血紅蛋白的提取和分離

知識回憶--------有關(guān)蛋白質(zhì)的幾個問題：1、含量2、組成元素3、相對分子質(zhì)量4、根本組成單位：結(jié)構(gòu)簡式：種類：5、氨基酸連接方式占細(xì)胞干重的50％以上，細(xì)胞中含量最多的有機(jī)物C、H、O、N高分子化合物氨基酸RHCCOOHNH2脫水縮合1.知識回憶--------有關(guān)蛋白質(zhì)的幾個問題：6、肽鍵7、分子結(jié)構(gòu)8、蛋白質(zhì)多樣性的原因：

(多樣性的根本原因)

9、蛋白質(zhì)的鑒定方法氨基酸肽鏈蛋白質(zhì)脫水縮合盤曲折疊（n條）CONH氨基酸的種類不同；數(shù)目成百上千；排列順序變化多端；多肽鏈的空間結(jié)構(gòu)千差萬別10、生理功能細(xì)胞和生物體的結(jié)構(gòu)物質(zhì)，是人體發(fā)育和組織更新的主要原料，具有運(yùn)輸、調(diào)節(jié)、免疫、催化等作用，是一切生命活動的主要承擔(dān)者雙縮脲試劑2.3.血紅蛋白含有四條肽鏈,每條肽鏈環(huán)繞一個亞鐵血紅素基團(tuán)，此基團(tuán)可攜帶一分子氧或一分子二氧化碳，血紅蛋白因含有血紅素而呈紅色。4.本課題的主要內(nèi)容如下：樣品處理及粗分離純化純度鑒定血紅蛋白的提取和別離方法原理方法原理方法原理方法原理凝膠色譜法電泳5.一、根底知識:樣品處理及粗別離的原理:1、別離生物大分子的根本思路是什么？2、不同蛋白質(zhì)的特性在哪些方面存在差異？3、為什么不用雞的血紅細(xì)胞而用豬的血紅細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)材料？4、用什么方法別離相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)？6.一、根底知識--蛋白質(zhì)提取和別離原理1、選用一定的物理或者化學(xué)方法別離具有不同物理或化學(xué)性質(zhì)的生物大分子。2、形狀、大小、電荷性質(zhì)和多少、溶解度、吸附性質(zhì)、親和力等千差萬別。提取分離方法凝膠色譜法

7.閱讀并答復(fù)〔P64〕1、凝膠色譜法另一個名稱是什么？2、凝膠色譜法別離蛋白質(zhì)的依據(jù)是什么？3、凝膠的實(shí)質(zhì)是什么？4、凝膠色譜法的原理是什么？

根底知識〔一〕凝膠色譜法8.1、凝膠色譜法的別名：分配色譜法是根據(jù)相對分子質(zhì)量的大小別離蛋白質(zhì)的有效方法。3、凝膠實(shí)質(zhì)

①性質(zhì)：一些微小的多孔球體，球內(nèi)含許多貫穿的通道；

②化學(xué)本質(zhì)：多糖類化合物：③實(shí)例：葡聚糖、瓊脂糖：根底知識〔一〕凝膠色譜法2、依據(jù)的特性蛋白質(zhì)分子量的大小。4、原理9.原理：當(dāng)不同的蛋白質(zhì)通過凝膠時，相對〔〕的蛋白質(zhì)容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，路程〔〕，移動速度〔〕，而〔〕的蛋白質(zhì)無法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，只能在〔〕移動，路程〔〕，移動速度〔〕，相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)因此得以別離。分子質(zhì)量較小較長較慢相對分子質(zhì)量較大凝膠外部較短較快根底知識〔一〕凝膠色譜法10.11.用凝膠色譜法別離蛋白質(zhì)時，分子量大的蛋白質(zhì)A．路程較長，移動速度較慢B．路程較長，移動速度較快C．路程較短，移動速度較慢D．路程較短，移動速度較快D12.相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)在凝膠中的進(jìn)行過程可表示為圖中哪一個B13.1、之前在什么地方遇見過緩沖物質(zhì)？2、緩沖物質(zhì)有哪些？作用是什么？3、本實(shí)驗(yàn)加的是什么緩沖液？為何要加緩沖液？〔二〕、緩沖溶液14.由弱酸和相應(yīng)的強(qiáng)堿弱酸鹽組成。如H2CO3/NaHCO3，醋酸/醋酸鈉，NaH2PO4/Na2HPO4等緩沖溶液－－洗脫劑組成：作用：抵抗外界酸堿對溶液pH的干擾，保持pH與體內(nèi)環(huán)境根本一致?！捕场⒕彌_溶液15.根底知識〔三〕電泳16.閱讀第65頁的相關(guān)內(nèi)容，答復(fù)以下問題：1、電泳的概念；2、電泳的原理；3、電泳的種類；4、SDS的作用。根底知識〔三〕電泳17.2．凝膠電泳法：(三)電泳1.電泳的概念指帶電粒子在電場的作用下發(fā)生遷移的過程.〔1〕原理：①許多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解離的基團(tuán)，在一定的PH下，這些基團(tuán)會帶上正電或負(fù)電。②在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電荷相反的電極移動。③電泳利用了待別離樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身的大小，形狀的不同使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的別離。18.(三)電泳〔2〕類型：

