乳酸菌實(shí)驗(yàn)報(bào)告

乳酸菌的分離與培養(yǎng)保加利亞乳桿菌組長(zhǎng)：王小員：王小英鄭春玲闕小琴柳潔實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?.學(xué)習(xí)并掌握普通光學(xué)顯微鏡油鏡的使用技術(shù)及微生物形態(tài)觀察；2.學(xué)習(xí)微生物制片、染色的基本技術(shù)，掌握乳酸菌的簡(jiǎn)單染色法及無(wú)菌操作接種技術(shù)；3.通過(guò)對(duì)培養(yǎng)基的配制，了解配制培養(yǎng)基的一般步驟和方法，掌握微生物實(shí)驗(yàn)常用的器皿的清洗與包扎、培養(yǎng)基的制備、消毒滅菌。4.了解各種滅菌的基本原理和應(yīng)用范圍，以及實(shí)驗(yàn)室中常用的滅菌方法。5.了解酸奶中乳酸菌分離原理,觀察乳酸菌的基本形態(tài),掌握用顯微鏡測(cè)微尺測(cè)量微生物細(xì)胞大小、數(shù)目的測(cè)定的方法。6.了解稀釋平板計(jì)數(shù)的原理，熟練掌握混合平板培養(yǎng)法。明確顯微鏡計(jì)數(shù)的原理并學(xué)習(xí)使用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行微生物計(jì)數(shù)的方法。7．初步學(xué)會(huì)乳酸菌培養(yǎng)的基本技術(shù)，了解并掌握細(xì)菌鑒定中常用生理生化反應(yīng)的原理和方法，掌握進(jìn)行微生物大分子水解試驗(yàn)的原理和方法。8.了解并掌握微生物菌種保藏的常用方法及其優(yōu)缺點(diǎn)，并了解不同微生物對(duì)不同的生物大分子的分解利用情況，認(rèn)識(shí)微生物代謝類型的多樣性。實(shí)驗(yàn)原理：乳酸菌指發(fā)酵糖類主要產(chǎn)物為乳酸的一類無(wú)芽孢、革蘭氏染色陽(yáng)性細(xì)菌的總稱，本實(shí)驗(yàn)中用革蘭氏染色法進(jìn)行染色，革蘭氏染色法是根據(jù)細(xì)菌細(xì)胞壁成分不同,脫色效果不同從而可以將細(xì)菌區(qū)分為G+和G-菌。通過(guò)革蘭氏染色以及形態(tài)學(xué)觀察，乳酸菌呈紫色，為革蘭氏陽(yáng)性菌；乳酸菌應(yīng)為乳桿菌和乳球菌的混合體。酸奶中含有乳酸菌，而且目前市場(chǎng)上銷售的酸奶中通常含有雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌四種菌。細(xì)菌及其它一些微生物的大小，通常用測(cè)微計(jì)來(lái)測(cè)量，測(cè)微計(jì)分接目測(cè)微計(jì)與鏡臺(tái)測(cè)微計(jì)；培養(yǎng)基是按照微生物生長(zhǎng)發(fā)育的需要，用不同組份的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)調(diào)制而成的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)；滅菌是用物理或化學(xué)的方法來(lái)殺死或除去物品上或環(huán)境中的所有微生物，包括芽孢；自然條件下，微生物常以群落狀態(tài)存在，這種群落往往是不同種類微生物的混合體，為了研究某種微生物的特性或者要大量培養(yǎng)或者使用某種微生物，必須從這些混雜的微生物群落中獲得純培養(yǎng)，這些獲得純培養(yǎng)的方法稱為微生物的分離和純化。用生化試驗(yàn)的方法檢測(cè)細(xì)菌對(duì)各種基質(zhì)的代謝作用及其代謝產(chǎn)物，從而鑒別細(xì)菌的種屬，稱之為細(xì)菌的生化反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)器材：樣品：含乳酸菌的酸奶培養(yǎng)基：改良MRS固體培養(yǎng)基蛋白胨5g牛肉膏5g酵母提取物2.5g檸檬酸二銨1g水500mL乙酸鈉2.5gK2HPO41gMnSO4·4H2O0.125吐溫800.5mL瓊脂12.5gMgSO4·7H2O0.29gCaCO35g葡萄糖10g。