微生物工程工藝與設(shè)備 層析分離技術(shù)及其設(shè)備

層析分離技術(shù)及其設(shè)備引言

1850年德國科學(xué)家朗格發(fā)現(xiàn)把有顏色的物質(zhì)滴到一張濾紙上，它們擴(kuò)散成一圈一圈的圓環(huán)。

1906年俄國植物學(xué)家茨維特（MichaelTswett）發(fā)現(xiàn)將碳酸鈣裝入玻璃柱，然后把石油醚抽提的植物葉子的色素溶液通入碳酸鈣柱，接著用石油醚洗滌，可在吸附柱上部出現(xiàn)了“色譜”，茨維特把他開創(chuàng)的方法叫色譜法

在這一方法中把玻璃管叫作“色譜柱”，碳酸鈣叫作“固定相”，純凈的石油醚叫作“流動相”。這是利用色譜方法為探究生命現(xiàn)象的啟蒙和開端。

德國的庫恩(Kuhn)等用層析法從維生素

B

中分離出

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6，由于他的出色研究而獲得了1938年的諾貝爾化學(xué)獎。

1941年，馬丁和辛格二位科學(xué)家首先把色譜法應(yīng)用于AA的分離方面。提出色譜塔板理論；發(fā)明液-液分配色譜；預(yù)言了氣體可作為流動相（即氣相色譜）。1938年：理查得·庫恩(RichardKuhn)德國人(1900－1967)對胡蘿卜素和維生素的研究

1952年：馬丁，辛格對分配層析的研究和發(fā)現(xiàn)，層析法的基本原理層析法是利用混合物中各組分物理化學(xué)性質(zhì)的差異（如吸附力、分子形狀及大小、分子親和力、分配系數(shù)等），使各組分在兩相（一相為固定的，稱為固定相；另一相流過固定相，稱為流動相）中的分布程度不同，從而使各組分以不同的速度移動而達(dá)到分離的目的。固定相：固定相是層析的一個基質(zhì)，其能與待分離的化合物進(jìn)行可逆的吸附，溶解，交換等作用。流動相：在層析過程中，推動固定相上待分離的物質(zhì)朝著一個方向移動的液體、氣體等，都稱為流動相。層析法的分類低壓層析技術(shù)中壓層析技術(shù)高壓層析技術(shù)——操作壓力在0.5MPa-5MPa之間——操作壓力在5Mpa-40MPa之間——操作壓力小于0.5MPa1.4層析的分類根據(jù)溶質(zhì)分子與固定相相互作用的機(jī)理不同的分類吸附層析離子交換層析親和層析凝膠過濾層析分配層析固定相是離子交換劑，各組份與離子交換劑作用力的不同各組份與固定相之間的吸附力的不同固定相只能與一種帶分離組分專一結(jié)合，以此可和其他組份分離固定相是多孔凝膠，分子量大小不同的組份，在凝膠上受的阻滯程度不同各組份在流動相和靜止液相（固相）中的分配系數(shù)不同

吸附層析吸附層析是利用吸附劑對不同物質(zhì)的吸附力不同而使混合物中的各組分分離的方法。吸附劑與被吸附物分子之間的相互作用是由可逆的范德華力所引起的，故在一定的條件下，被吸附物可以離開吸附劑表面，這稱為解吸作用。吸附層析就是通過連續(xù)的吸附和解吸附完成的。吸附層析在各種層析技術(shù)中應(yīng)用最早，由于吸附劑來源豐富，價格低廉，易再生，裝置簡單，又具有一定的分辯率等優(yōu)點(diǎn)，故至今仍廣泛使用。吸附柱層析將吸附劑填裝在玻璃或不銹鋼管中，構(gòu)成層析柱，層析時欲分離的樣品自柱頂加入，當(dāng)樣品溶液全部流入吸附層析柱后，再加入溶劑沖洗。沖洗的過程稱為洗脫，加入的溶劑稱為洗脫劑。吸附劑的選擇常用的吸附劑有極性的和非極性的兩種。

在實(shí)踐中不論選擇那種類型的吸附劑，都應(yīng)具備表面積大、顆粒均勻、吸附選擇性好、穩(wěn)定性強(qiáng)和成本低廉等性能。

一般來說，極性強(qiáng)的吸附劑易吸附極性強(qiáng)的物質(zhì)，非極性的吸附劑易吸附非極性的物質(zhì)。

但是為了便于解吸附，對于極性大的分離物，應(yīng)選擇極性小的吸附劑，反之亦然。

理想的吸附劑必需經(jīng)過多次試驗(yàn)才能獲得。

(二)洗脫滌的選擇

洗脫劑指的是溶解被吸附樣品和平衡固定相的溶劑。合適的洗脫劑應(yīng)符合下列條件：①純度較高；②穩(wěn)定性好；③能較完全洗脫所分離的成分；④黏度??；⑤易和所需要的成分分開。

