生物化學(xué)課件：DNA重組和重組DNA技術(shù)

DNA重組和重組DNA技術(shù)DNARecombinationandRecombinantDNAtechnologyDNA重組（DNArecombination）是指不同DNA分子斷裂和連接而產(chǎn)生DNA片段的交換并重新組合形成新DNA分子的過程。重組DNA技術(shù)（recombinantDNAtechnology）是指在體外將兩個或兩個以上DNA分子重新組合并在適當(dāng)細(xì)胞中增殖形成新DNA分子的過程。重組DNA技術(shù)的發(fā)展史1865年G.J.Mendel的豌豆雜交試驗(yàn)。1944年O.T.Avery的肺炎球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。1960~1970年代研究出重組DNA有相關(guān)的工具酶包括載體，轉(zhuǎn)錄酶等。1973年美國斯坦福大學(xué)的科學(xué)家構(gòu)建第一個重組DNA分子。1977年美國南舊金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遺傳工程公司，專門應(yīng)用重組DNA技術(shù)制造醫(yī)學(xué)上重要的藥物。1980年開始建造第一家應(yīng)用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)胰島素的工廠。1997年英國羅林研究所成功的克隆了多莉。美國生化學(xué)家KaryBanksMullis，1985年發(fā)明了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)，獲得1993年諾貝爾獎。Intheearly1980susinggeneticengineeringtechniguestoaddgenestohigherorganisms.1996年，生物學(xué)界發(fā)生了一件轟動世界的大事——克隆羊多利誕生。這一成果被美國《科學(xué)》雜志評為該年度世界10大科技進(jìn)步的第1項。科學(xué)家認(rèn)為，多利誕生標(biāo)志著生物技術(shù)新時代來臨。此后，克隆，這個以前只在科學(xué)研究領(lǐng)域出現(xiàn)的術(shù)語變得廣為人知?？寺∝i、克隆猴、克隆?！娂妴柺?，似乎一夜之間，克隆時代已來到人們眼前。伊恩·維爾莫特與克隆羊多利我國重組DNA技術(shù)的發(fā)展史1963年

上海生命科學(xué)院的銅壁周教授完成了克隆魚。上世紀(jì)80年代中國科學(xué)院病毒研究所的侯云德院士利用重組DNA技術(shù)制作了干擾素。1993年批準(zhǔn)生產(chǎn)，并進(jìn)入市場。這是我國第一個自己生產(chǎn)出來的重組DNA的藥物。SomeDefinition

Clone:Agroupoforganismsorcellsproducedasexuallyfromoneancestororstock,towhichtheyaregeneticallyidentical.

Cloning:PropagationofaDNAsequencebyincorporatingitintoahybridconstructthatcanbereplicatedinahostcell.

Reproductivecloning:Processofmakingageneticallyidenticalcopyofanorganism.

Therapeuticcloning:Processofmakingmultiplecopiesofacelltotreatadisease.WhatisClonedDNAUsedFor?Workoutthefunctionofagene.Investigateagene’scharacteristics(size,expression,tissuedistribution).Lookathowmutationsmayaffectagene’sfunction.Makelargeconcentrationsoftheproteincodedforbythegene.MainStepsinDNACloningThechosenpieceofDNAis‘cut’fromthesourceorganismusingrestrictionenzymes.ThepieceofDNAis‘pasted’intoavectorandtheendsoftheDNAarejoinedwiththevectorDNAbyligation.Thevectorisintroducedintoahostcell,byaprocesscalledtransformation.ThehostcellscopythevectorDNAalongwiththeirownDNA,creatingmultiplecopiesoftheinsertedDNA.ThevectorDNAisisolatedfromthehostcells’DNAandpurified.HowrInsulinProduced?限制性內(nèi)切酶是一類核酸內(nèi)切酶，能識別雙鏈DNA分子內(nèi)部的特異位點(diǎn)并降解磷酸二酯鍵……GGATCC......……CCTAGG…...CharacteristicsofRestrictionEndonucleasePalindrome回文結(jié)構(gòu)又稱反向重復(fù)序列，是指在兩條核苷酸鏈中，從5到3方向的核苷酸序列是完全一致的。DNA連接酶（質(zhì)粒載體）VirusVectorVirusVectorIsolationofRNA28S18S5.8SIsolationofmRNA

