生物化學(xué)課件：02 多肽與蛋白質(zhì)下

蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系StructureandFunctionofProteins第三節(jié)（一）一級結(jié)構(gòu)是空間構(gòu)象的基礎(chǔ)一、蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)是高級結(jié)構(gòu)與功能的基礎(chǔ)牛核糖核酸酶的一級結(jié)構(gòu)二硫鍵

天然狀態(tài)，有催化活性

尿素、β-巰基乙醇

去除尿素、β-巰基乙醇非折疊狀態(tài)，無活性角蛋白keratin和膠原蛋白collagen甘氨酸在內(nèi)部

-螺旋亞胺氨酸在拐角處（二）一級結(jié)構(gòu)相似的蛋白質(zhì)具有相似的高級結(jié)構(gòu)與功能────────────────────────

氨基酸殘基序號胰島素───────────────

A8A9A10B30────────────────────────

人ThrSerIleThr

牛AlaSerValAla

豬ThrSerIleAla

羊AlaGlyValAla

馬Thr

GlyIleAla

狗ThrSerIleAla────────────────────────中心紫色的是二價鋅離子和與其配位的6個組氨酸咪唑基，黃色的是二硫鍵第一代胰島素-動物胰島素第二代胰島素-人胰島素第三代胰島素-胰島素類似物NPY(α-MSH,β-MSH)共有一段相同的氨基酸序列，因此，ACTH也可促進(jìn)皮下黑色素生成，但作用較弱。(三)氨基酸序列提供重要的生物化學(xué)信息一些廣泛存在于生物界的蛋白質(zhì)如細(xì)胞色素(cytochromeC)，比較它們的一級結(jié)構(gòu)，可以幫助了解物種進(jìn)化間的關(guān)系。Why鑒于細(xì)胞色素C分子在呼吸電子傳遞鏈中不可或缺的地位，其分子結(jié)構(gòu)是相對保守的。但隨著生物的進(jìn)化，其分子組成結(jié)構(gòu)也必將出現(xiàn)變異，只是相對于其他蛋白來說，細(xì)胞色素C分子的很多變異可能導(dǎo)致生物體的電子傳遞出現(xiàn)問題而導(dǎo)致死亡，因此，其分子進(jìn)化要緩慢而保守（四）重要蛋白質(zhì)氨基酸序列的改變可引起疾病例：鐮刀形紅細(xì)胞貧血N-val·his·leu·thr·pro·glu·glu·····C(146)HbS

β肽鏈HbA

β肽鏈N-val·his·leu·thr·pro·val

·glu·····C(146)

這種由蛋白質(zhì)分子發(fā)生變異所導(dǎo)致的疾病，稱為“分子病”。20-30%的蛋白質(zhì)具有多態(tài)性鐮狀紅細(xì)胞性貧血鐮狀細(xì)胞貧血是一種常染色體顯性遺傳血紅蛋白(Hb)病。因β-肽鏈第6位氨基酸谷氨酸被纈氨酸所代替，構(gòu)成鐮狀血紅蛋白(HbS),取代了正常Hb(HbA)。患者是黑人或與黑人有血緣關(guān)系。異常血紅蛋白β鏈的第6位谷氨酸被纈氨酸所代替。這個疏水氨基酸正好適合另一血紅蛋白分子β鏈EF角上的“口袋”，這使兩條血紅蛋白鏈互相“鎖”在一起，最終與其他血紅蛋白鏈共同形成一個不溶的長柱形螺旋纖維束，使紅細(xì)胞扭旋成鐮刀形。反例細(xì)胞色素(cytochromeC)1.肌紅蛋白/血紅蛋白含有血紅素輔基

二、蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)表現(xiàn)功能血紅素結(jié)構(gòu)Fe2+6個配位鍵四個吡咯環(huán)(一)血紅蛋白構(gòu)象改變引起功能變化血紅蛋白亞基與肌紅蛋白結(jié)構(gòu)類似都含有血紅素輔基肌紅蛋白(myoglobin，Mb)