在實(shí)踐中，選擇洗脫劑的順序是由極性小到極性大(正向?qū)游?。當(dāng)把極性小的洗脫劑換成極性大的時，宜先將極性大的和極性小的洗脫劑混合使用，濃度則由低到高?？傊x用洗脫劑的原則是能較完全地洗脫所要分離的成分，并力求用量少、洗脫時間短。柱層析的基本裝置離子交換層析是按分子電荷進(jìn)行分離的一種吸附色譜。它是基于不同蛋白分子暴露在外表面的側(cè)鏈基團(tuán)的種類和數(shù)量不同，故在一定的PH值和離子強(qiáng)度的緩沖液的所帶的電荷不同而完成分離。

蛋白質(zhì)電荷Overallchargeonprotein-+NH3RCOOH+NH3RCOO+-RNH2COO-acidisoelectricpoint alkalineexcesspositivechargebalancedpositiveandnegativechargeexcessnegativechargeTheoverallchargeonaproteindependsonpHpH310離子交換劑離子交換層析的固定相是離子交換劑，它是由一類不溶于水的惰性高分子聚合物基質(zhì)通過一定的化學(xué)反應(yīng)共價結(jié)合上某種電荷基團(tuán)形成的離子交換劑可以分為三部分：高分子聚合物基質(zhì)；電荷基團(tuán)；平衡離子。↙共價結(jié)合平衡離子離子交換劑的基質(zhì)

瓊脂糖離子交換劑

離子交換交聯(lián)葡聚糖聚苯乙烯離子交換纖維素離子交換介質(zhì)

陰離子交換（Anionexchangers）-Diethylaminoethyl(DEAE) -OCH2CH2N+(CH2CH3)2-Quaternaryaminoethyl(QAE) -OCH2CH2N+(C2H5)2CH2CHOHCH3-Quaternaryammonium(Q) -CH2N+(CH3)3陽離子交換（Cationexchangers）-Carboxymethyl(CM) -OCH2COO–-Sulphopropyl(SP) -CH2CH2CH2SO3–-Methylsulphonate(S) -CH2SO3–離子交換層析過程進(jìn)樣洗脫初始態(tài)再生-------------------------------------------------------------------------------++++++++++++++++++++++++++++++離子交換層析過程進(jìn)樣洗脫初始態(tài)再生四、基本操作

緩沖液的選擇層析柱的選擇

洗脫流速↓↙加樣洗脫洗脫液的監(jiān)測收集及組分鑒定離子交換劑的清洗、再生和保存

↓↓↓←離子交換劑的處理

↘↑離子交換劑的選擇洗脫方式

階段梯度（Stepgradient）線性梯度（Lineargradient）pH梯度（pHgradient）鹽梯度（Saltgradient）階段梯度線性梯度柱層析裝置圖

緩沖液管柱梯度制造器監(jiān)視器記錄器分劃收集器(1)(2)泵(3)(4)(5)膠體裝填膠體A

分批法氨基酸的分離過程親和層析親和力生物分子間存在很多特異性的相互作用，如抗原－抗體、酶－底物或抑制劑、激素－受體等，它們之間都能夠?qū)Ｒ欢赡娴慕Y(jié)合。分離原理通過將具有親和力的兩個分子中一個固定在不溶性基質(zhì)上，利用分子間親和力的特異性和可逆性，對另一個分子進(jìn)行分離純化。層析介質(zhì)親和層析用基質(zhì)具有較好的物理化學(xué)穩(wěn)定性能夠和配體穩(wěn)定的結(jié)合結(jié)構(gòu)為均勻的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)與樣品中的各個組分均沒有明顯的非特異性吸附

各類基質(zhì)優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)纖維素價格低、活性基團(tuán)較多非特異性吸附強(qiáng)、穩(wěn)定性和均一性較差交聯(lián)葡聚糖穩(wěn)定性較好孔徑較小聚丙烯酰胺同上同上瓊脂糖非特異性吸附低、穩(wěn)定性好、孔徑適當(dāng)、宜于活化多孔玻璃機(jī)械強(qiáng)度好，化學(xué)穩(wěn)定性好活性基團(tuán)較少、對蛋白質(zhì)有較強(qiáng)的吸附基質(zhì)的活化溴化氰活化環(huán)氧乙烷基活化

指通過對基質(zhì)進(jìn)行一定的化學(xué)處理，使基質(zhì)表面上的一些化學(xué)基團(tuán)轉(zhuǎn)變?yōu)橐子诤吞囟ㄅ潴w結(jié)合的活性基團(tuán)。配體與待分離的物質(zhì)有適當(dāng)?shù)挠H和力與待分離的物質(zhì)之間的親和力要有較強(qiáng)的特異性與基質(zhì)穩(wěn)定的共價結(jié)合自身應(yīng)具有較好的穩(wěn)定性配體的分類特異性配體只與單一或很少種類的蛋白質(zhì)等生物大分子結(jié)合的配體