儀器用品：500ml燒杯一個(gè)100ml量筒一個(gè)無(wú)菌培養(yǎng)皿12個(gè)250ml容量三角瓶2個(gè)5ml無(wú)菌移液管1ml無(wú)菌移液管6只15ml試管7只高壓滅菌鍋天平水浴鍋一個(gè)玻棒一根旋渦均勻器一臺(tái)鏡臺(tái)測(cè)微尺電磁爐一個(gè)棉花紗布目鏡測(cè)微尺牛皮紙麻繩接種環(huán)一個(gè)蓋玻片酒精燈一盞牛角匙pH試紙血球計(jì)數(shù)板載玻片若干恒溫培養(yǎng)箱酸度計(jì)擦鏡紙、吸水紙液體石蠟顯微鏡載玻片玻片架、洗瓶、酒精燈火柴、滴管藥品：結(jié)晶紫，乙醇，草酸銨，碘，碘化鉀，番紅，KOH，NaCl，10％NaOH，2%氯化鐵。藥品配制結(jié)晶紫：結(jié)晶紫乙醇飽和液（結(jié)晶紫2g溶于20ml95%乙醇中）20ml，1g草酸銨于蒸餾水100ml。將兩液混勻即成盧戈氏碘液：碘1g，碘化鉀2g，蒸餾水300ml。先將碘化鉀溶于少量蒸餾水中，然后加入碘使之完全溶解，再加入蒸餾水300ml即成。蕃紅溶液：番紅2.5g，95%乙醇100ml，溶解后存于密閉的棕色瓶中。用時(shí)取10ml與80ml蒸餾水混勻即可。

0.1%的呂氏美藍(lán)染液：A液：美藍(lán)0.3g，95%乙醇300ml；B液：0.01%KOH100ml?；旌螦和B液即成，按1：100稀釋即可。生理鹽水：稱取0.9克氯化鈉，溶解在少量蒸餾水中，稀釋到100毫升。實(shí)驗(yàn)步驟：培養(yǎng)基的培養(yǎng)1．稱量用天平稱取蛋白胨1g,牛肉膏1g,酵母提取物0.5g,檸檬酸二銨0.2g,乙酸鈉0.5g,K2HPO40.2g,MnSO4·4H2O0.025g,MgSO4·7H2O0.06g,葡萄糖2g,2．溶解向上述燒杯中加入蒸餾水50mL無(wú)菌水，用玻璃棒攪勻后，放到酒精燈上加熱,在石棉網(wǎng)上加熱溶解后,加入2.5g瓊脂，并繼續(xù)用微火加熱。在瓊脂溶化的過(guò)程中，要控制火力的大小，并且不斷攪拌，以免培養(yǎng)基溢出或燒焦。待瓊脂完全溶化后，補(bǔ)加蒸餾水至100mL。3．調(diào)節(jié)pH用滴管逐滴滴入1mol/L的NaOH溶液，邊滴邊攪拌，并隨時(shí)用精密的pH試紙測(cè)pH，直到pH到6.8左右。4．過(guò)濾要趁熱用四層紗布過(guò)濾5．培養(yǎng)基的分裝將培養(yǎng)基趁熱分裝到2個(gè)三角瓶里(一半為宜)。注意：分裝時(shí)不要將培養(yǎng)基沾在管口和試管上段，以免引起污染。6．加棉塞培養(yǎng)基分裝完畢以后，在管口上加一個(gè)棉塞。棉塞能防止雜菌污染，保證通氣良好。加棉塞時(shí)，應(yīng)使棉塞長(zhǎng)度的2/3在試管口內(nèi)。7．包扎在管口外面包上一層牛皮紙，然后，用線繩扎好。在每捆試管外掛上標(biāo)簽，注明培養(yǎng)基名稱、配制日期和制作者姓名二、滅菌1．打開(kāi)高壓蒸汽滅菌鍋，將里面的滅菌桶取出，向鍋內(nèi)加水(最好用開(kāi)水)，水面與底架平齊為宜（直至高水位燈亮起）。2．將扎好的試管管口向上豎放在滅菌桶內(nèi)，再將滅菌桶放回滅菌鍋。（注意：滅菌桶內(nèi)的物品不能放得(4)復(fù)染滴加番紅液，染色2—3分鐘，水洗。最后用吸水紙輕輕吸干。(5)鏡檢干燥后，置油鏡觀察。革蘭氏陰性菌呈紅色，革蘭氏陽(yáng)性菌呈紫色。以分散開(kāi)的乳酸菌的革蘭氏染色反應(yīng)為準(zhǔn)，過(guò)于密集的細(xì)菌，常常呈假陽(yáng)性。其中保加利亞乳桿菌呈桿狀，成單桿、或雙桿菌或長(zhǎng)絲狀；嗜熱鏈球菌，呈球狀，成對(duì)、或短鏈、或長(zhǎng)鏈狀。十、保加利亞乳桿菌的細(xì)胞大小測(cè)定1、目鏡測(cè)微尺的校正把目鏡的上透鏡旋下，將目鏡測(cè)微尺的刻度朝下輕輕地裝入目鏡的隔板上，把鏡臺(tái)測(cè)微尺置于載物臺(tái)上，刻度朝上。