肌紅蛋白是一個只有三級結(jié)構(gòu)的單鏈蛋白質(zhì)，有8段α-螺旋結(jié)構(gòu)。血紅素分子中的兩個丙酸側(cè)鏈以離子鍵形式與肽鏈中的兩個堿性氨基酸側(cè)鏈上的正電荷相連，加之肽鏈中的F8組氨酸殘基還與Fe2+形成配位結(jié)合，所以血紅素輔基與蛋白質(zhì)部分穩(wěn)定結(jié)合。血紅蛋白(hemoglobin，Hb)血紅蛋白具有4個亞基組成的四級結(jié)構(gòu)。Hb各亞基的三級結(jié)構(gòu)與Mb極為相似。Hb亞基之間通過8對鹽鍵，使4個亞基緊密結(jié)合而形成親水的球狀蛋白。Hb與Mb一樣能可逆地與O2結(jié)合，Hb與O2結(jié)合后稱為氧合Hb。氧合Hb占總Hb的百分?jǐn)?shù)（稱百分飽和度）隨O2濃度變化而改變。2.血紅蛋白的構(gòu)象變化影響結(jié)合氧的能力

肌紅蛋白(Mb)和血紅蛋白(Hb)的氧解離曲線協(xié)同效應(yīng)(cooperativity)一個寡聚體蛋白質(zhì)的一個亞基與其配體結(jié)合后，能影響此寡聚體中另一個亞基與配體結(jié)合能力的現(xiàn)象，稱為協(xié)同效應(yīng)。如果是促進(jìn)作用則稱為正協(xié)同效應(yīng)(positivecooperativity)如果是抑制作用則稱為負(fù)協(xié)同效應(yīng)

(negativecooperativity)O2血紅素與氧結(jié)合后，鐵原子半徑變小，就能進(jìn)入卟啉環(huán)的小孔中，繼而引起肽鏈位置的變動。別構(gòu)效應(yīng)(allostericeffect)蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的改變伴隨其功能的變化，稱為別構(gòu)效應(yīng)。在氧分子導(dǎo)致Hb亞基構(gòu)象改變的例子中，小分子O為別構(gòu)效應(yīng)劑，Hb為別構(gòu)蛋白。（二）蛋白質(zhì)構(gòu)象改變可導(dǎo)致構(gòu)象病蛋白質(zhì)構(gòu)象疾?。≒roteinConformationalDiseases）

：若蛋白質(zhì)的折疊發(fā)生錯誤，盡管其一級結(jié)構(gòu)不變，但蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生改變，仍可影響其功能，嚴(yán)重時可導(dǎo)致疾病發(fā)生。蛋白質(zhì)構(gòu)象改變導(dǎo)致疾病的機制：有些蛋白質(zhì)錯誤折疊后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉樣纖維沉淀，產(chǎn)生毒性而致病，表現(xiàn)為蛋白質(zhì)淀粉樣纖維沉淀的病理改變。這類疾病包括：人紋狀體脊髓變性病、老年癡呆癥、亨丁頓舞蹈病、瘋牛病等。Aggregationofamyloidbetaproteinfragments瘋牛病是由朊病毒蛋白(prionprotein,PrP)引起的一組人和動物神經(jīng)退行性病變。正常的PrP富含α-螺旋，稱為PrPc。PrPc在某種未知蛋白質(zhì)的作用下可轉(zhuǎn)變成全為β-折疊的PrPsc，從而致病。PrPcα-螺旋PrPscβ-折疊正常瘋牛病瘋牛病三、蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾、相互作用可改變其功能最初基因表達(dá)的產(chǎn)物——蛋白質(zhì)，并不一定為具有生物學(xué)功能的成熟蛋白質(zhì)，新生蛋白質(zhì)通常還需要進(jìn)行蛋白質(zhì)翻譯后的化學(xué)修飾（第十八章）。四、生物信息學(xué)探討蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系

