新高考生物一輪復(fù)習(xí)講練課件：第37講　基因工程的基本工具與操作程序（含解析）

第37講基因工程的基本工具與操作程序高考生物一輪復(fù)習(xí)素養(yǎng)目標(biāo)一、重組DNA技術(shù)的基本工具1.基因工程的概念理解分子遺傳性狀

2.基因工程的基本工具(1)限制性內(nèi)切核酸酶(限制酶)核苷酸序列

磷酸二酯鍵

一種特定的脫氧核苷酸序列

黏性末端

具有專一性①限制酶的識(shí)別序列與被作用的DNA序列是不同的。前者一般由6個(gè)核苷酸組成,少數(shù)由4個(gè)、8個(gè)或其他數(shù)量的核苷酸組成;后者是雙鏈序列。②判斷黏性末端是否由同一種限制酶切割形成的方法是將黏性末端旋轉(zhuǎn)180°,同一種限制酶切割形成的黏性末端應(yīng)該是完全相同的結(jié)構(gòu)。

不是氫鍵③限制酶作用的化學(xué)鍵只能是磷酸二酯鍵。④在切割含目的基因的DNA分子時(shí),需用限制酶切割兩次此DNA分子。(2)DNA連接酶

(3)基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體

不僅僅是質(zhì)粒質(zhì)粒

穩(wěn)定保存

限制酶切割位點(diǎn)

3.DNA的粗提取與鑒定(1)實(shí)驗(yàn)原理酒精

NaCl溶液

2mol/L藍(lán)色

(2)實(shí)驗(yàn)步驟

研磨

上清液

95%一個(gè)方向

2mol/L二苯胺

5min藍(lán)色旁欄邊角1.(選擇性必修3,第72頁(yè),“旁欄思考”)DNA連接酶和DNA聚合酶是一回事嗎?為什么?2.(選擇性必修3,第74頁(yè),“拓展應(yīng)用1”)為什么限制酶不切割細(xì)菌本身的DNA分子?提示

不是。DNA連接酶連接的是兩個(gè)DNA片段,而DNA聚合酶是把單個(gè)的脫氧核苷酸連接到已有的DNA片段上。提示

細(xì)菌中的限制酶之所以不剪切自身DNA,是因?yàn)榧?xì)菌在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中形成了一套完善的防御機(jī)制,其DNA分子中或者不具備這種限制酶的識(shí)別序列,或者通過(guò)甲基化酶將甲基轉(zhuǎn)移到限制酶所識(shí)別序列的堿基上,使限制酶不能將其切開(kāi)。易錯(cuò)辨析基于對(duì)重組DNA技術(shù)的基本工具的理解,判斷下列表述是否正確。(1)切割質(zhì)粒的限制性內(nèi)切核酸酶均能特異性地識(shí)別6個(gè)核苷酸序列。(

)(2)載體質(zhì)粒通常采用抗生素合成基因作為篩選標(biāo)記基因。(

)(3)DNA連接酶能將兩堿基間通過(guò)氫鍵連接起來(lái)。(

)(4)E.coliDNA連接酶既可連接平末端,又可連接黏性末端。(

)(5)當(dāng)作載體的質(zhì)粒DNA分子上應(yīng)至少含一個(gè)限制酶切割位點(diǎn)。(

)(6)載體的作用是攜帶目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞中,使之穩(wěn)定存在并表達(dá)。(

)××××√√二、基因工程的基本操作程序1.目的基因的篩選與獲取(1)篩選合適的目的基因①目的基因:在基因工程的設(shè)計(jì)和操作中,用于改變

或獲得

等的基因。主要是指

的基因。②篩選目的基因的方法:從相關(guān)的已知

清晰的基因中進(jìn)行篩選是較為有效的方法之一。

(2)利用PCR獲取和擴(kuò)增

①原理:

。

受體細(xì)胞性狀

預(yù)期表達(dá)產(chǎn)物

編碼蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能

目的基因

DNA半保留復(fù)制

②條件:參與的組分在DNA復(fù)制中的作用解旋酶(體外用高溫代替)打開(kāi)DNA雙鏈DNA母鏈提供DNA復(fù)制的模板4種脫氧核苷酸合成DNA子鏈的原料耐高溫的DNA聚合酶催化合成DNA子鏈引物

