食品中肉毒梭菌的PCR檢測(cè)方法樣本

食品中肉毒梭菌的ＰＣＲ檢測(cè)方法科標(biāo)檢測(cè)1、范圍本標(biāo)準(zhǔn)適用于食品中Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｆ型肉毒梭菌的檢測(cè)。

青島科標(biāo)檢測(cè)研究院經(jīng)過了山東省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局(CMA)和中國合格評(píng)定國家認(rèn)可委員會(huì)(CNAS)認(rèn)證認(rèn)可,是權(quán)威的第三方檢測(cè)機(jī)構(gòu)。旗下科標(biāo)生物實(shí)驗(yàn)室在微生物檢測(cè)領(lǐng)域擁有豐富的經(jīng)驗(yàn),能夠針對(duì)食品、醫(yī)藥、化妝品、農(nóng)產(chǎn)品、一次性產(chǎn)品以及工業(yè)產(chǎn)品等進(jìn)行微生物檢測(cè)以及產(chǎn)品微生物污染分析,為客戶提供快速、高效、權(quán)威的第三方微生物檢測(cè)服務(wù),保證產(chǎn)品質(zhì)量安全,專業(yè)得到了國內(nèi)、國際知名企業(yè)的廣泛認(rèn)可。能夠按照各種標(biāo)準(zhǔn)提供微生物檢測(cè)服務(wù)。規(guī)范性引用文件ＧＢ／Ｔ４７８９．１２食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)肉毒梭菌及肉毒毒素檢驗(yàn)ＧＢ／Ｔ６６８２分析試驗(yàn)室用水規(guī)格和實(shí)驗(yàn)方法ＧＢ１９４８９實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求ＧＢ／Ｔ２７４０３實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學(xué)檢測(cè)ＳＮ／Ｔ１１９３基因檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)要求3、術(shù)語、定義和略縮語3.1肉毒梭菌肉毒梭菌為梭菌科梭菌屬革蘭氏陽性芽孢桿菌,厭氧,在適宜的培養(yǎng)基及特定的環(huán)境條件下產(chǎn)生一類具有很強(qiáng)毒性的神經(jīng)麻痹毒素,即肉毒毒素。3.2聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)模板ＤＮＡ先經(jīng)高溫變性成為單鏈,在ＤＮＡ聚合酶作用和適宜的反應(yīng)條件下,根據(jù)模板序列設(shè)計(jì)的兩條引物分別與模板ＤＮＡ兩條鏈上相應(yīng)的一段互補(bǔ)序列發(fā)生退火而相互結(jié)合,接著在ＤＮＡ聚合酶的作用下以四種脫氧核糖核酸(ｄＮＴＰ)為底物,使退火引物得以延伸,然后不斷重復(fù)變性、退火和延伸這一循環(huán),使位于兩段已知序列之間的ＤＮＡ片段呈幾何倍數(shù)擴(kuò)增。3.3縮略語Bp堿基對(duì)DNA脫氧核糖核酸dNTP脫氧核苷三磷酸dATP脫氧腺苷三磷酸dCTP脫氧胞苷三磷酸dGTP脫氧鳥苷三磷酸dTTP脫氧胸苷三磷酸Taq水生棲熱菌Tris三(羥甲基)氨基甲烷EDTA乙二胺四乙酸4、生物安全措施為了保護(hù)實(shí)驗(yàn)室人員的安全,應(yīng)由具備資格的工作人員檢測(cè)肉毒梭菌,所有培養(yǎng)物和廢棄物應(yīng)小心處理,并按照ＧＢ１９４８９和ＧＢ／Ｔ２７４０３中的有關(guān)規(guī)定執(zhí)行。