免疫共沉淀研究蛋白質(zhì)間相互作用的技術(shù)

免疫共沉淀（Co-IP

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——研究蛋白質(zhì)間相互作用的技術(shù)蛋白質(zhì)相互作用的類型有牢固型互作和暫時(shí)型互作兩種?；プ髁瓤梢詮?qiáng)，也可以弱。牢固型互作以多亞基蛋白復(fù)合體常見(jiàn)，最好通過(guò)免疫共沉淀（Co-immunoprecipitatio）、Pull-down或Far-western法研究。暫時(shí)型蛋白質(zhì)相互作用，被認(rèn)為是涉及到胞內(nèi)大部分生物過(guò)程，包括蛋白修飾、轉(zhuǎn)運(yùn)、折疊、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞周期等，屬于開/閉性質(zhì)，可以通過(guò)交聯(lián)或標(biāo)記轉(zhuǎn)移法來(lái)研究。胞內(nèi)研究蛋白質(zhì)互作的方法除上述方法外，還有蛋白芯片、核磁共振、質(zhì)譜、X-射線晶體衍射等。1Co-IP的原理當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時(shí)，完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來(lái)。如果用蛋白質(zhì)X的抗體免疫沉淀X，那么與X在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)Y也能沉淀下來(lái)。免疫共沉淀檢測(cè)蛋白質(zhì)的原理和常見(jiàn)問(wèn)題2

方法1)收獲培養(yǎng)的細(xì)胞（1×107－1×108）冷PBS洗滌2次細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，冰浴30min2)將每毫升細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到微量離心管中，在微量離心機(jī)上4℃以最大速度離心15min3)收集上清（約30ml）并加入30μg的適當(dāng)抗體，4℃搖動(dòng)免疫沉淀物1h

4)

加入0.9ml的蛋白質(zhì)A-Sepharose懸液，4℃搖動(dòng)免疫沉淀物30min5)用含900mmol/LNaCl的NETN洗蛋白A-Sepharose混合物，再重復(fù)洗5次。最后，用NETN洗一次6)吸出混合物的液體部分。加入800μl的1×SDS膠加樣緩沖液到球珠中，煮沸4min7)將樣品加入到大孔的不連續(xù)SDS梯度膠中，在10mA的恒定電流下電泳過(guò)夜8)通過(guò)考馬斯藍(lán)染色觀察蛋白質(zhì)泳帶9)從膠上切下目標(biāo)帶，將其放到微量離心管中，用1ml50%乙腈洗兩次，每次3min10)用胰蛋白酶消化膠中的蛋白質(zhì)，再將肽電洗脫11)通過(guò)窄孔高效液相色譜分離肽。將收集的肽在ABI477A或494A機(jī)器上進(jìn)行自動(dòng)Edman降解測(cè)序。3注意的問(wèn)題1）細(xì)胞裂解采用溫和的裂解條件，不能破壞細(xì)胞內(nèi)存在的所有蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用，多采用非離子變性劑（NP40或TritonX-100)。每種細(xì)胞的裂解條件是不一樣的，通過(guò)經(jīng)驗(yàn)確定。不能用高濃度的變性劑（0.2％SDS)，細(xì)胞裂解液中要加各種酶抑制劑，如商品化的cocktailer。2）使用明確的抗體，可以將幾種抗體共同使用。3）使用對(duì)照抗體：?jiǎn)慰寺】贵w：正常小鼠的IgG或另一類單抗兔多克隆抗體：正常兔IgG4應(yīng)用通常用于測(cè)定兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合產(chǎn)生相互作用。用于驗(yàn)證確定某種特定蛋白質(zhì)的新的作用搭檔。5優(yōu)點(diǎn)1）

Co-IP是檢測(cè)蛋白質(zhì)間相互作用的經(jīng)典方法，在此方法中,蛋白質(zhì)及復(fù)合物均以天然狀態(tài)存在，符合體內(nèi)實(shí)際情況，能更真實(shí)的反映出蛋白質(zhì)間的相互作用情況，得到的蛋白可信度高2）抗原與相互作用的蛋白質(zhì)以細(xì)胞中相類似的濃度存在,避免了過(guò)量表達(dá)測(cè)試蛋白質(zhì)所造成的人為效應(yīng)。6局限性1）此方法本身具有一定的風(fēng)險(xiǎn),因?yàn)樗x擇靶蛋白的相關(guān)蛋白在此細(xì)胞株中可能沒(méi)有明顯差異這就需要實(shí)驗(yàn)前做好充分的準(zhǔn)備,并根據(jù)亞系間不同的生物學(xué)行為來(lái)正確的選擇靶蛋白2）可能檢測(cè)不到低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用。3）不能給出動(dòng)態(tài)的結(jié)果，同時(shí)也還應(yīng)該排除細(xì)胞在破碎時(shí)導(dǎo)致本來(lái)沒(méi)有相互作用的蛋白質(zhì)發(fā)生凝聚的可能性4）所得的蛋白質(zhì)有可能不是直接相互作用的蛋白質(zhì),而是通過(guò)第三者間接相互作用的蛋白質(zhì)免疫共沉淀檢測(cè)蛋白質(zhì)的原理和常見(jiàn)問(wèn)題利用免疫共沉淀（CO-IP）技術(shù)、酶聯(lián)免疫（ELISA）都可以研究抗原和抗體之間的相互作用，但是，它們都是基