2種使DNA聚合酶能夠從

緩沖液

引物的3'端開(kāi)始連接脫氧核苷酸

維持反應(yīng)體系pH穩(wěn)定

③過(guò)程:PCR過(guò)程包括

、復(fù)性和

三步

變性

延伸

(3)結(jié)果:DNA分子以

擴(kuò)增(約為2n,其中n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù))。(4)說(shuō)明①在PCR過(guò)程中實(shí)際加入的為dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP),既可作為合成DNA子鏈的

,又可為DNA的合成提供能量。

②引物既可以是DNA單鏈,也可以為RNA單鏈。細(xì)胞內(nèi)的DNA進(jìn)行復(fù)制時(shí),也需要引物,一般為RNA片段。③真核細(xì)胞和細(xì)菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活。因此,PCR反應(yīng)緩沖溶液中一般都要添加Mg2+。指數(shù)形式

原料

(5)PCR技術(shù)和DNA復(fù)制的比較

2.基因表達(dá)載體的構(gòu)建

基因工程的核心內(nèi)容(1)構(gòu)建基因表達(dá)載體的目的①使目的基因在受體細(xì)胞中

,并且可以

給下一代。

②使目的基因能夠

和發(fā)揮作用。

穩(wěn)定存在

遺傳

表達(dá)

(2)基因表達(dá)載體的組成

(3)基因表達(dá)載體的構(gòu)建過(guò)程

3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞

子房

胚囊

農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法

受精卵

顯微注射技術(shù)

生物類型受體細(xì)胞常用方法轉(zhuǎn)化過(guò)程微生物原核細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞法

能夠吸收外界DNACa2+處理細(xì)胞↓感受態(tài)細(xì)胞↓基因表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合↓感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子提醒導(dǎo)入目的基因,可能存在于細(xì)胞質(zhì)中,也可能整合到染色體DNA上。存在于染色體DNA上的目的基因有可能通過(guò)花粉傳播進(jìn)入雜草或其他作物中,造成“基因污染”。4.目的基因的檢測(cè)與鑒定

目的基因

雜交帶

旁欄邊角1.(選擇性必修3,第79頁(yè),“思考”改編)PCR可以擴(kuò)增mRNA嗎?利用PCR擴(kuò)增目的基因時(shí),為什么要用2種不同的引物?提示

不可以,因?yàn)镻CR是用DNA雙鏈作模板的,不能直接用單鏈RNA作PCR,必須把mRNA逆轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA之后再作PCR。DNA是兩條反向平行的雙鏈,而復(fù)制時(shí)只能從固定的方向(模板鏈的3'端)開(kāi)始,所以引物的堿基序列是不同的。2.(選擇性必修3,第80頁(yè),“正文”改編)為什么切割含有目的基因的DNA片段和載體要選用同一種限制酶?是否只能用同一種限制酶?提示

選用同一種限制酶切割會(huì)產(chǎn)生相同的黏性末端,可以在DNA連接酶的作用下將切割的目的基因和載體連接起來(lái)。也可以使用能產(chǎn)生相同末端的限制酶切割。易錯(cuò)辨析基于對(duì)基因工程的基本操作程序的理解,判斷下列表述是否正確。(1)用PCR方法擴(kuò)增目的基因時(shí)必須知道基因的全部序列。(

)(2)外源DNA必須位于重組質(zhì)粒的啟動(dòng)子和終止子之間才能進(jìn)行復(fù)制。(

)(3)將目的基因?qū)腚p子葉植物一般采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法。(

)(4)抗蟲基因即使成功地插入植物細(xì)胞染色體上也未必能正常表達(dá)。(

)(5)應(yīng)用DNA探針技術(shù),可以檢測(cè)轉(zhuǎn)基因抗凍番茄植株中目的基因的存在及其是否完全表達(dá)。(

)××√√×長(zhǎng)句應(yīng)答1.為什么不直接把目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞,而要用載體?提示

游離的DNA片段進(jìn)入受體細(xì)胞,一般會(huì)被直接分解,就算可以進(jìn)行轉(zhuǎn)錄并翻譯成蛋白質(zhì),游離的DNA片段也無(wú)法隨著細(xì)胞分裂而進(jìn)行復(fù)制,導(dǎo)致子代細(xì)胞中不再含有目的基因。若將目的基因插入載體,由于載體可以在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制,隨著細(xì)胞分裂,載體會(huì)帶著目的基因存在于每個(gè)子代細(xì)胞中。這樣,基因工程才有意義。2.新型冠狀病毒核酸檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)原理是什么?提示