eg.抗原和抗體、酶和它的抑制劑

通用性配體特異性不是很強(qiáng)，能和某一類的蛋白質(zhì)等生物大分子結(jié)合的配體

eg.凝集素可以結(jié)合各種糖蛋白

配體待純化的蛋白質(zhì)配體待純化的蛋白質(zhì)抗原特定單克隆抗體或多克隆抗體肝素凝聚因子、脂酶、結(jié)締組織蛋白酶、DNA聚合酶單克隆抗體特定抗原膽固醇膽固醇受體、膽固醇結(jié)合蛋白蛋白質(zhì)A/蛋白質(zhì)G免疫球蛋白脂肪酸脂肪酸結(jié)合蛋白、白蛋白蛋白酶抑制劑蛋白酶核苷酸核苷酸結(jié)合蛋白、需核苷酸的酶磷酸磷酸酶苯基硼酸鹽糖蛋白三嗪染料脫氫酶、激酶、聚合酶、限制酶、干擾素凝集素糖蛋白抗生物素蛋白含生物素的酶糖凝集素、糖苷酶蛋白質(zhì)親和層析中的合適配體親和層析的示意圖基本操作選擇適當(dāng)?shù)呐潴w將配體固定化到基質(zhì)上將目的蛋白混合液加樣到基質(zhì)上除去非特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)洗脫純的目的蛋白SimpletodoConcentratesHighpurity親和層析分配層析分配層析是利用各組分的分配系數(shù)不同而予以分離的方法。分配系數(shù)與溶劑和溶質(zhì)的性質(zhì)有關(guān)，同時受溫度、壓力的影響。所以不同物質(zhì)的分配系數(shù)不同。而在恒溫恒壓條件下，某物質(zhì)在確定的層析系統(tǒng)中的分配系數(shù)為一常數(shù)。在分配層析中，通常用多孔性固體支持物如濾紙、硅膠等吸著一種溶劑作為固定相，另一種與固定相溶劑互不相溶的溶劑沿固定相流動構(gòu)成流動相，某溶質(zhì)在流動相的帶動下流經(jīng)固定相時，會在兩相間進(jìn)行連續(xù)的動態(tài)分配。當(dāng)樣品中含有多種分配系數(shù)各不相同的組分時，分配系數(shù)越小的組分，隨流動相遷移的越快。兩個組分的分配系數(shù)差別越大，在兩相中分配的次數(shù)越多，越容易被徹底分離。

紙層析屬于典型的分配層析，且系統(tǒng)簡單，使用方便，在生物化學(xué)的發(fā)展中發(fā)揮過極其重要的作用。此外，將硅膠、硅藻土等鋪在玻璃或金屬板上進(jìn)行層析可構(gòu)成薄層層析系統(tǒng)，在硅藻土上吸附或化學(xué)鍵合一定的溶劑，裝到層析柱上，以氣體為流動相可構(gòu)成氣液分配層析，即氣相色譜系統(tǒng)，在硅膠等固體材料上吸附或化學(xué)鍵合一定的溶劑，裝到層析柱中，用一定的洗脫劑洗脫，可構(gòu)成液液分配層析，這種系統(tǒng)在高效液相色譜中應(yīng)用普遍。

柱層析系統(tǒng)的組裝層析設(shè)備層析設(shè)備——泵1）蠕動泵2）隔膜泵3）注射泵4）柱塞泵要求：無死角、易拆洗、耐滅菌、脈沖小、耐腐蝕、運(yùn)行穩(wěn)定層析設(shè)備——閥門常用隔膜閥控制方式：電磁式、壓縮空氣式、手動控制層析設(shè)備——層析柱柱材料：不銹鋼、玻璃、塑料、不銹鋼襯塑料柱底板：篩網(wǎng)、篩板以及支撐層析介質(zhì)液流分配器：大規(guī)模生產(chǎn)用。減小進(jìn)液脈沖，使液流均勻、平穩(wěn)分散于整個柱床表面。切實(shí)可行的可放大性具有多孔支持板的離子交換罐

圓筒體的高徑比一般為2～3，樹脂層高度約為圓筒高度的50～70％。1-視鏡2-進(jìn)料口3-手口4-液體分布器5-樹脂層6-多孔板7-尼龍層8-出液口具有塊石支持層的離子交換罐1-進(jìn)料口2-視鏡3-液位計4-樹脂層5-卵石層6-出液口被交換溶液進(jìn)口淋洗水、解吸液及再生劑進(jìn)口廢液出口分布器分布器淋洗水、解吸液及再生劑出口，反洗水進(jìn)口反吸附離子交換罐擴(kuò)口式離子交換器混合床交換罐制備無鹽水的流程篩板式連續(xù)離子交換設(shè)備漩渦式連續(xù)離子交換設(shè)備監(jiān)測單元（1）組成：檢測器、流量計、感應(yīng)器等（2）檢測器常用紫外吸收檢測器，其他還有熒光檢測器、電導(dǎo)檢測器、光密度檢測器等。紫外吸收檢測器用于監(jiān)測蛋白質(zhì)、多肽、核酸等成分的流出。電導(dǎo)檢測器用于監(jiān)測離子強(qiáng)度變化，以控制洗脫、清洗和平衡過程。

企業(yè)利用的層析柱離子交換裝置及再生料液處理液