5、防污染措施檢測(cè)過程中防止交叉污染的措施按照ＳＮ／Ｔ１１９３中的規(guī)定執(zhí)行。6、方法提要樣品經(jīng)增菌后劃平板分離單菌落,挑取可疑菌落到ＴＰＧＹ培養(yǎng),對(duì)培養(yǎng)物采用熱裂解抽提ＤＮＡ法,或商品化細(xì)菌基因組ＤＮＡ提取試劑盒抽提ＤＮＡ法制備ＰＣＲ模板,進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增,瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)ＰＣＲ產(chǎn)物是否有特征條帶,從而對(duì)食品中是否污染肉毒梭菌進(jìn)行快速檢驗(yàn)。7、設(shè)備和材料7.1天平:感量０．００１ｇ。7.2生物安全柜。7.3厭氧培養(yǎng)裝置。7.4恒溫培養(yǎng)箱:３５℃±１℃和２８℃±１℃。7.5高壓滅菌鍋。7.6恒溫水浴:３７℃±１℃和６０℃±１℃。7.7速臺(tái)式冷凍離心機(jī):１４０００ｇ。7.8冰箱:－２０℃和－７０℃。7.9ＰＣＲ儀。7.10電泳儀。7.11凝膠成像分析系統(tǒng)。7.12紫外分光光度計(jì)。7.13微量可調(diào)移液器:０．２μＬ～２μＬ、２μＬ～２０μＬ、２０μＬ～２００μＬ、１００μＬ～１０００μＬ。7.14離心管:１．５ｍＬ。7.15ＰＣＲ反應(yīng)管:２００μＬ～５００μＬ。8、培養(yǎng)基和試劑除另有規(guī)定外,試劑為分析純或生化試劑,水應(yīng)符合ＧＢ／Ｔ６６８２中一級(jí)水的規(guī)格。8.1庖肉培養(yǎng)基8.2胰蛋白胨葡萄糖酵母浸膏肉湯(ＴＰＧＹ)8.3厭氧卵黃瓊脂8.4無水乙醇和９５％乙醇8.5ＰＢＳ緩沖液:氯化鈉７．６５０ｇ／Ｌ、磷酸氫二鈉０．７２４ｇ／Ｌ、磷酸二氫鉀０．２１０ｇ／Ｌ(ｐＨ７．４)8.6ＴＥ緩沖液:１０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＨＣｌ(ｐＨ８．０)、１ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ(ｐＨ８．０)8.7蛋白酶Ｋ溶液:用ＴＥ配制,使用濃度為１０ｍｇ／ｍＬ8.8溶菌酶溶液:用ＴＥ配制,使用濃度為１０ｍｇ／ｍＬ8.9３ｍｏｌ／Ｌ乙酸鈉溶液(ｐＨ５．２)8.10２０％ＳＤＳ溶液8.11引物:根據(jù)附錄Ｂ中表Ｂ．１的序列合成引物,加超純水配制成１００μｍｏｌ／Ｌ儲(chǔ)液,用于ＰＣＲ測(cè)試的引物濃度為１０μｍｏｌ／Ｌ。8.12TaqＤＮＡ聚合酶8.13ｄＮＴＰ:ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ。8.14瓊脂糖:電泳級(jí)8.15溴化乙錠8.16ＤＮＡ分子量標(biāo)準(zhǔn)8.17陽性對(duì)照:含有擴(kuò)增片段的質(zhì)粒或Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｆ型肉毒梭菌的基因組ＤＮＡ8.18商品化細(xì)菌基因組ＤＮＡ提取試劑盒8.19１０×ＰＣＲ緩沖液:２００ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＨＣｌ(ｐＨ８．４)、２００ｍｍｏｌ／Ｌ氯化鉀、１５ｍｍｏｌ／Ｌ氯化鎂。8.20５×ＴＢＥ電泳緩沖液:Ｔｒｉｓ５４ｇ、硼酸２７．５ｇ、０．５ｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ(ｐＨ８．０)２０ｍＬ,加蒸餾水至１０００ｍＬ,使用時(shí)稀釋為０．５×ＴＢＥ電泳緩沖液8.21６×加樣緩沖液:３０ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ,３６％(體積分?jǐn)?shù))甘油,０．０５％(質(zhì)量濃度)二甲苯腈藍(lán)ＦＦ,０．０５％(質(zhì)量濃度)溴酚藍(lán)9、檢驗(yàn)程序檢驗(yàn)程序見圖１10、檢驗(yàn)步驟10.1樣品制備和增菌培養(yǎng)接種前,先將增菌培養(yǎng)基煮沸１０ｍｉｎ～１５ｍｉｎ,以排除溶解于培養(yǎng)基中的氧,并迅速冷卻,切勿搖動(dòng)。每１５ｍＬ增菌肉湯中接種１ｇ～２ｇ固體食品或１ｍＬ～２ｍＬ液體食品,接種時(shí)將接種物慢慢接入肉湯液面以下。每份樣品接種兩管庖肉培養(yǎng)基,置３５℃±１℃,同時(shí)接種兩管ＴＰＧＹ培養(yǎng)基,置２８℃±１℃,厭氧培養(yǎng)５ｄ。檢查培養(yǎng)物的濁度、產(chǎn)氣、肉粒的消化和產(chǎn)生的氣味。若有生長,按１０．２分離純培養(yǎng)物。若未見生長,則繼續(xù)培養(yǎng)１０ｄ。10.2分離純培養(yǎng)物?。保恚獭玻恚膛囵B(yǎng)液置于螺旋帽試管中,加入等量過濾除菌的無水乙醇?；靹?在室溫下放置１ｈ。或８０℃加熱１０ｍｉｎ～１５ｍｉｎ以破壞其繁殖體。用接種環(huán)取１環(huán)～２環(huán)經(jīng)乙醇或加熱處理的培養(yǎng)物在厭氧卵黃瓊脂上劃線接種,置厭氧條件下３５℃±１℃培養(yǎng)４８ｈ。挑取約１０個(gè)單個(gè)的典型菌落。肉毒梭菌的菌落為隆起或扁平,光滑或粗糙,容易蔓延生長并有不規(guī)則邊緣。在卵黃培養(yǎng)基上用斜射光檢查時(shí),菌落表面一般呈虹彩樣,亦稱為珠色層。彩帶一般向外延伸,繼而菌落產(chǎn)生不規(guī)則外形。接種可疑菌落到ＴＰＧＹ培養(yǎng)基中,置３５℃±１℃厭氧培養(yǎng)２４ｈ。10.3模板ＤＮＡ的制備以下兩種方法任選一種進(jìn)行。剩余培養(yǎng)液置４℃保存,以備確證試驗(yàn)使用。10.3.1熱裂解抽提ＤＮＡ法?。保矗恚蹋裕校牵倥囵B(yǎng)物轉(zhuǎn)移至１．５ｍＬ離心管中,１４０００ｇ離心２ｍｉｎ,棄去上清液。加入１．０ｍＬＰＢＳ懸浮菌體沉淀,１４０００ｇ離心２ｍｉｎ,去上清。用４００μＬＰＢＳ重懸沉淀,加入１０ｍｇ／ｍＬ溶菌酶溶液１００μＬ,３７℃±１℃水?。保担恚椋?期間每５ｍｉｎ～７ｍｉｎ顛倒混勻離心管。加入１０ｍｇ／ｍＬ蛋白酶Ｋ溶液１０μＬ,６０℃±１℃水?。保?期間每１０ｍｉｎ～１５ｍｉｎ顛倒混勻離心管。沸水?。保埃恚椋?１４０００g離心２ｍｉｎ,上清液轉(zhuǎn)移至新的滅菌小離心管中。加入３ｍｏｌ／ＬＮａＡｃ溶液５０μＬ和９５％乙醇１．０ｍＬ,顛倒混勻,－７０℃或－２０℃放置３０ｍｉｎ,１４０００ｇ１０ｍｉｎ,棄去上清,沉淀干燥后溶于２００μＬＴＥ溶液。按１０．４進(jìn)行純度和濃度測(cè)定后置于－２０℃保存。10.3.2試劑盒抽提ＤＮＡ法?。保矗恚蹋裕校牵倥囵B(yǎng)物轉(zhuǎn)移至１．５ｍＬ離心管中,１４０００ｇ離心２ｍｉｎ,棄去上清液。菌體沉淀用１．０ｍＬＴＥ緩沖液洗兩次后重懸于１２０μＬ的２５％蔗糖溶液中。加入１０ｍｇ／ｍＬ溶菌酶溶液１２０μＬ,混勻,３７℃±１℃水?。常埃恚椋?