瓊脂糖凝膠電泳

聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS)〔3〕SDS作用為了消除靜電荷對遷移率的影響可以在凝膠中參加SDS。電泳結(jié)果陽極19.使用SDS-聚丙烯酰胺電泳過程中，不同蛋白質(zhì)的電泳遷移率完全取決于A電荷的多少B分子的大小C肽鏈的多少D分子形狀的差異電泳結(jié)果陽極20.樣品處理粗分離純化純度鑒定血液組成成分

1.洗滌紅細(xì)胞

2.釋放血紅蛋白

3.分離血紅蛋白

4.透析血紅蛋白血紅蛋白的提取和別離跳轉(zhuǎn)21.血液組成成分閱讀思考：血液由______和________兩局部組成。血細(xì)胞中________細(xì)胞數(shù)量最多，紅細(xì)胞的含量最高的有機(jī)化合物是_____________。該化合物是由_____________和____________構(gòu)成的，其中每個亞基中都含有一個能與O2和CO2結(jié)合的___________基團(tuán)。血漿血細(xì)胞紅細(xì)胞血紅蛋白2條α-肽鏈2條β-肽鏈

亞鐵血紅素返回22.1.洗滌紅細(xì)胞閱讀思考：洗滌的目的是什么？洗滌過程：血液100mL3g檸檬酸鈉低速離心2min紅細(xì)胞血漿吸出血漿紅細(xì)胞5倍體積生理鹽水?dāng)嚢?0min重復(fù)洗滌3次，直至上清液沒有黃色23.采集得到豬血24.初次離心后的結(jié)果25.3次洗滌后的結(jié)果返回26.2.釋放血紅蛋白閱讀思考：釋放血紅蛋白過程中，在洗滌好的紅細(xì)胞參加了哪些物質(zhì)？為了加速釋放過程，采取了什么措施？①目的分析：②蒸餾水的作用是______________________________。③參加甲苯的作用是____________________________。④充分?jǐn)嚢璧哪康氖莀___________________________。使紅細(xì)胞大量吸水脹裂溶解紅細(xì)胞的細(xì)胞膜加速紅細(xì)胞的破裂27.(2)血紅蛋白的釋放：加蒸餾水到原血液體積，再加40％體積的甲苯，置于磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢?0分鐘〔加速細(xì)胞破裂〕,細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白。28.磁力攪拌器返回29.2、粗別離血紅蛋白溶液：①過程：將攪拌好混合液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，以2000r/min的速度離心10min。②試管中溶液層次：4層。③別離：用濾紙過濾，除去脂溶性沉淀層，于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的紅色透明液體。30.第1層〔最上層〕：甲苯層〔無色透明〕第2層〔中上層〕：脂溶性物質(zhì)沉淀層〔白色薄層固體〕第3層〔中下層〕：血紅蛋白的水溶液層〔紅色透明液體〕第4層〔最下層〕：雜質(zhì)沉淀層〔暗紅色〕試管中溶液層次返回31.4.透析血紅蛋白32.練習(xí)穩(wěn)固1、隨著人類跨入蛋白質(zhì)組時代，對蛋白質(zhì)的研究和應(yīng)用越來越深入，首先要做的一步是A弄清各種蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)B弄清各種蛋白質(zhì)的功能C弄清各種蛋白質(zhì)的合成過程D獲得高純度的蛋白質(zhì)33.2、在采血容器中參加檸檬酸鈉的目的是A調(diào)節(jié)pHB維持紅細(xì)胞的能量供給C防止微生物生長D防止血液凝固34.樣品處理粗分離純化純度鑒定血液組成成分

