10.體外皮膚變態(tài)反應(yīng) 氨基酸衍生化反應(yīng)試驗(yàn)方法

附件10體外皮膚變態(tài)反應(yīng)氨基酸衍生化反應(yīng)試驗(yàn)方法InChemicoSkinSensitisation:AminoacidDerivativeReactivityAssay（ADRA）1范圍本方法規(guī)定了氨基酸衍生化反應(yīng)試驗(yàn)方法的基本要求和方法。本方法適用于已知單一組分、已知組成成分的多組分化妝品用原料潛在致敏性的評(píng)價(jià)。2試驗(yàn)?zāi)康念A(yù)測(cè)和評(píng)價(jià)化妝品用化學(xué)原料是否具有潛在皮膚致敏性。3定義氨基酸衍生物消耗百分比PercentAminoacidDerivativeDepletion與溶劑對(duì)照相比，受試物消耗氨基酸衍生物的程度。共洗脫Co-elution受試物在281nm處吸收顯著，并與氨基酸衍生物保留時(shí)間相同或色譜峰部分重疊，干擾氨基酸衍生物定量分析。4試驗(yàn)原理有致敏性的受試物與N.（2-（1-蔡基）乙?；?L-半胱氨酸（NAC）和N-（2-（1-蔡基）乙酰基）-L-賴氨酸（NAL）模擬的皮膚蛋白進(jìn)行反應(yīng)，消耗氨基酸衍生物。測(cè)定衍生物的量，計(jì)算氨基酸衍生物消耗百分比，從而判斷受試物是否具有皮膚致敏性。5試驗(yàn)材料與試劑氨基酸衍生物片段與純度N-（2-（1-蔡基）乙?；?L-半胱氨酸（NAC）：分子式Ci5H15NO3S,分子量28235,純度：＞98%。N-（2-（1-蔡基）乙酰基）-L.賴氨酸（NAL）：分子式Ci8H22N2O3，分子量314.38,純度范圍：＞98%。圖1NAC（左）和NAL（右）的結(jié)構(gòu)式陽(yáng)性對(duì)照與受試物的配制陽(yáng)性對(duì)照溶液：取苯乙醛適量（純度＞90%）,加乙月青制成1mmol/L的溶液，臨用新制。受試物溶液：溶劑選用蒸儲(chǔ)水、乙晴和丙酮，單一或混合使用制成1mmol/L的溶液，臨用新制。如出現(xiàn)溶解不完全的情況，可將受試物先溶解在二甲基亞碉（DMSO）中，然后用乙月青稀釋該溶液制備成1mmol/L受試化合物溶液。最終溶液中DMSO用量不得超過5%（V/V）。反應(yīng)固定液：1mL三氟乙酸（TFA）加40mL水于5mL離心管中，得到2.5%TFA水溶液。氨基酸衍生物貯備液的配制N-（2-（1-蔡基）乙?；?L-半胱氨酸（NAC）貯備液：稱取適量NAC,用pH8.0的磷酸鹽緩沖液配制成6.667pmol/L的溶液。儲(chǔ)備液應(yīng)在-80℃下冷凍保存，存放時(shí)間不超過六個(gè)月，每次使用應(yīng)驗(yàn)證其穩(wěn)定性。pH8.0磷酸鹽緩沖液：取0.18g無水磷酸氫二鈉與4.02g無水磷酸二氫鈉溶于300mL蒸儲(chǔ)水當(dāng)中，每300mL緩沖液加入1mL的0.1mmol/LEDTA溶液，混合均勻，測(cè)終溶液pH在7.9-8」之間，配制完成，每次使用前檢查pH。N-（2-（1-2基）乙?；?L-賴氨酸（NAL）儲(chǔ)備液：稱取適量NAL,用pH10.2的磷酸鹽緩沖液配制6.667|imol/L的溶液。儲(chǔ)備液應(yīng)在-80℃下冷凍保存，存放時(shí)間不超過六個(gè)月，每次使用應(yīng)驗(yàn)證其穩(wěn)定性。pHlO.2磷酸鹽緩沖液：取4.26g無水磷酸二氫鈉溶于286mL蒸儲(chǔ)水，加入14mL0.1mol/LNaOH溶液，每300mL緩沖液加入1mL的0.1mmol/LEDTA溶液。攪拌均勻，測(cè)終溶液pH在之間，配制完成，每次使用前檢查pH。