Selection重組DNA技術(shù)操作過程可形象歸納為：SummaryofDNACloning（小結(jié)）分分離獲取目的基因選載體的選擇與構(gòu)建接目的DNA與載體連接

轉(zhuǎn)重組DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞篩重組體的篩選與鑒定AnalysisofClonedDNA

BioinformaticsBioinformaticsWedsitesGenBank(USA：）EMBL(Europe：http://www.embl-heidelberg.de)DDBJ(Japan：http://www.ddbj.nig.ac.jp/index-j.html)SouthernandNorthernBlot染色體FISH蛋白質(zhì)的分離純化TheSeparationandPurificationofProtein一、透析及超濾法可去除蛋白質(zhì)溶液中的小分子化合物應(yīng)用正壓或離心力使蛋白質(zhì)溶液透過有一定截留分子量的超濾膜，達(dá)到濃縮蛋白質(zhì)溶液的目的。透析(dialysis)超濾法利用透析袋把大分子蛋白質(zhì)與小分子化合物分開的方法。二、丙酮沉淀、鹽析及免疫沉淀是常用的蛋白質(zhì)濃縮方法使用丙酮沉淀時，必須在0～4℃低溫下進(jìn)行，丙酮用量一般10倍于蛋白質(zhì)溶液體積。蛋白質(zhì)被丙酮沉淀后，應(yīng)立即分離。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。鹽析(saltprecipitation)是將硫酸銨、硫酸鈉或氯化鈉等加入蛋白質(zhì)溶液，使蛋白質(zhì)表面電荷被中和以及水化膜被破壞，導(dǎo)致蛋白質(zhì)沉淀。免疫沉淀法：將某一純化蛋白質(zhì)免疫動物可獲得抗該蛋白的特異抗體。利用特異抗體識別相應(yīng)的抗原蛋白，并形成抗原抗體復(fù)合物的性質(zhì)，可從蛋白質(zhì)混合溶液中分離獲得抗原蛋白。三、利用荷電性質(zhì)可電泳分離蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)在高于或低于其pI的溶液中為帶電的顆粒，在電場中能向正極或負(fù)極移動。這種通過蛋白質(zhì)在電場中泳動而達(dá)到分離各種蛋白質(zhì)的技術(shù),稱為電泳(elctrophoresis)

。根據(jù)支撐物的不同，可分為薄膜電泳、凝膠電泳等。

SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，常用于蛋白質(zhì)分子量的測定。等電聚焦電泳，通過蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的差異而分離蛋白質(zhì)的電泳方法。雙向凝膠電泳是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要技術(shù)。幾種重要的蛋白質(zhì)電泳:DNASequencingTransgenicMice

重組DNA技術(shù)在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用ApplicationofRecombinantDNATechnologyinMedicine

重組DNA醫(yī)藥產(chǎn)品產(chǎn)品功能組織胞漿素原激活劑抗凝血液因子VIII促進(jìn)凝血顆粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落剌激因子剌激白細(xì)胞生成促紅細(xì)胞生成素剌激白細(xì)胞生成生長因子(bFGF,EGF)刺激細(xì)胞生長與分化生長素治療侏儒癥胰島素治療糖尿病干擾素(

1b,

2a,

2b,

)抗病毒感染及某些腫瘤白細(xì)胞介素激活、剌激各類白細(xì)胞超氧化物歧化酶抗組織損傷單克隆抗體利用其結(jié)合特異性進(jìn)行診斷試驗(yàn)、腫瘤導(dǎo)向治療乙肝疫苗(CHO,酵母)預(yù)防乙肝口服重組B亞單位菌體霍亂菌苗預(yù)防霍亂一、重組DNA技術(shù)廣泛應(yīng)用于生物制藥利用基因工程生產(chǎn)有藥用價值的蛋白質(zhì)、多肽產(chǎn)品已成為當(dāng)今世界一項重大產(chǎn)業(yè)，并將有望成為21世紀(jì)的支柱產(chǎn)業(yè)。1982年首先利用重組DNA技術(shù)合成人胰島素并投放市場，標(biāo)志著生物工程藥物時代的開始。迄今為止，已有50多種基因工程藥物上市，近千種處于研發(fā)狀態(tài)，形成一個巨大的高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)，產(chǎn)生了不可估量的社會效益和經(jīng)濟(jì)效益。二、重組DNA技術(shù)還應(yīng)用于醫(yī)學(xué)的其他諸多方面

疾病相關(guān)基因的發(fā)現(xiàn)與鑒定轉(zhuǎn)基因和基因打靶加速了人類基因組計劃的完成疾病的基因診斷和基因治療PirBsupportsthecapacityofnormalandleukemiahematopoieticstemcells.