1.洗滌紅細(xì)胞

2.釋放血紅蛋白

3.分離血紅蛋白

4.透析血紅蛋白血紅蛋白的提取和別離跳轉(zhuǎn)35.純化－－凝膠色譜操作1.凝膠色譜柱的制作：2.凝膠色譜柱的裝填：教材圖5－193.樣品的參加和洗脫返回36.裝配好的凝膠柱色譜柱的制作過程：準(zhǔn)備材料→加工橡皮塞→安裝色譜柱37.38.〔二〕凝膠色譜操作〔1〕凝膠色譜柱的制作：①取長40厘米，內(nèi)徑1.6厘米的玻璃管，兩端需用砂紙磨平。②底塞的制作：打孔→挖出凹穴→安裝移液管頭部→覆蓋尼龍網(wǎng)，再用100目尼龍紗包好，插到玻璃管的一端。③頂塞的制作：打孔→安裝玻璃管。④組裝：將上述三者按相應(yīng)位置組裝成一個整體。⑤安裝其他附屬結(jié)構(gòu)。39.返回40.2.凝膠色譜柱的裝填1、凝膠的選擇材料?G代表意義?2、簡單步驟？3、注意點(diǎn)：實(shí)驗(yàn)操作〔二〕凝膠色譜操作1、選擇交聯(lián)葡聚糖凝膠〔G-75〕“G〞表示凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及別離范圍,75表示凝膠的吸水值，即每克凝膠膨脹時吸水7.5克。2、固定色譜柱－－配凝膠懸液－－裝填色譜柱－－洗滌平衡41.3、凝膠色譜柱的裝填本卷須知：〔1〕、凝膠裝填時盡量緊密，以降低凝膠顆粒之間的空隙?！?〕、裝填凝膠柱時不得有氣泡存在：因?yàn)闅馀輹噥y洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低別離效果。〔3〕、洗脫液面不要低于凝膠外表，否那么可能有氣泡混入，影響液體在柱內(nèi)的流動與最終生物大分子物質(zhì)的別離效果?！?〕、不能發(fā)生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現(xiàn)象。42.3.樣品參加與洗脫注意：正確的加樣操作是：1、不要觸及并破壞凝膠面。2、貼壁加樣。3、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動。43.3.樣品參加與洗脫①調(diào)節(jié)緩沖液面：翻開下端出口，使柱內(nèi)緩沖液緩慢下降到與凝膠面平齊，關(guān)閉出口。②滴加透析樣品：吸管吸1ml樣品加到色譜柱的頂端，滴加樣品時，吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動加樣，同時注意不要破壞凝膠面。③樣品滲入凝膠床：加樣后翻開下端出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)，等樣品完全進(jìn)入凝膠層后，關(guān)閉下端出口。④洗脫：小心參加pH=7.0的20mmol/l的磷酸緩沖液到適當(dāng)高度，連接緩沖液洗脫瓶，翻開下端出口進(jìn)行洗脫。⑤收集：待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時，用試管收集流出液，每5ml收集一試管，連續(xù)收集?！苍趧e離過程中，如果紅色區(qū)帶均勻一致的移動，說明色譜柱制作成功〕⑥注意：正確的加樣操作：1、不要觸及并破壞凝膠面。2、貼壁加樣。3、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動。44.收集得到的純化后的血紅蛋白45.樣品的參加和洗脫的操作不正確的選項(xiàng)是A．加樣前，翻開色譜柱下端的流出口，使柱內(nèi)凝膠面上的緩沖液緩慢下降到凝膠面的下面B．加樣后，翻開下端出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)C．等樣品完全進(jìn)入凝膠層后，關(guān)閉下端出口D．用吸管小心的將1ml透析后的樣品加到色譜柱的頂端，不要破壞凝膠面

A46.以下是有關(guān)血紅蛋白提取和別離的相關(guān)操作，其中正確的選項(xiàng)是〔〕A．可采集豬血作為實(shí)驗(yàn)材料B．用蒸餾水重復(fù)洗滌紅細(xì)胞C．血紅蛋白釋放后應(yīng)低速短時間離心D．洗脫液接近色譜柱底端時開始收集流出液

A47.觀察你處理的血液樣品離心后是否分層〔見教科書圖5-18〕，如果分層不明顯，可能是洗滌次數(shù)少、未能除去血漿蛋白的原因。此外，離心速度過高和時間過長，會使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞一同沉淀，也得不到純潔的紅細(xì)胞，影響后續(xù)血紅蛋白的提取純度。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析與評價

1、你是否完成了對血液樣品的處理？你能描述處理后的樣品發(fā)生了哪些變化嗎？48.2、你裝填的凝膠色譜柱是否有氣泡產(chǎn)生？你的色譜柱裝填得成功嗎？你是如何判斷的？由于凝膠是一種半透明的介質(zhì)，因此可以在凝膠柱旁放一支與凝膠柱垂直的日光燈，檢查凝膠是否裝填得均勻。此外，還可以參加大分子的有色物質(zhì)，例如藍(lán)色葡聚糖—2000或紅色葡聚糖，觀察色帶移動的情況。如果色帶均勻、狹窄、平整，說明凝膠色譜柱的性能良好。如果色譜柱出現(xiàn)紋路或是氣泡，輕輕敲打柱體以消除氣泡，消除不了時要重新裝柱。49.如果凝膠色譜柱裝填得很成功、別離操作也正確的話，能清楚地看到血紅蛋白的紅色區(qū)帶均勻、狹窄、平整，隨著洗脫液緩慢流出；如果紅色區(qū)帶歪曲、散亂、變寬，說明別離的效果不好，這與凝膠色譜柱的裝填有關(guān)。3、你能觀察到蛋白質(zhì)的別離過程中，紅色區(qū)帶的移動嗎？請描述紅色區(qū)帶的移動情況，并據(jù)此判斷別離效果？50.知識總結(jié)血紅蛋白的提取和別離蛋白質(zhì)分子的差異性凝膠色譜法原理分離過程凝膠電泳法緩沖溶液組成作用蛋白質(zhì)的提取分離樣品處理粗分