氨基酸衍生物標(biāo)準(zhǔn)線性溶液的配制NAC標(biāo)準(zhǔn)線性溶液的稀釋溶劑：取15mLpH8.0磷酸鹽緩沖液于50mL離心管，力mmL水、100匹三氟乙酸、3.9mL乙睛，振蕩混勻，臨用新制。NAL標(biāo)準(zhǔn)線性溶液的稀釋溶劑：取15mLpH10.2磷酸鹽緩沖液于50mL離心管，力口1mL水、100|iL三氟乙酸、3.9mL乙月青，振蕩混勻，臨用新制。先配制5-mol/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液（std7）：300gL6.667-mol/LNAC儲(chǔ)備液加入L5mL離心管中，力口入20pL水、2注三氟乙酸、78注乙月青。標(biāo)準(zhǔn)線性溶液：取std7溶液，逐步稀釋到下表濃度。stdl為稀釋溶劑。NAL線性溶液操作步驟與NAC一致。表1線性點(diǎn)的摩爾濃度序號(hào)StdlStd2Std3Std4Std5Std6Std7濃度:mol/L0.0000.156250.31250.6251.2502.5005.000液相待測(cè)溶液的配制共洗脫對(duì)照：150|1L磷酸鹽緩沖液+50|1L受試物溶液。參比溶液A和B：150|iLNAC+50|iL乙睛，平行樣A三份B六份。NAL的操作步驟一致。參比溶液C：150I1LNAC+50/L溶解受試物的溶劑，平行三份。若用混合溶劑，則需要制備每種溶劑的參比溶液C；如用乙月青和水混合溶液溶解的，則需要配制三份NAC的水溶液,三份NAC的乙睛溶液。NAL的操作步驟一致。陽(yáng)性對(duì)照溶液制備：150pLNAC+50|1L陽(yáng)性對(duì)照（苯乙醛乙月青）溶液，三份平行樣。NAL的操作步驟一致。供試品溶液制備：150pLNAC+50VL測(cè)試化學(xué)品溶液，三份平行樣。NAL操作步驟一致。6試驗(yàn)步驟操作步驟按進(jìn)樣順序排列，項(xiàng)下所有對(duì)照與測(cè)試樣品均避光25±1℃反應(yīng)24±lh,結(jié)束后30min內(nèi)加入反應(yīng)固定液50rL,觀察反應(yīng)前后是否產(chǎn)生沉淀。（如果反應(yīng)前產(chǎn)生沉淀，陽(yáng)性結(jié)果可用，陰性不可用；反應(yīng)后產(chǎn)生沉淀，過濾后再進(jìn)樣。）液相色譜條件流動(dòng)相流動(dòng)相A：0.1%三氟乙酸水溶液（V/V）,1mL三氟乙酸+1000mL水，混勻既得；流動(dòng)相B：0.1%三氟乙酸乙月青溶液（V/V）,1mL三氟乙酸+1000mL乙月青，混勻既得。色譜柱十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱（3.0mmx150mm,2.7pm）或等效色譜柱。623檢測(cè)器及檢測(cè)波長(zhǎng)紫外吸收光譜檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為281nm,流速0.3mL/min。NAC/NAL流動(dòng)相梯度洗脫程序（可依據(jù)實(shí)際情況調(diào)整）：NACNAL時(shí)間（min）流動(dòng)相A（%）流動(dòng)相B（%）時(shí)間（min）流動(dòng)相A（%）流動(dòng)相B（%）07030080209.545559.5554510010010010013010013010013.5703013.580202070302080207數(shù)據(jù)處理氨基酸衍生物消耗百分比計(jì)算公式:氨基酸衍生物消耗百分比=x100樣品氨基酸衍生物峰面積均值）溶劑對(duì)照氨基酸衍生物峰面積均值氨基酸衍生物消耗百分比=x100注：當(dāng)氨基酸衍生物消耗值計(jì)算為負(fù)時(shí)，視為“0”值。