持原菌種性狀適用于大型肉質(zhì)子實體重復(fù)多易退化種菇選擇→種菇消毒→切取組織塊→移接組織塊至斜面中央→培養(yǎng)特點概念操作過程（以傘菌為例）操作示范選種菇外觀典型、大小適中、無病蟲害、