先用低倍鏡觀察，對(duì)準(zhǔn)焦距，視野中看清鏡臺(tái)測(cè)微尺的刻度后，轉(zhuǎn)動(dòng)目鏡，使目鏡測(cè)微尺與鏡臺(tái)測(cè)微尺的刻度平行，移動(dòng)推動(dòng)器，使兩尺重疊，再使兩尺的“0”刻度完全重合，定位后，仔細(xì)尋找兩尺第二個(gè)完全重合的刻度，計(jì)數(shù)兩重合刻度之間目鏡測(cè)微尺的格數(shù)和鏡臺(tái)測(cè)微尺的格數(shù)。因?yàn)殓R臺(tái)測(cè)微尺的刻度每格長(zhǎng)l0μm，所以由下列公式可以算出目鏡測(cè)微尺每格所代表的長(zhǎng)度。例如目鏡測(cè)微尺5小格正好與鏡臺(tái)測(cè)微尺5小格重疊，已知鏡臺(tái)測(cè)微尺每小格為l0μm，則目鏡測(cè)微尺上每小格長(zhǎng)度為=5×10μm/5＝10μm2、菌體大小的測(cè)定取下鏡臺(tái)測(cè)微尺，將保加利亞乳桿菌染色標(biāo)本片置于載物臺(tái)上，先在低倍鏡和高倍鏡下找到目的物。然后在高倍鏡下轉(zhuǎn)動(dòng)目鏡測(cè)微尺，測(cè)出保加利亞乳桿菌的長(zhǎng)和寬各占幾格（不足一格的部分估計(jì)到小數(shù)點(diǎn)后一位），測(cè)出的格數(shù)乘上目鏡測(cè)微尺每格的長(zhǎng)度，即等于該菌的大小。同法在油鏡下轉(zhuǎn)動(dòng)目鏡測(cè)微尺測(cè)出保加利亞乳桿菌的長(zhǎng)和寬各占幾格（不足一格的部分估計(jì)到小數(shù)點(diǎn)后一位），測(cè)出的格數(shù)乘上目鏡測(cè)微尺每格的長(zhǎng)度，即等于該菌的大小。例如目鏡測(cè)微尺在顯微鏡下經(jīng)過(guò)校正，當(dāng)使用油鏡時(shí)，每格相當(dāng)于1.3μm。如果測(cè)量菌體的長(zhǎng)度相當(dāng)于目鏡測(cè)微尺的兩格，則菌體長(zhǎng)度應(yīng)為1.3μm×2=2.6μm。一般測(cè)定微生物細(xì)胞大小時(shí)，通常測(cè)量10—20個(gè)菌體左右，求出平均值，才能代表該菌的大小。用最大和最小的數(shù)值來(lái)表示菌體大小的范圍。例如長(zhǎng)為3~5μm，寬為1~2μm，則其大小為l~2×3~5μm。3、取出目鏡測(cè)微尺，將接目鏡放回鏡筒，再將目鏡測(cè)微尺和鏡臺(tái)測(cè)微尺分別再用擦鏡紙擦拭后，放回盒內(nèi)保存。（二）血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下直接計(jì)數(shù)保加利亞乳桿菌的數(shù)量如圖--血球計(jì)數(shù)板構(gòu)造上：俯視圖（中間平臺(tái)分為兩半，各刻有一個(gè)方格網(wǎng)）下：側(cè)面圖（中間平臺(tái)與蓋玻片之間有高度為0.1mm的間隙）血球計(jì)數(shù)板通常是一塊特制的厚載玻片，載玻片上有四條槽而構(gòu)成三個(gè)平臺(tái)（圖5-2）。中間的平臺(tái)較寬，其中間又被一短橫槽而隔成兩半，每個(gè)半邊上面各刻有一個(gè)方格網(wǎng)。每個(gè)方格網(wǎng)共分9大格其中間的1大格又稱為計(jì)數(shù)室，微生物的計(jì)數(shù)就在此大格中進(jìn)行。常用的血球計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)室有兩種規(guī)格的刻度網(wǎng)格。一種是一個(gè)大方格分成16個(gè)中方格，而每個(gè)中方格又分成25個(gè)小方格，即為16×25。另一種是一個(gè)大方格分成25個(gè)中方格而每個(gè)中方格又分成16個(gè)小方格，即25×16。但是不管計(jì)數(shù)室是哪種規(guī)格，其計(jì)數(shù)室的小格數(shù)總是相同的，即16×25=25×16=400（小格），見(jiàn)下圖。圖--計(jì)數(shù)網(wǎng)的區(qū)分與分格每一個(gè)大方格邊長(zhǎng)為lmm、則每一大方格面積為lmm2。蓋上蓋玻片后，載玻片計(jì)數(shù)室與蓋被片之間的高度為0.1mm，所以每個(gè)計(jì)數(shù)室（大方格）的體積為0.1mm3。