鎖陽藥材的化學(xué)成分測定

鎖陽藥材的化學(xué)成分測定

鎖陽是鎖陽科植物的干燥肉質(zhì)莖。它是一種常見的中藥，具有補(bǔ)腎、助陽、益氣、潤腸的功效。主要用于陽痿、射精、腰膝酸軟、腸干渴、便秘等。又名“烏蘭高腰”，用于緩解腹瀉和健胃，主要用于腸熱、胃炎、斑點(diǎn)和腹瀉?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證明,鎖陽具有以下藥理作用:(1)促進(jìn)性功能和腎功能;(2)清除自由基、抗氧化及抗衰老;(3)耐缺氧、抗應(yīng)激、抗疲勞;(4)增強(qiáng)動物的免疫功能;(5)抗癌及抑制艾滋病病毒增殖的作用;(6)抗血小板聚集;(7)潤腸通便等。鎖陽中含有的主要有效成分有以兒茶素為代表的黃酮類、熊果酸為代表的三萜類、多糖與鞣質(zhì)等化合物。張思巨等人用高效液相色譜法測定鎖陽中兒茶素含量(以干品計(jì))為2.079%～0.076%,并提出以兒茶素作為鎖陽指標(biāo)性成分的意見,我們也認(rèn)為可以將兒茶素作為控制鎖陽藥材質(zhì)量的指標(biāo)性成分。為此,對不同地區(qū)、不同生育期天然和人工栽培鎖陽中兒茶素含量進(jìn)行了測定,為鎖陽藥材最佳采藥期及內(nèi)在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制訂和其指紋圖譜的建立提供科學(xué)依據(jù)。1藥品與成體系的藥物試劑試驗(yàn)材料為分別從內(nèi)蒙古鄂爾多斯市杭錦旗億利集團(tuán)草原青基地、漫賴鄉(xiāng)人工栽培鎖陽基地、賽音烏蘇基地和道圖采種基地采集的出土前期(2004-5-7)、出土期(2004-5-7)、開花期(2004-6-16)和結(jié)實(shí)期(2004-7-25)的鎖陽藥材樣品,自然干燥后,用烘箱(105℃)烘干至恒重。兒茶素對照品(批號為877-200001)購自中國藥品生物制品檢定所;甲醇為分析純·;水為超純水;枸櫞酸、N,N-二甲基甲酰胺為分析純(天津化學(xué)試劑公司);四氫呋喃為色譜純(天津西華特種試劑廠)。儀器為美國Agilent1100Series高效液相色譜儀,Agilent二元泵,G1312A自動進(jìn)樣器,Agilent1100紫外檢測器,Agilent1100色譜工作站。2溶液制備2.1對照溶液精密稱取兒茶素適量,加50%甲醇配制成90μg·mL-1的對照品溶液。2.2提取液的制備取本品粉末(過100目篩)約0.8g,精密稱定,置250mL提取器燒瓶中,加溶劑95%乙醇回流提取2次(第1次40min,加溶劑100mL,第2次20min,加溶劑100mL),過濾,合并濾液,減壓回收至干,殘?jiān)?0%甲醇溶解,移置25mL量瓶中,用50%甲醇定容至刻度,搖勻,用微孔濾膜(0.45μm)過濾,置25mL棕色瓶中,即得。3b-c38柱參照文獻(xiàn)基本色譜條件,對其流動相的極性進(jìn)行了調(diào)整。色譜柱為ZORBAXSB-C18柱(4.6mm×250mm,5μm),0.04mol·L-1枸櫞酸溶液-N,N二甲基甲酰胺-四氫呋喃(50:4:1)為流動相,流速1.0mL·min-1,檢測波長為280nm,柱溫:35℃;進(jìn)樣量:30μL。4方法學(xué)的檢驗(yàn)4.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密稱取兒茶素對照品適量,加50%甲醇配制成90μg·mL-1的對照品溶液,分別精密吸取1,4,8,12,16,20μL,依次進(jìn)樣,按上述色譜條件測定,以兒茶素進(jìn)樣的質(zhì)量(μg)作為橫坐標(biāo)X,峰面積積分值為縱坐標(biāo)Y,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并回歸處理,結(jié)果表明,兒茶素含量在0.09～1.8μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好?；貧w方程為:4.2精密度測試取同一供試品溶液重復(fù)進(jìn)樣5次,每次30μL,兒茶素峰面積積分值的RSD為0.64%。4.3重復(fù)試驗(yàn)取同一批樣品5份,精密稱定,分別按“2.2”項(xiàng)方法制成供試品溶液,測定、計(jì)算百分含量,RSD為3.2%。4.4兒茶素峰面積積分值的測定精密吸取同一供試品溶液,在24h內(nèi)按0,2,4,6,8,24h(8h后置冰箱冷凍室中保存至第16h取出,在第24h測定)間隔進(jìn)樣6次,供試品溶液中兒茶素峰面積積分值的RSD為2.5%。