五毛細(xì)管電泳課件

電泳是電解質(zhì)中帶電粒子在電場力作用下，以不同的速度向電荷相反方向遷移的現(xiàn)象.利用這種現(xiàn)象對(duì)化學(xué)和生物化學(xué)組分進(jìn)行分離的技術(shù)稱之為電泳技術(shù)。叢20世紀(jì)30~40年代起,相繼發(fā)展了多種基于抗對(duì)流介質(zhì)的電泳技術(shù)(如紙電泳，凝膠電泳等).傳統(tǒng)的電泳技術(shù)由于受到焦耳熱的限制，只能在低電場強(qiáng)度下進(jìn)行電泳操作，分離時(shí)間長，效率低.80年代初,細(xì)徑毛細(xì)管被用于電泳，由此產(chǎn)生了一種新型的分析技術(shù)——毛細(xì)管電泳。毛細(xì)管的結(jié)構(gòu)：毛細(xì)管電泳通常使用內(nèi)徑為25-100μm的彈性（聚酰亞胺）涂層熔融石英管。一.概述12/3/20231毛細(xì)管的特點(diǎn)是：容積小；側(cè)面/截面積大而散熱快、可承受高電場；可使用自由溶液、凝膠等為支持介質(zhì)；在溶液介質(zhì)下能產(chǎn)生平面形狀的電滲流。原理

毛細(xì)管電泳(CE)又稱高效毛細(xì)管電泳(HPCE),是指離子或帶電粒子以毛細(xì)管為分離室,以高壓直流電場為驅(qū)動(dòng)力,依據(jù)樣品中各組分之間淌度和分配行為上的差異而實(shí)現(xiàn)分離的液相分離分析技術(shù)。由于毛細(xì)管內(nèi)徑小，表面積和體積的比值大,易于散熱，因此毛細(xì)管電泳可以減少焦耳熱的產(chǎn)生,這是CE和傳統(tǒng)電泳技術(shù)的根本區(qū)別。12/3/20232CE開始主要用于蛋白質(zhì)，多肽的分析,以后逐漸被廣泛應(yīng)用于生物，化學(xué)，醫(yī)藥，環(huán)保等領(lǐng)域。它具有分離效率高，分析速度快，樣品及試劑用量少,潔凈無污染等特點(diǎn),和HPLC(高效液相色譜法)成為分析化學(xué)中互補(bǔ)的技術(shù)。隨著生命科學(xué)的發(fā)展，毛細(xì)管電泳技術(shù)也有了廣闊的發(fā)展空間.目前，不同分離模式的毛細(xì)管電泳技術(shù)正成為最重要的生物樣品分離分析手段。12/3/20233根據(jù)分離原理分為以下幾種類型①毛細(xì)管區(qū)帶電泳（capillaryzoneelectrophoresis，CZE）；②毛細(xì)管等速電泳（capillarychromatography，CITP）；③毛細(xì)管膠速電動(dòng)色譜（micellerelectrokineticcapillarychromatography，MECC）；④毛細(xì)管凝膠電泳（capillarygelelectrophoresis，CGE）；⑤毛細(xì)管等電聚焦（capillaryisoelectricfocusing，CIEF）。12/3/20234二.毛細(xì)管電泳基本概念和原理1.基本概念有效長度(Ld,cm)：毛細(xì)管的入口端到檢測(cè)器窗口的距離；遷移時(shí)間(tmmin)：帶電粒子在電場作用下做定向移動(dòng)的時(shí)間；電泳速度（Uepcm/s）：在單位時(shí)間內(nèi)，帶電粒子在毛細(xì)管中定向移動(dòng)的距離；電場強(qiáng)度(EV/cm)：在給定長度毛細(xì)管的兩端施加一個(gè)電場后所形成的電效應(yīng)的強(qiáng)度；電泳淌度（μep