生物信息學(xué)（bioinformatics）是一門基于信息學(xué)和計算的新興交叉學(xué)科，應(yīng)用計算機程序法將復(fù)雜的生物學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行整合與分析，從而闡明生命現(xiàn)象中難以解釋的復(fù)雜分子機制。人類蛋白質(zhì)組折疊計劃/項目（ThehumanProteomeFoldingProject）Folding@home第四節(jié)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)Chemical

andPhysicalPropertiesofProteins

一、蛋白質(zhì)具有兩性電離性質(zhì)蛋白質(zhì)分子除兩端的氨基和羧基可解離外，氨基酸殘基側(cè)鏈中某些基團(tuán)，在一定的溶液pH條件下都可解離成帶負(fù)電荷或正電荷的基團(tuán)。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液處于某一pH時，蛋白質(zhì)解離成正、負(fù)離子的趨勢相等，即成為兼性離子，凈電荷為零，此時溶液的pH稱為蛋白質(zhì)的等電點。蛋白質(zhì)的等電點(isoelectricpoint,pI)

人體體液pH7.4蛋白質(zhì)大多pI5.0,大多解離為陰離子堿性蛋白質(zhì)：魚精蛋白；組蛋白酸性蛋白質(zhì)：胃蛋白酶，絲蛋白

二、蛋白質(zhì)具有膠體性質(zhì)蛋白質(zhì)屬于生物大分子之一，分子量可自1萬至100萬之間，其分子的直徑可達(dá)1～100nm，為膠粒范圍之內(nèi)。蛋白質(zhì)膠體穩(wěn)定的因素（防止析出）：顆粒表面電荷親水（水化膜）+++++++帶正電荷的蛋白質(zhì)－－－－－－－－帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)在等電點的蛋白質(zhì)水化膜++++++++帶正電荷的蛋白質(zhì)－－－－－－－－帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)顆粒酸堿酸堿酸堿脫水作用脫水作用脫水作用去水去電后溶液中蛋白質(zhì)的聚集和沉淀三、很多因素可引起蛋白質(zhì)變性在某些物理和化學(xué)因素作用下，其特定的空間構(gòu)象被破壞，也即有序的空間結(jié)構(gòu)變成無序的空間結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致其理化性質(zhì)改變和生物活性的喪失。蛋白質(zhì)的變性(denaturation)

造成變性的因素

變性的本質(zhì)——

破壞非共價鍵和二硫鍵，不改變蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)。如加熱、乙醇等有機溶劑、強酸、強堿、重金屬離子及生物堿試劑等。

應(yīng)用舉例臨床醫(yī)學(xué)上，變性因素常被應(yīng)用來消毒及滅菌。此外,防止蛋白質(zhì)變性也是有效保存蛋白質(zhì)制劑（如疫苗等）的必要條件。

若蛋白質(zhì)變性程度較輕，去除變性因素后，蛋白質(zhì)仍可恢復(fù)或部分恢復(fù)其原有的構(gòu)象和功能，稱為復(fù)性。蛋白質(zhì)的復(fù)性(renaturation)

天然狀態(tài)，有催化活性

尿素、β-巰基乙醇

去除尿素、β-巰基乙醇非折疊狀態(tài)，無活性分子伴侶，熱激蛋白。。。。在一定條件下，蛋白疏水側(cè)鏈暴露在外，肽鏈融會相互纏繞繼而聚集，因而從溶液中析出。變性的蛋白質(zhì)易于沉淀，有時蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀，但并不變性（結(jié)晶）。蛋白質(zhì)變性后的絮狀物加熱可變成比較堅固的凝塊，此凝塊不易再溶于強酸和強堿中。

蛋白質(zhì)沉淀蛋白質(zhì)的凝固作用(proteincoagulation)

