酵母雙雜交系統(tǒng)在蛋白質(zhì)間的相互作用分析中的應(yīng)用

酵母雙雜交系統(tǒng)在蛋白質(zhì)間的相互作用分析中的應(yīng)用

蛋白質(zhì)是生命功能的基礎(chǔ)。體內(nèi)的許多生命活動(dòng)都與蛋白和蛋白之間的相互作用有關(guān)。研究蛋白質(zhì)間相互作用是了解蛋白質(zhì)生物學(xué)功能的重要手段之一,但是由于蛋白質(zhì)與其他生物大分子間作用依賴細(xì)胞內(nèi)環(huán)境,作用時(shí)間及作用力差異極大,因而傳統(tǒng)的生化方法受到較大的限制。酵母雙雜交系統(tǒng)(yeasttwo-hybridsystem,YHTS)應(yīng)用有效的酵母遺傳學(xué)方法分析蛋白質(zhì)間相互作用,已成為研究蛋白質(zhì)相互作用的強(qiáng)有力的方法之一。如今不但可用來(lái)研究體內(nèi)檢驗(yàn)蛋白的互作,還可用來(lái)發(fā)現(xiàn)新蛋白,在對(duì)特定的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)的認(rèn)識(shí)上也發(fā)揮重要的作用,因而得到了廣泛的應(yīng)用。同時(shí),在此基礎(chǔ)上相繼建立發(fā)展了反向雙雜交系統(tǒng)、三雜交系統(tǒng)等多種新技術(shù),大大加速了這一領(lǐng)域的研究。1dna-bcd-ad酵母雙雜交系統(tǒng)(YTHS)由Fields和Song等首先在研究真核基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中建立的。典型的真核生長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄因子,如GAL4、GCN4等都含有2個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域:DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA-bindingdomain,BD)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(transcription-activatingdomain,AD)。DNA-BD能夠識(shí)別位于GAL4效應(yīng)基因(GAL4-responsivegene)的上游激活序列(Upstreamactivatingsequence,UAS),并與之結(jié)合。而AD則是通過(guò)同轉(zhuǎn)錄體(transtcriptionmachinery)中的其他成分之間的結(jié)合,以啟動(dòng)UAS下游的基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。DNA-BD和AD分別單獨(dú)作用并不能激活轉(zhuǎn)錄反應(yīng),但是當(dāng)二者在空間上較為接近時(shí),則呈現(xiàn)完整的GAL4轉(zhuǎn)錄因子活性并可激活UAS下游啟動(dòng)子,使其下游基因得到轉(zhuǎn)錄。兩個(gè)結(jié)構(gòu)域不但可在其連接區(qū)適當(dāng)部位打開(kāi),仍具有各自的功能,而且兩個(gè)結(jié)構(gòu)域可重建而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活作用。酵母雙雜交系統(tǒng)利用雜交基因通過(guò)激活報(bào)告基因的表達(dá)探測(cè)蛋白-蛋白的相互作用(圖1)。酵母雙雜交系統(tǒng)能在體內(nèi)測(cè)定蛋白質(zhì)的結(jié)合作用,具有高度敏感性。2yths檢測(cè)植物病毒基因組功能雖然已經(jīng)測(cè)定了不少種類植物病毒的基因組全序列,但其中許多基因的功能還是未知的。一般來(lái)說(shuō),在基因信息翻譯成蛋白質(zhì)的氨基酸序列后,蛋白質(zhì)通過(guò)相互作用,連成一個(gè)相互作用的網(wǎng)絡(luò),從而完成植物病毒侵染周期中一系列的生命活動(dòng),如病毒復(fù)制復(fù)合物的形成、病毒顆粒的裝配、宿主細(xì)胞間的運(yùn)動(dòng)和病毒在植物間借助載體的傳播。因此,蛋白—蛋白間相互作用的分析可以了解植物病毒編碼的蛋白質(zhì)功能以及其基因的功能。在研究蛋白間的相互作用的各種方法中,酵母雙雜交系以其快速、靈敏而脫穎而出。在植物病毒學(xué)中研究應(yīng)用的對(duì)象主要集中在單鏈正義RNA病毒,尤其是馬鈴薯Y病毒屬成員,無(wú)論是病毒自身編碼的蛋白之間還是病毒編碼的蛋白與宿主蛋白之間的相互作用,都研究得較為詳盡。YTHS在植物病毒學(xué)中的應(yīng)用歸納起來(lái)主要有以下3個(gè)方面。