谷類(lèi)作物種子中賴(lài)氨酸含量的測(cè)定實(shí)驗(yàn)

谷類(lèi)作物種子中賴(lài)氨酸含量的測(cè)定蛋白質(zhì)中賴(lài)氨酸（lysine，Lys）的含量是谷物品質(zhì)的主要指標(biāo)之一。由于動(dòng)物及人類(lèi)不能合成，須從食物中得以補(bǔ)充，為此培育高含量賴(lài)氨酸的谷物，對(duì)于提高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值有重要意義。本實(shí)驗(yàn)分別用茚三酮溶液顯色法和染料結(jié)合法（DyeBindingLysine，DBL）測(cè)玉米種子中賴(lài)氨酸含量。一、茚三酮顯色法原理：谷物蛋白中賴(lài)氨酸殘基有自由的ε-NH2，它與茚三酮（ninhydrin）試劑可發(fā)生顏色反應(yīng)，生成紫紅色物質(zhì)，其顏色與賴(lài)氨酸殘基的數(shù)目成正相關(guān)。選用碳原子數(shù)目與賴(lài)氨酸相同的亮氨酸，配成標(biāo)準(zhǔn)溶液，做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，可用以測(cè)定谷物蛋白內(nèi)賴(lài)氨酸的含量.二、材料、儀器設(shè)備（一）材料：不同品種的玉米種子，用粉碎機(jī)粉碎，過(guò)100目篩子，收集過(guò)篩后的細(xì)粉，放入廣口瓶?jī)?nèi)，加入沸程60～90℃的石油醚，使其淹過(guò)粉面，浸泡8h，不時(shí)攪動(dòng)進(jìn)行脫脂。然后過(guò)濾，并用石油醚淋洗沉淀若干次，棄去濾液。將脫脂玉米粉晾在干凈的濾紙上，置陰涼通風(fēng)處吹干石油醚。收集干粉，置干燥器內(nèi)，保存?zhèn)溆?。（二）儀器設(shè)備：1.722型分光光度計(jì)；2.水浴鍋；3.試管；4.圓頭玻璃棒（圓頭大小要與試管大小配套）。（三）試劑：1.緩沖溶液，稱(chēng)取30g甲酸鈉，溶解于約60ml蒸餾水中，加入10ml8％的甲酸，最后加水到100ml；2.茚三酮試劑，稱(chēng)取1g茚三酮和1g氯化鎘（CdCl2.H2O），加入25ml上述緩沖溶液和75ml乙二醇，室溫下放置一天，第二天使用。若出現(xiàn)沉淀，則過(guò)濾后使用。該溶液一定要頭一天配制，第二天使用，不宜放置過(guò)久，也不能現(xiàn)用現(xiàn)配；3.4％和2％無(wú)水碳酸鈉溶液各50ml；4.標(biāo)準(zhǔn)亮氨酸溶液，準(zhǔn)確稱(chēng)取25mg亮氨酸，加數(shù)滴稀鹽酸，待溶解后定容至50ml，該溶液亮氨濃度為500μg/ml。準(zhǔn)確吸取上述母液1，3，5，7，9ml，分別稀釋至25ml，待用。三、實(shí)驗(yàn)步驟（一）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線準(zhǔn)確吸取已配好的標(biāo)準(zhǔn)濃度系列的亮氨酸溶液各0.5ml，分別放入5支試管中，每種濃度做三個(gè)重復(fù)。再取一支試管加入0.5ml蒸餾水做空白對(duì)照。向每支試管中各加入0.5ml的4％碳酸鈉溶液和2ml茚三酮試劑（頭一天配好的），混勻，在80℃恒溫水浴上保溫30min。取出后，立即放入冷水浴中冷卻3min，然后向每管內(nèi)加入5ml的95％乙醇，搖勻，在分光光度計(jì)上500nm波長(zhǎng)處進(jìn)行比色，以空白做對(duì)照，讀取吸光度。以吸光度值為縱座標(biāo)，亮氨酸濃度為橫座標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，并求出曲線的斜率。（二）樣品的測(cè)準(zhǔn)確稱(chēng)取已脫脂的各種玉米種子干粉各25ml，每個(gè)品種做三個(gè)重復(fù)。放入試管中（試管應(yīng)預(yù)先烘干），加入約300mg細(xì)石英砂（估計(jì)數(shù)字）和1ml2％碳酸鈉溶液，用圓頭玻棒充分?jǐn)嚢?min，注意切勿將試管擠破，將試管放入80℃恒溫水浴中，提取10min，應(yīng)常攪動(dòng)。取出試管，向每管內(nèi)按順序加入2ml茚三酮試劑，混勻，放入80℃恒溫水浴中，保溫顯色30min，同時(shí)以蒸餾水做一空白對(duì)照，取出后，立即放入冷水浴中冷卻3min，以下步驟與標(biāo)準(zhǔn)曲線做法相同。加完乙醇后進(jìn)行過(guò)濾，用濾液進(jìn)行比色，讀取吸光度。若樣品顏色過(guò)深，則可取一定量的濾液用95％乙醇稀釋后比色，吸光度的數(shù)值以在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)為宜。在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相當(dāng)?shù)牧涟彼岷?。一般作物的籽粒中，蛋白質(zhì)含量約為干重的10％～20％，富含蛋白的種子中則為30％～50％；賴(lài)氨酸含量約為3～7g／16g氮。四、結(jié)果計(jì)算按下列公式進(jìn)行計(jì)算：賴(lài)氨酸含