23-重組DNA技術(shù)（基因工程）課件

重組DNA技術(shù)（基因工程）基因工程基因工程的風(fēng)險(xiǎn)和倫理學(xué)問(wèn)題23-重組DNA技術(shù)（基因工程）基因工程基因工程概述基因工程的相關(guān)技術(shù)基因工程的工具酶載體基因工程的基本步驟基因工程的應(yīng)用23-重組DNA技術(shù)（基因工程）基因工程的概念

geneticengineering基因工程一般可分為廣義和狹義的兩種。廣義的基因工程包括：整體水平，如生物的有性雜交；細(xì)胞水平，如細(xì)胞融合；分子水平，染色體工程、基因克隆等。狹義的基因工程即是通常講的基因克隆。目的:

是生產(chǎn)出符合人類需要的產(chǎn)品或創(chuàng)造出生物的新性狀，并能穩(wěn)定遺傳。23-重組DNA技術(shù)（基因工程）基因工程的概念

geneticengineering定義：又稱為重組DNA技術(shù)，指將某些特定的基因或DNA片斷，通過(guò)載體或其它手段送入受體細(xì)胞，使它們?cè)谑荏w細(xì)胞中增殖并表達(dá)的一種遺傳學(xué)操作。基因工程是采用分子生物學(xué)、核酸生物化學(xué)以及微生物遺傳學(xué)的現(xiàn)代方法和手段建立起來(lái)的基因操作技術(shù)。23-重組DNA技術(shù)（基因工程）基因工程重要特征：可把來(lái)自任何生物的基因轉(zhuǎn)移到與其毫無(wú)關(guān)系的任何其他受體細(xì)胞中，可以任意改造生物的遺傳特性，創(chuàng)造出生物的新性狀某一段DNA可在受體細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制，為制備大量純化的DNA片段提供了可能23-重組DNA技術(shù)（基因工程）基因工程技術(shù)路線DNA片段的取得（目的基因的分離和制備）DNA片段和載體的連接——重組體DNA外源DNA片段引入受體細(xì)胞——基因克隆和基因文庫(kù)篩選目的克隆基因表達(dá)與產(chǎn)物分離23-重組DNA技術(shù)（基因工程）23-重組DNA技術(shù)（基因工程）基因工程的相關(guān)技術(shù)核酸的分子雜交聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction):PCR和RT-PCR(reversetranscriptionPCR)23-重組DNA技術(shù)（基因工程）核酸的分子雜交

Southernblot-DNANorthernblot-RNAInsituhybridizationFluorescentInsituhybridization23-重組DNA技術(shù)（基因工程）Southernblot

23-重組DNA技術(shù)（基因工程）Northernblot23-重組DNA技術(shù)（基因工程）analysisofBLTRmRNA23-重組DNA技術(shù)（基因工程）TracingandAssayingMoleculesInsideCellsInsituhybridizationforRNAlocalizationintissues.23-重組DNA技術(shù)（基因工程）FluorescentInsituhybridization23-重組DNA技術(shù)（基因工程）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction，PCR)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是體外快速擴(kuò)增DNA的方法