病毒編碼的蛋白有必需蛋白(包括外殼蛋白,聚合酶,運(yùn)動(dòng)蛋白)和輔助蛋白(包括蛋白酶,輔助成分,基因組結(jié)合蛋白等)。蛋白間相互作用,參與不同的生理過(guò)程,完成不同的生理功能。利用YTHS就可以檢測(cè)蛋白間的互作,推測(cè)植物病毒基因組的功能。YTHS的應(yīng)用起初主要集中在鑒定某一病毒編碼的一對(duì)蛋白間(一般是一對(duì)已知蛋白)的互作,從而推測(cè)這對(duì)蛋白間的互作在病毒侵染、復(fù)制、病毒顆粒組裝等過(guò)程中的作用和分子機(jī)理。通常還需對(duì)待測(cè)的蛋白做點(diǎn)突變或缺失突變的處理,研究一對(duì)蛋白間發(fā)生相互作用所需的結(jié)構(gòu)域。(1)病毒的侵染。利用YTHS并結(jié)合缺失分析,表明花椰菜花葉病毒(cauliflowermosaicvirus,CaMV)ORF3的產(chǎn)物P3C端的5個(gè)氨基酸是與外殼蛋白互作和病毒侵染所必需的。并證明P3通過(guò)其C端富含脯氨酸區(qū)域與外殼蛋白相互作用。(2)病毒復(fù)制。復(fù)制復(fù)合物中各成分(RNA依賴性的RNA聚合酶、解旋酶,還有必要的其它一些蛋白)間通過(guò)互作,形成復(fù)制復(fù)合物進(jìn)行病毒復(fù)制。O’reilly等用酵母雙雜交系統(tǒng)進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn),證明三聯(lián)體正義RNA的雀麥花葉病毒(bromemosaicvirus,BMV)的解旋酶類蛋白1a和聚合酶類蛋白2aN端之間的互作使BMV基因組RNA在植物原生質(zhì)中得以復(fù)制。(3)病毒顆粒的裝配。如聯(lián)體病毒屬的番茄黃曲葉病毒(tomatoyellowleafcurlvirus,TYLCV)編碼的CP之間的互作參與病毒顆粒的組裝。另?yè)?jù)報(bào)道,通過(guò)YTHS和免疫印跡法證明CaMV的內(nèi)含體(PVI)能與病毒的外殼蛋白前體(PIV)一段富含Lys的區(qū)域相互作用。競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)DNA結(jié)合位點(diǎn)也在這個(gè)區(qū)域,所以推測(cè)PVI在病毒顆粒的組裝中起輔助作用。(4)病毒的傳播。煙草脆裂病毒(tobaccorattlevirus,TRV)分離物PpK20RNA2編碼的CP和兩個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白:40.0,32.8kD。40.0k蛋白是借助介體線蟲(chóng)Poratrichodoruspachydermus傳播所必需的,而32.8k蛋白是病毒借助其它載體傳播所必需的。在YTHS中CPC端與40.0k蛋白和32.8k蛋白有較弱的互作。而這個(gè)區(qū)域正好參與煙草脆裂病毒屬成員線蟲(chóng)傳播過(guò)程,從而支持了CP與RNA2編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白在傳播過(guò)程中起作用的假設(shè)。在YTHS中,可用功能未知的新基因去篩選文庫(kù),然后根據(jù)釣到的已知基因的功能推測(cè)該新基因的功能。用YTHS考察水稻東格魯桿狀病毒(ricetungrobacilliformvirus,RTBV)DNA基因組中未知功能的基因Ⅱ產(chǎn)物(P2)的作用。結(jié)果顯示病毒生存力與P2和P3的CP部分相互作用有關(guān),P2可能參與病毒顆粒的組裝。除了檢測(cè)一對(duì)蛋白間的相互作用,利用YTHS還可以鑒定病毒編碼的多個(gè)蛋白間的相互作用,構(gòu)建植物病毒編碼所有蛋白之間的互相作用網(wǎng)絡(luò)圖譜。如借助YTHS獲得了馬鈴薯A病毒(PVA)和豌豆種傳病毒(PSbMV)(兩種馬鈴薯Y病毒屬成員)的蛋白質(zhì)相互作用圖譜。2.2植物病毒的免疫作用植物病毒編碼的蛋白為數(shù)很少,要利用這僅有的幾個(gè)蛋白來(lái)完成生命周期中的各項(xiàng)復(fù)雜的活動(dòng),除了編碼多功能蛋白以及通過(guò)蛋白間互相組合,互相作用外,病毒編碼的蛋白質(zhì)還借助宿主蛋白以完成各項(xiàng)活動(dòng)。因此可利用YTHS以已知功能的植物病毒蛋白基因篩選雙雜交植物cDNA文庫(kù),找到參與病毒各項(xiàng)活動(dòng)的植物蛋白,研究蛋白質(zhì)之間相互作用的傳遞途徑。這其中還發(fā)現(xiàn)了不少植物宿主的新蛋白,并進(jìn)一步推測(cè)其功能。(1)植物蛋白參與病毒復(fù)制。煙草花葉病毒(tobaccomosaicvirus,TMV)的解旋酶結(jié)構(gòu)域作為YTHS中的誘餌鑒別煙草蛋白。在TMV的復(fù)制中起作用的宿主蛋白:#3(ATP酶類的蛋白),#13(光系統(tǒng)Ⅱ釋氧復(fù)合物的33K的亞基)。