[PirB(pairedIg-likereceptor)對造血干細(xì)胞和急性髓細(xì)胞性白血病干細(xì)胞的細(xì)胞命運(yùn)調(diào)控作用方面的研究]

Nature,Naturecellbiology,Blood(Underreview)Humanmenstrualbloodandplacentalartery-derivedendothelialcellsconferhumandystrophinexpressioninthemurinemodelofDuchennemusculardystrophy.[成體干細(xì)胞的骨骼肌誘導(dǎo)分化方面的研究]HumMolGenet,JCellPhysiol,StemCells,MolBiolCell

德克薩斯大學(xué)西南醫(yī)學(xué)中心是美國著名的生物醫(yī)學(xué)研究中心，它是美國頂級的致力于醫(yī)學(xué)教育和生物醫(yī)學(xué)科學(xué)研究的研究型大學(xué)之一。

教職員工中有6名諾貝爾獎得主（85年Brown/Goldestein,88年JohannDeisenhofer,94年AlfredGilman,04年LindaBuck,11年BruceBeutler,包括13年sudhof)，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，德克薩斯大學(xué)西南醫(yī)學(xué)中心走出的諾貝爾獎人數(shù)要多于NIH，哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院以及斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)院。InAML,thebonemarrowproducestoomanymonocytesorgranulocytesthatarenotfunctional.CurrentAMLtreatmentoptionsinclude: Chemotherapy Radiationtherapy Stemcelltransplantation OtherdrugtherapiesAcutemyeloidleukaemia(AML)Mostofpatientsrelapsewithin5yearsdespiteofcontinuoustreatment.TheleukemiastemcellssurvivechemotherapyandcancauseAMLrelapse.55Activatingandinhibitorypathwaysofimmunesystem56PirBisexpressedinBcells,mastcells,macrophages,granulocytesanddendriticcells(DCs).PirBcontainsimmunoreceptortyrosine?basedinhibitorymotifs(ITIMs),andinhibitsreceptor-mediatedactivationsignaling.LILRB2/PirB:leukocyteIg-likereceptor,subfamilyB2/pairedIg-likereceptorITIMx457AmodeloftheinterplaybetweenHSCsandtheimmunesystemQ1:PirBfunctioninhematopoieticstemcellsPirB?58PirBexpression

patterninmouseHSCsPirBPirBLSK

:Lin-Sca-1+c-kit+59PirBsupportstherepopulationofmouseHSCsLong-termrepopulation:

(8–24weekspost-transplantation)Short-termrepopulation:

(4–6weekspost-transplantation)CD45.1miceCD45.2donorcells(PirBKOorWTHSCs)HarvestPBcellsRepopulationAnalyze3~24WLin-Sca-1+c-kit+*p<0.0560Q2:WhetherLILRB2/PirBcorrelateswithAML?61HighexpressionlevelofLILRB2genecorrelateswithpoorclinicaloutcomeinAMLpatients(n=184)LILRB2(mousePirBorthologinhuman)inAMLpatients62PirBHSCself-renewalandmaintenanceAMLsurvivalrateQ3:WhetherPirBisessentialforleukaemic haematopoiesis?？63

MLL-AF9infectedPirB-KOorWTLin-progenitors3weeksInducingleukemiaHarvestYFP+BMcells+C57BL/6BMcellsAnalyze1sttransplantation2ndtransplantationC57BL/6miceC57BL/6miceAnalyze1.2.64SurvivalcurveofmicereceivedMLL-AF9-infectedWTorPirB-KOhematopoieticprogenitorsAMLpatients(PirBmouseKO)*p<0.0565Thesizesofspleen,liver,andnumbersofperipheralbloodcellsofWTandPirB-KOAMLtransplantedmice*p<0.0566BlockofdifferentiationAbnormalcellproliferationSuppressionofapoptosisAML(AcuteMyeloidLeukemia)67Q4:Basedonobservations,wefurtherquestioned whetherPirBregulatesdifferentiationandproliferationofAMLstemcells68CharacterizationofWTandPirB-KOAMLcells69*p<0.05ComparisonofcolonyformingactivityofWT

AMLandPirB-KOAMLBMcells70WTAML1KOAML