8試驗(yàn)成立條件符合以下條件，試驗(yàn)條件有效：標(biāo)準(zhǔn)曲線：r2>0.990。陽(yáng)性對(duì)照平均氨基酸衍生物消耗百分比：NAC：6%?30%,SD(百分?jǐn)?shù)表示，下同)<10%oNAL:75%?100%,SD<10%o受試物氨基酸衍生物消耗值SD：NAC小于10%,NAL小于10%。參比溶液A的NAC/NAL平均濃度：3.211moi/L?4.4jimol/Lo參比溶液C的NAC/NAL平均濃度：3.2pmol/L?4.4pmol/L。參比溶液B、C峰面積RSD%V10%(n=9),每種溶劑對(duì)照C峰面積RSD%<10%(n=3)。NAC或NAL穩(wěn)定性：ST(Oh)與ST(24h)濃度相差W10%。ST(Oh),NAC或NAL的初始濃度；ST(24h),反應(yīng)24±1h后NAC或NAL的濃度。9結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)9.1當(dāng)受試物與NAC和NAL都不發(fā)生共洗脫時(shí)，采用l:50NAC和l:50NAL模型(表2)判定。表21:50NAC和1:50NAL判定模型NAC和NAL消耗百分比的均值 預(yù)測(cè)結(jié)果0%3消耗百分比的均<<4.9% 陰性4.9%S消耗百分比的均值W00% 陽(yáng)性9.2當(dāng)受試物僅與NAL發(fā)生共洗脫時(shí)，采用L50NAC模型(表3)判定。表3l:50NAC判定模型NAC消耗百分比的均值 預(yù)測(cè)結(jié)果0%3消耗百分比的均值<5.6% 陰性5.6%至消耗百分比的均值S100% 陽(yáng)性9.3當(dāng)受試物同時(shí)與NAC、NAL發(fā)生共洗脫或者與NAC單獨(dú)共洗脫時(shí)，判定結(jié)論為“無定論”。10注意事項(xiàng).采用L50NAC和l:50NAL模型時(shí)，NAC和NAL消耗百分比的均值在3%-10%之間；采用1:50NAC模型時(shí)，消耗百分比在4%?11%之間，須進(jìn)行重復(fù)測(cè)試；若前兩次結(jié)果不一致，須再次測(cè)試。在對(duì)已知組分的多組分化妝品用化學(xué)原料進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，可根據(jù)各組成成分(除水以外)的平均分子量進(jìn)行1mmol/L樣品的配制。若受試物在建議溶劑中的溶解度達(dá)不到1mmol/L,理論上仍可以進(jìn)行試驗(yàn)。在這種情況下得出的陽(yáng)性結(jié)果仍有參考意義，但得出的陰性結(jié)果不能說明受試物一定沒有致敏性。若一種受試物能在不同溶劑溶解度當(dāng)中達(dá)到1mmol/L,不同溶劑的溶解形成的溶液實(shí)驗(yàn)數(shù)值可能不同。實(shí)際選擇溶劑時(shí)應(yīng)考慮溶液的穩(wěn)定性。液相進(jìn)樣序列建議參照表4執(zhí)行。建議選用帶有溫度控制的樣品盤，溫度設(shè)置在4℃,并且序列運(yùn)行時(shí)間盡量控制在30h之內(nèi)。表4液相進(jìn)樣序列標(biāo)準(zhǔn)溶液和空白對(duì)照稀釋溶劑(Stdl)Std2~Std7對(duì)照A平行樣品1對(duì)照A平行樣品2對(duì)照A平行樣品3共洗脫對(duì)照受試物1共洗脫對(duì)照受