#13基因沉默導(dǎo)致TMV在煙草中積累增加10倍,而#3基因沉默引起TMV在煙草中的積累減少兩倍。(2)植物蛋白參與病毒翻譯。據(jù)報(bào)道,NIa中的VPg與宿主編碼的eIF4E間的互作,一方面促使病毒積累NIb蛋白形成復(fù)制復(fù)合物起始病毒mRNA的合成,從而促進(jìn)病毒蛋白的翻譯;另一方面通過(guò)它們的互作抑制了宿主細(xì)胞翻譯或防御反應(yīng)。(3)植物蛋白與病毒編碼的蛋白間的互作,促進(jìn)了植物病毒侵染。以病毒的復(fù)制酶(RNA依賴性的RNA聚合酶,RdRp)為誘餌從黃瓜cDNA文庫(kù)中分離出poly(A)結(jié)合蛋白(PABP)的cDNA克隆,缺失分析表明PABP的C端足以與RdRp相互作用。這似乎暗示PABP在病毒侵染過(guò)程中的作用。(4)植物病毒在宿主細(xì)胞間的運(yùn)動(dòng),要借助病毒運(yùn)動(dòng)蛋白與宿主蛋白間的相互作用。以花椰菜花葉病毒(CaMV)的運(yùn)動(dòng)蛋白(MP)為誘餌,從擬南芥(Arabidopsis)中篩選到與MP相互作用的蛋白(MPI-1,-2和-3)。正是在宿主蛋白的協(xié)助下,病毒才能從最初侵染的細(xì)胞進(jìn)入鄰近細(xì)胞。植物蛋白參與病毒的生理活動(dòng)的同時(shí),也影響到本身正常的生理功能。從另一個(gè)側(cè)面反映了病毒蛋白在宿主中的作用。(1)由于植物病毒的侵染,植物產(chǎn)生一定的癥狀。通過(guò)YTHS的篩選,從擬南芥中得到幾個(gè)與甜菜曲頂病毒(BCTV)C4蛋白互作的蛋白。這些專一性宿主蛋白對(duì)癥狀產(chǎn)生非常重要。結(jié)果顯示BTCVC4蛋白是擬南芥的主要癥狀決定因子。(2)宿主蛋白與病毒編碼的蛋白間的互作,影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育。聯(lián)體病毒屬成員蛋白AL1起始病毒DNA復(fù)制,調(diào)節(jié)自身表達(dá)和誘導(dǎo)植物基因轉(zhuǎn)錄。用YTHS篩選和一個(gè)桿狀病毒屬成員蛋白互作的系統(tǒng)鑒定與AL1互作的植物宿主蛋白,結(jié)果顯示與AL1互作的蛋白有一個(gè)絲氨酸和蘇氨酸激酶,一個(gè)驅(qū)動(dòng)蛋白,一個(gè)組蛋白H3,從而證明AL1也參與了植物細(xì)胞分裂和發(fā)育。(3)宿主蛋白與病毒編碼的蛋白間的互作,影響植物基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PTGS)是真核生物古老的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)機(jī)制。馬鈴薯Y病毒屬成員的輔助成分HC-Pro可以抑制植物的PTGS。(4)植物蛋白與病毒蛋白相互作用賦予植物抗性或?qū)Σ《久舾?。為了分析植物抗性反?yīng)的分子機(jī)理,利用YTHS鑒定與植物抗性反應(yīng)中的N蛋白相互作用的蛋白,可以確定參與N基因介導(dǎo)的植物病毒抗性的信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的各組分。YTHS除了檢測(cè)植物病毒蛋白與植物蛋白間直接作用,也可根據(jù)一已知功能的蛋白與已知功能的病毒蛋白的互作情況推測(cè)宿主中存在著類似蛋白與病毒蛋白的互作,從而進(jìn)一步推測(cè)病毒與宿主之間的關(guān)系。2.3病毒的cp和groel蛋白的結(jié)合通過(guò)研究植物病毒與介體之間的互作,可推測(cè)病毒借助介體傳播的分子機(jī)理。比如用YTHS比較以色列的番茄黃葉卷病毒(tomatoyellowleafcurlvirus)和白麻花葉病毒(abutilonmosaicvirus)的CP與GroEL蛋白之間的結(jié)合情況。結(jié)果顯示兩種病毒的CP都能有效地與煙粉虱血淋巴中的GroEL相結(jié)合。因此可認(rèn)為在血淋巴中GroEL-CP互作是循環(huán)傳播的必要條件,而AbMV-Is的非傳播性卻不是因?yàn)椴荒芘cGroEL蛋白結(jié)合。3生長(zhǎng)和去除細(xì)胞中的基因近年來(lái)酵母雙雜交系統(tǒng)在植物病毒學(xué)中應(yīng)用熱點(diǎn)主要集中在研究植物病毒蛋白與宿主編碼蛋白之間相互作用,分析病毒侵染、復(fù)制、細(xì)胞到細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和長(zhǎng)距離運(yùn)動(dòng)以及對(duì)植物正常生理功能影響的分子機(jī)制。關(guān)于植物病毒病害抗性等方面的研究還將逐步深入。這方面的研究將有助于加強(qiáng)對(duì)植物病毒病害的防治。酵母雙雜交技術(shù)還能在基因組水平鑒定蛋白質(zhì)互作的網(wǎng)絡(luò),并且隨著YTHS的發(fā)展,如三雜交