在計(jì)數(shù)時(shí)，通常數(shù)5個(gè)中方格的總菌數(shù)，求得平均值。再乘上16或25就得一大方格中的總菌數(shù)。然后再換算成1mL菌液中的總菌數(shù)。（1mL=1cm3=1000mm3）操作步驟如下：1、取培養(yǎng)后的保加利亞乳桿菌液振蕩混勻，加無(wú)菌水適當(dāng)稀釋（斜面一般稀釋到10-2）。稀釋度選擇以小方格中的分布的菌體清晰可數(shù)為宜。一般以每小格內(nèi)含4～5個(gè)菌體的稀釋度為宜。2.取清潔無(wú)油的血球計(jì)數(shù)板，在計(jì)數(shù)室上面加蓋玻片。3.將保加利亞乳桿菌液搖勻，用滴管吸取少許，從計(jì)數(shù)板中間平臺(tái)兩側(cè)的溝槽內(nèi)沿蓋玻片的下邊緣滴入一小滴（不宜過(guò)多），使菌液沿兩玻片間自行滲入計(jì)數(shù)室，勿使產(chǎn)生氣泡，并用吸水紙吸去溝槽中流出的多余菌液。也可以將菌液直接滴加在計(jì)數(shù)室上，然后加蓋蓋玻片（勿使產(chǎn)生氣泡）。4.靜置5min后，將血球計(jì)數(shù)板置于顯微鏡載物臺(tái)上，先用低倍鏡找到計(jì)數(shù)板的大方格網(wǎng)位置。尋找時(shí)光圈要縮小，光線要偏暗些，并將計(jì)數(shù)室移至視野中央。5．計(jì)數(shù)時(shí)用由16中格的計(jì)數(shù)板，要按對(duì)角線方位，數(shù)左上、左下、右上、右下的4個(gè)中格（即100小格）的保加利亞乳桿菌數(shù)。如果是25個(gè)大方格組成的計(jì)數(shù)區(qū)，除數(shù)上述四個(gè)格外，還需數(shù)中央l個(gè)中格的保加利亞乳桿菌菌數(shù)（即80個(gè)小格）。由于菌體在計(jì)數(shù)室中處于不同的空間位置，要在不同的焦距下才能看到，因而觀察時(shí)必須不斷調(diào)節(jié)微調(diào)如菌體位于大方格的雙線上，計(jì)數(shù)時(shí)則數(shù)上線不數(shù)下線，數(shù)左線不數(shù)右線，以減少誤差。6．在高倍鏡下計(jì)數(shù)：隨機(jī)地計(jì)數(shù)5個(gè)中格內(nèi)的菌數(shù)，然后求得每個(gè)中格的平均值。乘上16（或25）就得出1大格中的總菌數(shù)，最后再換算到每1mL菌液中的含菌數(shù)量。由于菌體細(xì)胞在血球計(jì)數(shù)板上處于不同的空間位置，要在不同的焦距下才能看到，故觀察時(shí)必須不斷調(diào)節(jié)微調(diào)節(jié)器，方能數(shù)到全部菌體以免遺漏。7.計(jì)算方法8.血球計(jì)數(shù)板用后，在水龍頭上用水柱沖洗干凈，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免損壞網(wǎng)格刻度。洗凈后，并用吸水紙吸水，最后用擦鏡紙擦干凈，并放回盒內(nèi)。十二、保加利亞乳桿菌的生理生化試驗(yàn)（1）乙酰甲基甲醇V-P實(shí)驗(yàn)接種新鮮的實(shí)驗(yàn)菌種于培養(yǎng)基中,40℃恒溫箱中培養(yǎng)48小時(shí)后,取培養(yǎng)液1mL在其中加入1ml10％(2)糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)將表下表所示培養(yǎng)基成分(指示劑除外)稱取、溶解、搖勻，調(diào)整pH值為6.8—7.0，添加1．6％溴甲酚紫指示劑，按l％的濃度添加試驗(yàn)糖類并溶解，分裝試管，每管5mL，121℃蒸汽滅菌20min。室溫冷卻待用。接種供試菌液0．025ml，置37℃恒溫培養(yǎng)l、3結(jié)果判定：陽(yáng)性結(jié)果為培養(yǎng)基的顏色變黃，表示產(chǎn)酸；陰性結(jié)果為顏色不變(與不含糖類的對(duì)照管相同)或變藍(lán)(紫)。糖發(fā)酵試驗(yàn)基礎(chǔ)培養(yǎng)基組成培養(yǎng)基成分稱取量蛋白胨5g牛肉膏5g酵母膏5g吐溫80