四、蛋白質(zhì)在紫外光譜區(qū)有特征性吸收峰由于蛋白質(zhì)分子中含有共軛雙鍵的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波長處有特征性吸收峰。蛋白質(zhì)的OD280與其濃度呈正比關(guān)系，因此可作蛋白質(zhì)定量測定。五、蛋白質(zhì)呈色反應(yīng)可用于溶液蛋白質(zhì)測定（一）蛋白質(zhì)經(jīng)水解后產(chǎn)生茚三酮反應(yīng)蛋白質(zhì)經(jīng)水解后產(chǎn)生的氨基酸也可發(fā)生茚三酮反應(yīng)(ninhydrinreaction)。（二）肽鏈中的肽鍵可與雙縮脲試劑反應(yīng)蛋白質(zhì)和多肽分子中肽鍵在稀堿溶液中與硫酸銅共熱，呈現(xiàn)紫色或紅色，此反應(yīng)稱為雙縮脲反應(yīng)(biuretreaction)。雙縮脲反應(yīng)可用來檢測蛋白質(zhì)水解程度。蛋白質(zhì)的分離、純化、鑒定和結(jié)構(gòu)分析Isolation,Purification,IdentificationandStructuralAnalysisofProteins第五節(jié)一、透析及超濾法可清除蛋白質(zhì)溶液中的小分子化合物利用透析袋把大分子蛋白質(zhì)與小分子化合物分開的方法。應(yīng)用正壓或離心力使蛋白質(zhì)溶液透過有一定截留分子量的超濾膜，達(dá)到濃縮蛋白質(zhì)溶液的目的。超濾法

透析(dialysis)二、丙酮沉淀、鹽析及免疫沉淀是常用的蛋白質(zhì)沉淀方法使用丙酮沉淀時，必須在0～4℃低溫下進(jìn)行，丙酮用量一般10倍于蛋白質(zhì)溶液體積。蛋白質(zhì)被丙酮沉淀后，應(yīng)立即分離。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。鹽析(saltprecipitation)是將硫酸銨、硫酸鈉或氯化鈉等加入蛋白質(zhì)溶液，使蛋白質(zhì)表面電荷被中和以及水化膜被破壞，導(dǎo)致蛋白質(zhì)沉淀。將某一純化蛋白質(zhì)免疫動物可獲得抗該蛋白的特異抗體。利用特異抗體識別相應(yīng)的抗原蛋白，并形成抗原抗體復(fù)合物的性質(zhì)，可從蛋白質(zhì)混合溶液中分離獲得抗原蛋白。免疫沉淀法（immunoprecipitation）三、電泳是蛋白質(zhì)分離與鑒定的常用方法蛋白質(zhì)在高于或低于其pI的溶液中為帶電的顆粒，在電場中能向正極或負(fù)極移動。這種通過蛋白質(zhì)在電場中泳動而達(dá)到分離各種蛋白質(zhì)的技術(shù),稱為電泳(elctrophoresis)