PCR反應(yīng)包括三個(gè)步驟：變性(denature)：在94-95℃使模板DNA的雙鏈變性成單鏈低溫退火(annealing)：兩個(gè)引物分別與單鏈DNA互補(bǔ)復(fù)性延伸(extension)：在引物的引導(dǎo)及Taq酶的作用下，于72℃合成模板DNA的這三個(gè)步驟稱為一個(gè)循環(huán)，PCR反應(yīng)常有25-35個(gè)循環(huán)23-重組DNA技術(shù)（基因工程）23-重組DNA技術(shù)（基因工程）23-重組DNA技術(shù)（基因工程）RT-PCR23-重組DNA技術(shù)（基因工程）23-重組DNA技術(shù)（基因工程）23-重組DNA技術(shù)（基因工程）限制性內(nèi)切核酸酶限制性內(nèi)切核酸酶或限制性酶(restrictionenzymes)是細(xì)菌中這些酶的功能是降解外來(lái)DNA分子的一類酶。以限制(restriction)或阻止病毒侵染限制性酶據(jù)其作用特點(diǎn)，可分為兩類※第Ⅰ類限制性酶每隔一段DNA序列隨機(jī)切割雙鏈DNA分子，沒(méi)有序列特異性※第Ⅱ類限制性酶能識(shí)別一段特異的DNA序列，準(zhǔn)確地酶切雙鏈DNA的特異序列。第Ⅱ類限制性酶識(shí)別的序列是對(duì)稱的，即在一條鏈中從5’到3’方向的序列，與其互補(bǔ)鏈從5’到3’方向的序列完全相同。這種從兩個(gè)方向閱讀而序列相同的序列稱為回紋對(duì)稱序列(palindrome)23-重組DNA技術(shù)（基因工程）限制性內(nèi)切核酸酶23-重組DNA技術(shù)（基因工程）粘性末端平整末端23-重組DNA技術(shù)（基因工程）其它工具酶T4DNA連接酶(ligase)反轉(zhuǎn)錄酶（reversetranscriptase)23-重組DNA技術(shù)（基因工程）載體(vector)一個(gè)DNA片段只有與適合的載體(vector)DNA連接構(gòu)成重組DNA后，在載體DNA的運(yùn)載下，才可以高效率地進(jìn)入宿主細(xì)胞(hostcell)，并在其中復(fù)制、擴(kuò)增、克隆出多個(gè)拷貝?？勺鳛镈NA載體的有質(zhì)粒、噬菌體、病毒、細(xì)菌或酵母菌人工染色體（BAC、YAC）等23-重組DNA技術(shù)（基因工程）載體DNA分子，需要具備：具復(fù)制原點(diǎn)(ori)，在宿主細(xì)胞中不僅能獨(dú)立地自我復(fù)制，而且能帶動(dòng)攜帶的外源DNA片段一起復(fù)制具有多克隆位點(diǎn)(multiplecloningsite,MCS)，而每一種酶的切點(diǎn)只有一個(gè)，用于克隆外源DNA片段。這些酶切位點(diǎn)不存在于復(fù)制原點(diǎn)或抗性選擇標(biāo)記基因內(nèi)至少具有一個(gè)選擇標(biāo)記基因，使有或無(wú)載體的宿主細(xì)胞具有易鑒別的表型易從宿主細(xì)胞中回收。較小的相對(duì)分子量和較高的拷貝數(shù)安全性23-重組DNA技術(shù)（基因工程）載體(vector)的種類細(xì)菌質(zhì)粒載體λ噬菌體柯斯質(zhì)粒(cosmid)穿梭載體酵母人工染色體（yeastartificialchromosome，YAC）Ti質(zhì)粒23-重組DNA技術(shù)（基因工程）細(xì)菌質(zhì)粒載體◆質(zhì)粒是細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立于細(xì)菌染色體而自然存在的、能自我復(fù)制、易分離和導(dǎo)入的環(huán)狀雙鏈DNA分子☆這些質(zhì)粒的適應(yīng)范圍廣，拷貝數(shù)多。進(jìn)入宿主細(xì)胞復(fù)制后，每個(gè)細(xì)胞的質(zhì)?？截悢?shù)可高達(dá)1000個(gè)◆早期用于基因工程的載體是經(jīng)遺傳改良的細(xì)菌質(zhì)粒，它們僅能用于克隆分子量小于10kb(1000bp=1kb)的外源DNA片段☆現(xiàn)在廣泛使用且商品化的質(zhì)粒，很多都具有重組表型檢測(cè)標(biāo)記，在DNA克隆中根據(jù)宿主細(xì)胞的表型即可推知質(zhì)粒是否攜帶外源DNA片段23-重組DNA技術(shù)（基因工程）23-重組DNA技術(shù)（基因工程）23-重組DNA技術(shù)（基因工程）λ噬菌體◆λ噬菌體基因組全長(zhǎng)49kb。λ噬菌體DNA中間約三分之二的序列為中間基因簇，位于兩端的為DNA左、右臂。λ基因組的中間基因簇序列可被外源DNA片段取代,而不影響噬菌體感染細(xì)菌及形成噬菌斑的能力◆

λ噬菌體載體可接受15kb-23kb的外源DNA片段，它既可作為克隆載體，也可作為表達(dá)載體，在基因庫(kù)篩選中，λ噬菌體作載體與細(xì)菌質(zhì)粒相比，具有易操作、陽(yáng)性克隆數(shù)多等特點(diǎn)，現(xiàn)廣泛用于各類基因庫(kù)的構(gòu)建