cm2/(V.s)）帶電粒子在毛細(xì)管中定向移動(dòng)的速度與所在電場強(qiáng)度之比；12/3/20235電滲流：毛細(xì)管內(nèi)壁表面的電荷所引起的管內(nèi)液體的整體流動(dòng)，來源于外加電場對(duì)管壁溶液雙電層的作用；電滲流方向樣品分子泳動(dòng)方向1.基本概念１．使液體沿毛細(xì)管壁均勻移動(dòng)；２．使攜帶不同電性的分子均向負(fù)極移動(dòng)，中性分子也隨著電滲流一起移動(dòng)。電滲流的作用特點(diǎn)12/3/20236毛細(xì)管電泳的基本原理：毛細(xì)管電泳是以高壓電場（30kV）為驅(qū)動(dòng)力，以毛細(xì)管為分離通道。其管內(nèi)填充了緩沖液或凝膠，根據(jù)樣品中各組分之間淌度和分配的差異而實(shí)現(xiàn)分離的一類液相分離技術(shù)。

在電泳過程中，毛細(xì)管兩端插入電極液，此電極液通常與管中的緩沖液一致。正負(fù)電極連接至高電壓裝置，進(jìn)樣時(shí)樣品盤移動(dòng)，使毛細(xì)管的進(jìn)樣端及此端的電極準(zhǔn)確插入樣品管中，給予一定電場或壓力后，樣品被吸入毛細(xì)管內(nèi)，然后再將毛細(xì)管移至電極液中開始電泳。在毛細(xì)管電泳中，為了維持電荷平衡，溶液中的正離子吸附至石英表面形成雙電子層，當(dāng)在毛細(xì)管兩端施加電壓后，這層正離子趨向負(fù)極移動(dòng)，并帶動(dòng)毛細(xì)管中的溶液以液流形式移向負(fù)極（電滲）

。由于毛細(xì)管的表面積與體積比大，加上電泳時(shí)使用了高壓，電滲在毛細(xì)管電泳中具有兩大特點(diǎn)：液體沿著毛細(xì)管壁均勻流動(dòng)，其前沿是平的；攜帶不同電荷的分子朝一個(gè)方向移動(dòng)，中性分子也能隨著電滲一起移動(dòng)而實(shí)現(xiàn)分離

12/3/2023712/3/202382.毛細(xì)管電泳基本分離原理毛細(xì)管的兩端分別浸在含有電解質(zhì)的儲(chǔ)液槽中，管內(nèi)也充滿同樣的電解質(zhì),其中一端與檢測(cè)器相連.當(dāng)樣品被引入后,便開始施加電壓，樣品中各組分向檢測(cè)器方向移動(dòng),溶質(zhì)的遷移時(shí)間為:tm=lLt/UVLt---有效長度V---施加電壓U---溶質(zhì)總流速Uep---電泳速度Ueo---電滲流速度U=Uep+Ueo其中，可見，在毛細(xì)管長度一定，某時(shí)刻電壓相同的條件下，遷移時(shí)間決定于電泳速度Uep和電滲流速度Ueo,而兩者均隨組分的不同荷質(zhì)比而異;所以，基于荷質(zhì)比的差異就可以實(shí)現(xiàn)組分的分離。12/3/202393、毛細(xì)管電泳儀系統(tǒng)電泳儀進(jìn)樣系統(tǒng)

分離系統(tǒng)檢測(cè)系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)Comeon12/3/202310三.毛細(xì)管電泳的分離模式CE毛細(xì)管區(qū)帶電泳毛細(xì)管凝膠電泳膠束電動(dòng)力學(xué)毛細(xì)管色譜毛細(xì)管等電聚焦電泳