。根據(jù)支撐物的不同，可分為薄膜電泳、凝膠電泳等。

SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，常用于蛋白質(zhì)分子量的測定。IEE等電聚焦電泳，通過蛋白質(zhì)等電點的差異而分離蛋白質(zhì)的電泳方法。2-DGE雙向凝膠電泳，蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要技術(shù)。幾種重要的蛋白質(zhì)電泳：2-DGE雙向凝膠電泳氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀吸附力質(zhì)譜分析是一種測量離子荷質(zhì)比（電荷-質(zhì)量比）的分析方法，其基本原理是使試樣中各組分在離子源中發(fā)生電離，生成不同荷質(zhì)比的帶正電荷的離子，經(jīng)加速電場的作用，形成離子束，進(jìn)入質(zhì)量分析器，利用電場和磁場使發(fā)生相反的速度色散，將它們分別聚焦而得到質(zhì)譜圖，從而確定其質(zhì)量。四、應(yīng)用相分配或親和原理可將蛋白質(zhì)進(jìn)行層析分離待分離蛋白質(zhì)溶液（流動相）經(jīng)過一個固態(tài)物質(zhì)（固定相）時，根據(jù)溶液中待分離的蛋白質(zhì)顆粒大小、電荷多少及親和力等，使待分離的蛋白質(zhì)組分在兩相中反復(fù)分配，并以不同速度流經(jīng)固定相而達(dá)到分離蛋白質(zhì)的目的。層析(chromatography)離子交換層析：利用各蛋白質(zhì)的電荷量及性質(zhì)不同進(jìn)行分離。凝膠過濾(gelfiltration)又稱分子篩層析，利用各蛋白質(zhì)分子大小不同分離。蛋白質(zhì)分離常用的層析方法五、利用蛋白質(zhì)顆粒沉降行為不同可進(jìn)行超速離心分離超速離心法(ultracentrifugation)既可以用來分離純化蛋白質(zhì)也可以用作測定蛋白質(zhì)的分子量。蛋白質(zhì)在離心場中的行為用沉降系數(shù)(sedimentationcoefficient,S)表示,沉降系數(shù)與蛋白質(zhì)的密度和形狀相關(guān)。因為沉降系數(shù)S大體上和分子量成正比關(guān)系，故可應(yīng)用超速離心法測定蛋白質(zhì)分子量，但對分子形狀的高度不對稱的大多數(shù)纖維狀蛋白質(zhì)不適用。s=v/ω2r。s是沉降系數(shù)，ω是離心轉(zhuǎn)子的角速度（弧度/秒），r是到旋轉(zhuǎn)中心的距離，v是沉降速度。六、用化學(xué)或反向遺傳學(xué)方法可分析或演繹多肽鏈的氨基酸序列分析已純化蛋白質(zhì)的氨基酸殘基組成（離子交換層析）測定多肽鏈的氨基末端與羧基末端為何種氨基酸殘基把肽鏈水解成片段，分別進(jìn)行分析測定各肽段的氨基酸排列順序，一般采用Edman降解法一般需用數(shù)種水解法，并分析出各肽段中的氨基酸順序，然后經(jīng)過組合排列對比，最終得出完整肽鏈中氨基酸順序的結(jié)果。化學(xué)法溶解法二硝基氟苯法（DNP法）肼解法二甲基氨基萘磺酰氯法（Dansyl-氯法）還原成氨基醇法亮氨酸氨肽酶法細(xì)胞外氨肽酶法羧肽酶A法羧肽酶B法羧肽酶C法氨基酸和肽的末端測定法通過核酸來推演蛋白質(zhì)中的氨基酸序列：按照三聯(lián)密碼的原則推演出氨基酸的序列分離編碼蛋白質(zhì)的基因測定DNA序列排列出mRNA序列七、應(yīng)用物理學(xué)、生物信息學(xué)原理可進(jìn)行蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)測定或預(yù)測通常采用圓二色光譜(circulardichroism，CD)測定溶液狀態(tài)下的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)含量。

-螺旋的CD峰有222nm處的負(fù)峰、208nm處的負(fù)峰和198nm處的正峰3個成分；而

-折疊的CD譜不很固定。（一）圓二色光譜可估算蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)比例X射線衍射法(X-raydiffraction)和核磁共振技術(shù)(nuclearmagneticresonance,NMR)是研究蛋白質(zhì)三維空間結(jié)構(gòu)最準(zhǔn)確的方法。（二）X射線衍射法和核磁共振技術(shù)用于三維空間結(jié)構(gòu)分析*用分子力學(xué)、分子動力學(xué)的方法，根據(jù)物理化學(xué)的基本原理，從理論上計算蛋白質(zhì)分子的空間結(jié)構(gòu)。（三）根據(jù)蛋白質(zhì)的氨基酸序列預(yù)測三維空間結(jié)構(gòu)*通過對已知空間結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，找出一級結(jié)構(gòu)與空間結(jié)構(gòu)的關(guān)系，總結(jié)出規(guī)律，用于新的蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的預(yù)測。第六節(jié)

血漿蛋白質(zhì)

PlasmaProteins一、采用電泳法可將血漿蛋白質(zhì)分成若干組分

電泳法是分離、分析血漿蛋白質(zhì)的主要方法。采用醋酸纖維素膜電泳，可將血漿蛋白質(zhì)分為5個組分。按泳動快慢依次為：清蛋白、α1-、α2-、β-和γ-球蛋白（globulin）。而采用聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)可將血漿蛋白分離出100種以上。A

白蛋白

1

2