23-重組DNA技術(shù)（基因工程）柯斯質(zhì)粒(cosmid)柯斯質(zhì)粒(cosmid)是利用部分λ噬菌體DNA與部分細(xì)菌質(zhì)粒DNA序列組建而成的具有λ噬菌體的cos序列(12bp)和細(xì)菌質(zhì)粒的復(fù)制原點(diǎn)。cos序列是噬菌體DNA包裝成噬菌體時(shí)所必需的，而質(zhì)粒的復(fù)制原點(diǎn)可使柯斯質(zhì)粒在細(xì)菌細(xì)胞中同普通細(xì)菌質(zhì)粒一樣自主復(fù)制?？山邮荛L(zhǎng)達(dá)50kb的外源DNA片段23-重組DNA技術(shù)（基因工程）穿梭載體是指能在兩種不同的生物中復(fù)制的載體。例如既能在原核生物(如大腸桿菌)中復(fù)制，又能在真核細(xì)胞(如酵母)中復(fù)制的載體不僅具有細(xì)菌質(zhì)粒的復(fù)制原點(diǎn)及選擇標(biāo)記基因，還有真核生物的自主復(fù)制序列以及選擇標(biāo)記性狀，具有多克隆位點(diǎn)穿梭載體23-重組DNA技術(shù)（基因工程）酵母人工染色體（yeastartificialchromosome，YAC）23-重組DNA技術(shù)（基因工程）根瘤細(xì)胞的形成是因?yàn)橥寥擂r(nóng)桿菌中存在著一種誘導(dǎo)瘤細(xì)胞(tumor-inducing,Ti)的質(zhì)粒，這種質(zhì)粒被稱為T(mén)i質(zhì)粒Ti質(zhì)粒的一部分DNA叫做轉(zhuǎn)移DNA(transferDNA,T-DNA)當(dāng)T-DNA整合到宿主植物細(xì)胞的染色體后，就誘導(dǎo)出根瘤，并使根瘤細(xì)胞合成冠癭堿(opine),作為土壤農(nóng)桿菌的碳源和氮源Ti質(zhì)粒23-重組DNA技術(shù)（基因工程）基因工程的基本步驟基因的獲得陽(yáng)性克隆的分析與鑒定目的基因與載體連接(DNA分子重組)目的基因?qū)胧荏w產(chǎn)品表達(dá)和純化23-重組DNA技術(shù)（基因工程）基因的獲得(一)從基因庫(kù)中分離基因◆大多數(shù)方法是利用一段核苷酸序列作探針(probe)，用放射性同位素或非放射性同位素標(biāo)記探針，也可用抗體作探針，篩選基因庫(kù)◆如菌斑雜交法(plaquehybridization)篩選λ噬菌體核基因庫(kù)(二)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增基因(三)人工合成基因(四)RT-PCR23-重組DNA技術(shù)（基因工程）陽(yáng)性克隆的分析與鑒定限制性酶圖譜23-重組DNA技術(shù)（基因工程）陽(yáng)性克隆的分析與鑒定核酸序列分析23-重組DNA技術(shù)（基因工程）目的基因與載體連接(DNA分子重組)23-重組DNA技術(shù)（基因工程）DNA分子重組23-重組DNA技術(shù)（基因工程）目的基因?qū)胧荏w23-重組DNA技術(shù)（基因工程）植物基因工程過(guò)程23-重組DNA技術(shù)（基因工程）小結(jié)23-重組DNA技術(shù)（基因工程）在基礎(chǔ)研究中的應(yīng)用在農(nóng)業(yè)和工業(yè)上的應(yīng)用在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用：基因工程用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)類藥物基因工程用于疫苗生產(chǎn)基因工程用于基因治療遺傳疾病診斷RFLP法基因工程的應(yīng)用23-重組DNA技術(shù)（基因工程）在農(nóng)業(yè)和工業(yè)上的應(yīng)用1.增加農(nóng)作物產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，如增加種子、塊莖的蛋白質(zhì)含量，改變植物蛋白的必需氨基酸比例等2.提高農(nóng)作物抗逆性能如：抗病蟲(chóng)害、抗旱、抗?jié)场⒖钩輨┑刃阅?.提高光合作用效率將是提高農(nóng)作物產(chǎn)量的一個(gè)有效方法4.生物固氮的基因工程。若能把禾谷等非豆科植物轉(zhuǎn)變?yōu)槟芡鼍采蚓吖痰芰?，將代替無(wú)數(shù)個(gè)氮肥廠23-重組DNA技術(shù)（基因工程）在農(nóng)業(yè)和工業(yè)上的應(yīng)用5.增加植物次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)率。植物次生代謝產(chǎn)物構(gòu)成全世界藥物原料的25%，如治療瘧疾的奎寧、治療白血病的長(zhǎng)春新堿、治療高血壓的東莨菪堿、作為麻醉劑的嗎啡等6.運(yùn)用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的技術(shù)，可培育畜牧業(yè)新品種7.“吃油”工程菌8.纖維素酶23-重組DNA技術(shù)（基因工程）不易腐爛的番茄動(dòng)物植物的遺傳改良抗蟲(chóng)植物化學(xué)農(nóng)藥兔毛棉花在我國(guó)培育成功：用兔的一種角蛋白轉(zhuǎn)化棉花，棉花纖維質(zhì)量好，具有兔毛般的光澤23-重組DNA技術(shù)（基因工程）抗蟲(chóng)棉花23-重組DNA技術(shù)（基因工程）Swissresearchershaveproducedricecapableofsynthesizingbeta-carotene,theprecursorofVitaminA(Yeetal.,2000).Thisricevarietyisnowbeingcrossedintoadaptedvarieties,withfieldtestspossibleinayearortwo.