毛細(xì)管電泳有多種分離模式，給樣品分離提供了不同的選擇機(jī)會(huì).根據(jù)分離原理可分為:12/3/202311毛細(xì)管電泳的分離模式（一）毛細(xì)管區(qū)帶電泳（capillary

zone

electrophoresis，CZE

）：

毛細(xì)管和電極槽內(nèi)充有相同組分和相同濃度的電解質(zhì)溶液（緩沖液）。它是最基本、應(yīng)用最普遍的一種分離模式，尤其對(duì)于親水多肽的分離具有一定的優(yōu)越性。（二）微團(tuán)電動(dòng)毛細(xì)管色譜（micellar

electrokinetic

capillary

chromatography，MECC）：

通常有一些離子型表面活性劑（如SDS）加到緩沖液中，這類分子一端為親水基團(tuán)，其余部分為疏水內(nèi)核，親水基團(tuán)在表面，中性粒子因其本身疏水性不同而得以分離。12/3/202312（三）毛細(xì)管等電聚焦（capillary

isoelectric

focusing，CIEF）：

選用內(nèi)壁中性共價(jià)涂層消除電滲的毛細(xì)管，利用兩性電解質(zhì)形成pH梯度。CIEF具有較高的分辨力。（四）毛細(xì)管篩分電泳（capillary

sieving

electrophoresis，CSE）：

在毛細(xì)管內(nèi)填充了多聚物作為分離介質(zhì)，如甲基纖維素對(duì)分子的泳動(dòng)起著阻礙作用。其作用機(jī)制類似平板電泳凝膠的篩網(wǎng)作用，大分子較小分子所受的阻礙大，泳動(dòng)速度減慢。

毛細(xì)管電泳的分離模式12/3/202313（六）毛細(xì)管陣列電泳（capillaryarrayelectrophoresis，CAE）：

CAE是在常規(guī)CE原理和技術(shù)的基礎(chǔ)上，結(jié)合微型制造技術(shù)設(shè)計(jì)出來的一種檢測(cè)技術(shù)由微通道或反應(yīng)池等構(gòu)成通道型微陣列芯片，通過加載生物樣品，進(jìn)行一種或連續(xù)多種反應(yīng)，達(dá)到快速高效分析的目的，是一種新型的生物芯片。（七）免疫親和毛細(xì)管電泳（immunoaffinitycapillaryelectrophoresis，ACE）：

ACE是把蛋白質(zhì)（抗原或抗體）事先固定在毛細(xì)管柱內(nèi)，利用抗原-抗體的特異性識(shí)別反應(yīng)，CE的高效、快速分離能力，LIF的高靈敏度來分離檢測(cè)樣品混合物中能與固定化蛋白質(zhì)特異結(jié)合的組分。

毛細(xì)管電泳的分離模式12/3/202314毛細(xì)管區(qū)帶電泳毛細(xì)管區(qū)帶電泳(CZE)也稱為自由溶液毛細(xì)管電泳,是毛細(xì)管電泳中最簡單，應(yīng)用最廣泛的一種形式。分離機(jī)理：不同離子按照各自表面電荷密度的差異即淌度的差異,以不同的速度在電解質(zhì)中移動(dòng),實(shí)現(xiàn)分離。但中性物質(zhì)的淌度差為零,所以不能以這種形式分離。12/3/202315四、毛細(xì)管電泳儀的基本結(jié)構(gòu)電泳儀工作示意圖12/3/202316進(jìn)樣系統(tǒng)靜壓力進(jìn)樣和電動(dòng)進(jìn)樣進(jìn)樣體積一般在納升級(jí)進(jìn)樣長度必須控制在毛細(xì)管總長度的1%~2%，否則將影響分離效率12/3/202317