然后加入２０％ＳＤＳ溶液３０μＬ,輕輕混勻,室溫放置５ｍｉｎ;再加入１０ｍｇ／ｍＬ蛋白酶Ｋ溶液９．０μＬ,混勻后３７℃±１℃水?。常埃恚椋?。懸浮液采用商品化細(xì)菌基因組ＤＮＡ提取試劑盒提?。模危?使用時(shí)按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。提取的ＤＮＡ按１０．４進(jìn)行純度和濃度測(cè)定后置于－２０℃保存。10.4核酸純度和濃度的測(cè)定取適量ＤＮＡ溶液原液加雙蒸水稀釋一定倍數(shù)后,使用核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計(jì)測(cè)２６０ｎｍ和２８０ｎｍ處的吸收值。ＤＮＡ的濃度按照式(１)計(jì)算。C＝Ａ260×Ｎ×５０……(１)式中:C——ＤＮＡ濃度,單位為微克每毫升(μｇ／ｍＬ);Ａ260——２６０ｎｍ處的吸光值;Ｎ——核酸稀釋倍數(shù)。當(dāng)濃度為０．３４μｇ／ｍＬ～３４０μｇ／ｍＬ,Ａ260／Ａ280比值在１．７～１．９之間時(shí),適宜于ＰＣＲ擴(kuò)增。10.5ＰＣＲ擴(kuò)增10.5.1采用分別針對(duì)Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｆ型肉毒梭菌肉毒毒素基因設(shè)計(jì)的型特異性引物,進(jìn)行多個(gè)ＰＣＲ擴(kuò)增,每個(gè)ＰＣＲ反應(yīng)管檢測(cè)一種類型的肉毒梭菌。10.5.2ＰＣＲ反應(yīng)體系中各試劑的量可根據(jù)具體情況或不同的反應(yīng)總體積進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。10.5.3ＰＣＲ檢測(cè)時(shí)反應(yīng)體系應(yīng)設(shè)置陽性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照。用含有擴(kuò)增片段的質(zhì)?；颍?、Ｂ、Ｅ、Ｆ型肉毒梭菌的基因組ＤＮＡ作陽性對(duì)照,用非肉毒梭菌基因組ＤＮＡ作陰性對(duì)照,用無菌水作空白對(duì)照。10.6凝膠電泳檢測(cè)ＰＣＲ產(chǎn)物用０．５×ＴＢＥ緩沖液制備１．２％～１．５％(質(zhì)量濃度)的瓊脂糖凝膠(凝膠加熱融化后冷卻至６０℃左右加入溴化乙錠至０．５μｇ／ｍＬ,或者在電泳后用０．５μｇ／ｍＬ溴化乙錠溶液進(jìn)行染色),將１０μＬ的ＰＣＲ產(chǎn)物與２．０μＬ６×加樣緩沖液混合,點(diǎn)樣,其中一孔加入ＤＮＡ分子量標(biāo)準(zhǔn),以判斷ＰＣＲ產(chǎn)物的片段大小。０．５×ＴＢＥ電泳緩沖液,１０Ｖ／ｃｍ恒壓電泳,電泳時(shí)間根據(jù)溴酚藍(lán)的移動(dòng)位置來確定,電泳檢測(cè)結(jié)果用凝膠成像系統(tǒng)記錄。11、ＰＣＲ結(jié)果判定陰性對(duì)照和空白對(duì)照均未出現(xiàn)條帶,陽性對(duì)照出現(xiàn)預(yù)期大小的擴(kuò)增條帶,待測(cè)樣品出現(xiàn)預(yù)期大小的擴(kuò)增條帶,判定為ＰＣＲ結(jié)果陽性,按第１２章進(jìn)行確證試驗(yàn);待測(cè)樣品未出現(xiàn)預(yù)期大小的擴(kuò)增條帶,判定ＰＣＲ結(jié)果為陰性,按第１３章直接報(bào)告結(jié)果。實(shí)驗(yàn)中設(shè)置的陰性對(duì)照、空白對(duì)照和陽性對(duì)照ＰＣＲ檢測(cè)結(jié)果應(yīng)符合上述情況。