4.5加樣回收和rsd精密稱取0.7g已測知含量的草原青基地出土前期鎖陽樣品5份,分別加入對照品溶液2mL,按“供試品溶液制備”方法操作,進(jìn)樣30μL,測得兒茶素的平均回收率為96.36%,RSD為0.90%。5對照品溶液的制備對4個(gè)產(chǎn)地的不同生育期鎖陽樣品分別按“2.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液,按“2.1”項(xiàng)方法制備90μg·mL-1的對照品溶液,按“3”項(xiàng)下條件進(jìn)行外標(biāo)法測定。結(jié)果見圖1、表1、圖2。6結(jié)論與分析6.1不同的提取方法對鎖陽兒茶素含量的影響6.1.1提取時(shí)間的影響按上述HPLC色譜條件,對草原青出土前期鎖陽樣品,用不同時(shí)間(1,2,3h)加熱回流提取的效率進(jìn)行了比較研究,結(jié)果加熱回流提取時(shí)間為1h時(shí),兒茶素的得率(72.37mg·mL-1)最高,效果最好。6.1.2不同功率和時(shí)間對細(xì)胞破碎儀超聲提取兒茶素的效果影響按上述HPLC色譜條件,對草原青出土前期鎖陽樣品用細(xì)胞破碎儀超聲(頻率20kHz)提取兒茶素,在不同功率(80,100,120W)與時(shí)間(20,25,30,35,40min)組合下提取效率進(jìn)行了比較研究,結(jié)果在20kHz,80W,30min組合下,細(xì)胞破碎儀超聲提取兒茶素得率(52.20mg·mL-1)最高,效果最好。6.1.3超聲波清洗儀提取患兒兒茶素得率按上述HPLC色譜條件,對草原青出土前期鎖陽樣品用超聲波清洗儀提取兒茶素,在相同頻率(40kHz)及功率(44W)和不同時(shí)間(30,40,50min)組合下的提取效率進(jìn)行了比較研究,結(jié)果提取時(shí)間為40min超聲波清洗儀提取兒茶素得率(51.90mg·mL-1)最高,效果最好。6.1.4最佳提取條件的確定按上述HPLC色譜條件,對草原青基地、漫賴鄉(xiāng)人工栽培基地、賽音烏蘇基地出土前期鎖陽樣品分別用加熱回流1h、細(xì)胞破碎儀、超聲波清洗儀(按上述最佳提取條件)提取后,對提取效果進(jìn)行了比較研究,結(jié)果兒茶素含量加熱回流提取>超聲波細(xì)胞破碎儀>超聲波清洗儀,因此選用加熱回流提取方法提取兒茶素,用于制備供試品溶液。6.1.5提取效率比較鎖陽兒茶素的提取方法的比較研究結(jié)果表明,加熱回流提取1h比超聲波細(xì)胞破碎儀和超聲波清洗儀2種方法提取效率高。超聲波提取方法雖然有對樣品無損害、提取簡便、快速等優(yōu)點(diǎn),但對鎖陽兒茶素的提取而言短時(shí)間加熱回流提取效率比超聲波提取效率高。6.2流動相的選擇應(yīng)用文獻(xiàn)色譜條件試驗(yàn)時(shí),在保留時(shí)間14.84min時(shí)出現(xiàn)了兒茶素的色譜峰,但出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。作者懷疑這可能是同別的物質(zhì)的色譜峰重疊所致,因此對其流動相比例進(jìn)行了調(diào)整。隨著流動相中枸櫞酸溶液比例的加大,兒茶素的保留時(shí)間在14→28min變化過程中,原來兒茶素的色譜峰(14min時(shí))中明顯分出另一小峰(約在30min時(shí))。當(dāng)流動相比例調(diào)到50:4:1時(shí),這2個(gè)色譜峰達(dá)到完全分離,因此本文選擇0.04mol·L-1枸櫞酸溶液-N,N二甲基甲酰胺-四氫呋喃(50:4:1)為流動相,色譜圖見圖1。對該方法進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果證明精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性、回收率等指標(biāo)都能夠符合定量分析要求。因此,該方法能夠較精確測量鎖陽中兒茶素的含量,可以作為測定鎖陽藥材兒茶素的方法。6.3出土期間、開花期、粘結(jié)期的變化研究結(jié)果表明,不同地區(qū)、天然的以及人工栽培的鎖陽不同生育期兒茶素含量變化趨勢是相同的,呈現(xiàn)出規(guī)律性地變化,即出土前期>出土期>開花期>結(jié)實(shí)期。從圖2可以看出,不同產(chǎn)地的鎖陽在不同生育期兒茶素的含量變化很大,這可能與生長環(huán)境的土壤營養(yǎng)、水分、氣候等因素有關(guān)。6.4黃酮類化合物指紋圖譜的建立不同生育期鎖陽