Grapevinesaresusceptibletoseveraldiseasesthatreducetheamountandthequalityofwinegrapesandtablegrapesorevenkillthevine.Genesthatconferresistancetoparticulardiseaseswouldreducethecostofbattlingdiseasesinthevineyard.ResearchersattheUniversityofFloridahavepatentedamethodforproducinggrapevinesthatcarryasilkwormgenetoprovideprotectionfromPierce'sdisease,afatalbacterialdiseasethataffectsgrapesandseveralotherplants.23-重組DNA技術(shù)（基因工程）Improvednutritionalcontentanddelayedripeningaretransgenictraitsofinterestintomatoes.Source:USDACanolaisamajoroilseedcrop.TransgenicresearchhasfocusedonimprovingthenutritionalqualityofcanolaoilbyenhancingtheVitaminEcontentorbymodifyingthebalanceoffattyacids.Nicotine-freetobaccoisnowbeinggrownforaprojectedintroductionofnicotine-freecigarettes23-重組DNA技術(shù)（基因工程）Decaffeinatedcoffeeisnowmadebytreatingcoffeebeanstoremovethecaffeine.Othermethodsarecriticizedforremovingsomeofthedesirable,flavor-producingcomponentsalongwiththeundesirablecaffeine.PapayaisatropicalfruitrichinVitaminsAandC,butsusceptibletoanumberofseriouspestsanddiseases.ThetransgenicvarietyUHRainbow,resistanttothepapayaringspotvirus,iscurrentlyinproductioninHawaii.23-重組DNA技術(shù)（基因工程）Foodcropsengineeredtoproduceediblevaccinesagainstinfectiousdiseaseswouldmakevaccinationmorereadilyavailabletochildrenaroundtheworld.Whitemold(Sclerotinia)isaseriousproblemforsunflowerproducersinsomeareas.Resistancetothisdiseasewouldexpandtheareainwhichsunflowerscanbegrownandmightimproveyieldsinareasofcurrentcultivation.23-重組DNA技術(shù)（基因工程）Transgenicmice,10weeks,44gand29g轉(zhuǎn)基因動(dòng)物23-重組DNA技術(shù)（基因工程）人胰島素:從豬和牛的胰臟提取，獲得100g胰島素需800-1000kg的牛胰臟。現(xiàn)在用基因工程方法在大腸桿菌中表達(dá)產(chǎn)生人生長(zhǎng)激素:具有物種特異性，只能用人的生長(zhǎng)激素來(lái)治療侏儒癥。以前從尸體腦垂體中提取，來(lái)源非常有限，現(xiàn)在用基因工程方法在大腸桿菌中表達(dá)產(chǎn)生干擾素:體外培養(yǎng)人體細(xì)胞來(lái)生產(chǎn)，產(chǎn)量低，成本高，現(xiàn)用重組大腸桿菌生產(chǎn)在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用23-重組DNA技術(shù)（基因工程）23-重組DNA技術(shù)（基因工程）基因工程用于疫苗生產(chǎn)常用的制備疫苗的方法，一種是弱毒活疫苗，一種是死疫苗。兩種疫苗各有自身的弱點(diǎn)。活疫苗隱含著感染的危險(xiǎn)性。死疫苗免疫活性不高，需加大注射量或多次接種利用基因工程