否則,任一種對(duì)照如果出現(xiàn)非上述正常結(jié)果,應(yīng)重做實(shí)驗(yàn)。12、確證試驗(yàn)?。保埃呈Ｓ嗯囵B(yǎng)液,按ＧＢ／Ｔ４７８９．１２規(guī)定的方法進(jìn)行確證試驗(yàn)。13、結(jié)果報(bào)告ＰＣＲ結(jié)果陰性,直接報(bào)告”未檢出Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｆ型肉毒梭菌”。確證試驗(yàn)結(jié)果為檢出肉毒梭菌,則報(bào)告”檢出某型(Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｆ型)肉毒梭菌”。確證試驗(yàn)結(jié)果為未檢出肉毒梭菌,則報(bào)告”未檢出Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｆ型肉毒梭菌”。附錄A(規(guī)范性附錄)培養(yǎng)基和試劑的配制A.1庖肉培養(yǎng)基A.1.1成分新鮮牛肉５００．０ｇ蛋白胨３０．０ｇ酵母浸膏５．０ｇ磷酸二氫鈉５．０ｇ葡萄糖３．０ｇ可溶性淀粉２．０ｇ蒸餾水１０００ｍＬA.1.2制法將新鮮除脂肪和筋膜的牛肉５００ｇ切碎,加入蒸餾水。加熱至沸點(diǎn),再以文火煮１ｈ。充分冷卻,經(jīng)紗布過濾,擠出余液。加入其它成分,用蒸餾水將液體體積補(bǔ)足至１０００ｍＬ。調(diào)節(jié)ｐＨ至７．４±０．１,經(jīng)粗濾紙過濾。在１５ｍｍ×１５０ｍｍ試管中先加入碎肉渣至３ｃｍ高,然后加入肉湯,超過肉渣表面約４ｃｍ,上面覆蓋一層液體石蠟,厚度為０．３ｃｍ～０．４ｃｍ。在１２１℃高壓滅菌２０ｍｉｎ。A.2胰蛋白胨葡萄糖酵母浸膏肉湯(TPGY)A.2.1成分胰酪胨５０．０ｇ蛋白胨５．０ｇ酵母浸膏２０．０ｇ葡萄糖４．０ｇ硫乙醇酸鈉１．０ｇ蒸餾水１０００ｍＬA.2.2制法將固體成分溶于１０００ｍＬ蒸餾水中,再分裝１５ｍｍ×１５０ｍｍ試管,每管１５ｍＬ。上面覆蓋一層液體石蠟,厚度為０．３ｃｍ～０．４ｃｍ。在１２１℃下高壓滅菌１０ｍｉｎ。最終ｐＨ為７．０±０．１。放冰箱內(nèi)保存,若２周內(nèi)不用則棄掉。臨用前,將基礎(chǔ)液用蒸汽或煮沸加熱１０ｍｉｎ～１５ｍｉｎ,以排除游離氧,迅速冷卻。A.3厭氧卵黃瓊脂A.3.1瓊脂基礎(chǔ)酵母浸膏５０．０ｇ胰胨５．０ｇ蛋白胨２０．０ｇ氯化鈉５．０ｇ瓊脂２０．０ｇ蒸餾水１０００ｍＬ在１２１℃下高壓滅菌１５ｍｉｎ。最終ｐＨ為７．０±０．２。A.3.2卵黃乳狀液用硬刷洗刷２個(gè)～３個(gè)雞蛋,瀝干。將雞蛋放在０．１％氯化汞溶液中浸泡１ｈ,再用７０％乙醇浸泡３０ｍｉｎ。取出雞蛋,以無菌操作打開,棄去蛋白。用注射器取出蛋黃,放入滅菌容器,加等量滅菌生理鹽水,充分混合,存于４℃?zhèn)溆?。A.3.3制法每５００ｍＬ瓊脂基礎(chǔ)液(４８℃～５０℃)加８０ｍＬ卵黃乳狀液,充分混合,制成平板。室溫放置２ｄ,或３５℃放置２４ｈ。剔除污染的平板,將無菌平板存于冰箱。

附錄B(規(guī)范性附錄)肉毒梭菌ＰＣＲ檢測(cè)方法參照表表B.1肉毒梭菌肉毒毒素基因ＰＣＲ檢測(cè)的引物序列檢測(cè)肉毒梭菌類型引物序列擴(kuò)增長度／ｂｐＡ型正:５’-ＧＴＧＡＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＴＧＧＴＡＧＴＴＡＴＡＧ-３’反:５’-ＡＡＡＡＡＡＣＡＡＧＴＣＣＣＡＡＴＴＡＴＴＡＡＣＴＴＴ-３’983Ｂ型正:５’-ＧＡＧＡ