分離系統(tǒng)毛細(xì)管:由熔融石英制成,內(nèi)徑通常為25~75μm,外徑為350~400μm，有效長度為80~100cm;恒溫系統(tǒng):控制柱溫變化在±0.10C；高壓電源:電流0~300μA電壓0~30KV,電壓穩(wěn)定性在±0.1%;12/3/202318back12/3/202319檢測(cè)系統(tǒng)常用的檢測(cè)方式是紫外-可見光吸收.檢測(cè)器位于距樣品盤約毛細(xì)管總長的2/3~4/5處,對(duì)毛細(xì)管壁內(nèi)部分進(jìn)行光聚焦；此外，熒光，激光誘導(dǎo)熒光，質(zhì)譜等檢測(cè)方法也被應(yīng)用于毛細(xì)管電泳;12/3/202320高效毛細(xì)管電泳儀實(shí)圖12/3/2023211、離子分析analysisofion2、藥物分析analysisofpharmaceutics3、手性化合物分析analysisofchiralcompounds4、氨基酸分析analysisofaminoacids5、核酸分析及DNA測(cè)序analysisofnucleicacidsandsequenceofDNA6、新進(jìn)展及熱點(diǎn)問題advancesandspecialtopics五、高效毛細(xì)管電泳應(yīng)用與進(jìn)展applicationandadvancesofHPCE12/3/2023221、離子分析

analysisofion陽離子分析

遷移方向和電滲流方向一致；4.5min內(nèi)分離了24種金屬離子；陽極進(jìn)樣，陰極檢測(cè)；具有很高的靈敏度；12/3/202323陰離子分析陰離子電泳方向和電滲流方向相反、速度接近，分析時(shí)間長、效率低；質(zhì)量小、電荷密度大的離子如：SO42-、Cl-、F-等，電泳速率大于電滲流，陽極端流出，在陰極端無法檢測(cè)；加入電滲流改性劑，十六烷基三甲基溴化胺等，使電泳方向和電滲流方向一致，可在3.1min內(nèi)分離36種陰離子；陰極進(jìn)樣，陽極檢測(cè)；離子價(jià)態(tài)及存在形態(tài)分析；毛細(xì)管區(qū)帶電泳（CZE）；12/3/2023242、藥物分析

analysisofpharmaceutics檢測(cè)體液或細(xì)胞中某些代謝產(chǎn)物的分析；尿液中的氨基酸含量作為臨床診斷糖尿病的輔助手段；采用毛細(xì)管區(qū)帶電泳方式，在11min內(nèi)分離17種藥物；12/3/202325采用MEKC模式，鑒定違禁藥物；效果優(yōu)于HPLG法毛細(xì)管電動(dòng)力學(xué)色譜(MEKC)12/3/2023263、手性化合物分析

analysisofchiralcompounds合成獲得單一手性化合物相當(dāng)困難；528種手性合成藥物，61中以單一對(duì)映體形式銷售，其他為外消旋體；檢測(cè)分析也相當(dāng)困難；研究熱點(diǎn)；R-反應(yīng)是安眠藥，S-式致胎兒畸形；HPCE分離分析手性化合物的方法：加入手性選擇劑；形成配合物的穩(wěn)定常數(shù)有差異，結(jié)合HPCE的高效率；常用手性選擇劑：環(huán)糊精及其衍生物；手性冠醚；手性表面活性劑（氨基酸衍生物、膽酸鈉、?；敲撗跄懰峒捌溻c鹽、低聚糖等天然手性表面活性劑）12/3/2023274、氨基酸與蛋白質(zhì)分析

analysisofaminoacids采用MEKC模式，在25分鐘內(nèi)分離了23種丹酰化氨基酸；HPCE可取代傳統(tǒng)的氨基酸分析儀；問題：吸附和檢測(cè)；毛細(xì)管電動(dòng)力學(xué)色譜(MEKC)12/3/202328蛋白質(zhì)分析12/3/2023295、核酸分析及DNA排序

analysisofnucleicacidsandsequence

ofDNA重要分析手段；圖，酶解的雙螺旋DNA限制性片段的分離；毛細(xì)管凝膠電泳（CGE）12/3/2023306、新進(jìn)展

advancesandspecialtopics1.微型化整體化學(xué)分析系統(tǒng)（TAS）及TAS微型化在硅片上光刻出矩形槽作為毛細(xì)管，理論塔板數(shù)105/m；2.聯(lián)用儀器CE-MS；3.陣列毛細(xì)管凝膠電泳

應(yīng)用于人類基因DNA測(cè)序；5～10萬個(gè)基因，30億個(gè)