新型冠狀病毒核酸檢測(cè)試劑盒是用于快速進(jìn)行體外定性檢測(cè)新型冠狀病毒的醫(yī)療檢測(cè)用品,它的工作原理是通過(guò)提取病人樣本中的RNA,進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR),通過(guò)擴(kuò)增反應(yīng)將樣本中微量的病毒信息進(jìn)行放大,最后以熒光的方式讀取信號(hào)。如果PCR之后信號(hào)為陽(yáng)性,那么就可以認(rèn)為樣本中存在病毒(已經(jīng)感染),反之表明樣本中沒(méi)有病毒(未感染)。考點(diǎn)一重組DNA技術(shù)的基本工具新教材新高考(1)教材新增:DNA的粗提取與鑒定(2)教材改動(dòng):DNA重組技術(shù)改為重組DNA技術(shù);從基因文庫(kù)中獲取目的基因精減為一句話(3)教材刪除:基因文庫(kù)的構(gòu)建(1)依據(jù)重組DNA技術(shù)的基本工具,考查基因工程的3種基本工具:限制酶、DNA聚合酶和載體,突出對(duì)生命觀念的考查(2)依據(jù)基因工程的要求,結(jié)合限制酶的特點(diǎn)和質(zhì)粒的結(jié)構(gòu),選擇合適的限制酶,突出對(duì)科學(xué)探究的考查考向探究考向1結(jié)合基因工程所需工具酶,考查科學(xué)實(shí)踐中的探究能力1.(2022遼寧撫順一模)某質(zhì)粒分子其中一條鏈的部分核苷酸序列為—CGAGCCGAATTCTGCGCCTATAGGCCTCGA—,限制酶EcoRⅠ在單鏈上的識(shí)別序列為—GAATTC—。下列敘述正確的是(

)A.一種限制酶只能識(shí)別一種特定的核苷酸序列,并在特定位點(diǎn)斷開(kāi)DNAB.用EcoRⅠ酶切割該質(zhì)粒,至少會(huì)產(chǎn)生2個(gè)片段C.與其互補(bǔ)片段相比,該單鏈片段中A與T的和所占比例較大D.一個(gè)該質(zhì)粒復(fù)制n次,得到的雙鏈都是新合成的質(zhì)粒有(2n-1)個(gè)答案

A

解析

限制酶能夠識(shí)別雙鏈DNA分子的某種特定的核苷酸序列,并且使每一條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷裂,A項(xiàng)正確;質(zhì)粒是環(huán)狀的,該質(zhì)粒只有一個(gè)EcoRⅠ酶切割位點(diǎn),用EcoRⅠ酶切割該質(zhì)粒,會(huì)產(chǎn)生1個(gè)片段,B項(xiàng)錯(cuò)誤;與其互補(bǔ)片段相比,該單鏈片段中的A和T與互補(bǔ)鏈中的A和T堿基配對(duì),是互補(bǔ)的,它們所占比例一樣,C項(xiàng)錯(cuò)誤;一個(gè)該質(zhì)粒復(fù)制n次,含母鏈的質(zhì)粒有2個(gè),其余都是新合成的質(zhì)粒,得到的雙鏈都是新合成的質(zhì)粒有(2n-2)個(gè),D項(xiàng)錯(cuò)誤?？枷?結(jié)合載體的作用及特點(diǎn),考查科學(xué)思維的能力2.(2022山東蘭山模擬)下圖甲、乙中標(biāo)注了相關(guān)限制酶的酶切位點(diǎn),下列關(guān)于培育轉(zhuǎn)基因大腸桿菌的敘述,錯(cuò)誤的是(

)A.若通過(guò)PCR技術(shù)提取該目的基因應(yīng)該選用引物甲和引物丙B.構(gòu)建基因表達(dá)載體,可選用BamHⅠ剪切C.構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)為了防止目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化,可以選用BclⅠ和HindⅢ剪切D.在導(dǎo)入目的基因的受體細(xì)胞中,四環(huán)素抗性基因和氨芐青霉素抗性基因不能同時(shí)表達(dá)答案

B

解析

PCR技術(shù)要求兩種引物分別和目的基因的兩條單鏈結(jié)合,沿相反的方向合成子鏈,故所用的引物組成為圖2中引物甲和引物丙,A項(xiàng)正確;構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí),應(yīng)至少保留一個(gè)完整的標(biāo)記基因,便于目的基因的檢測(cè)和篩選,圖1中BamHⅠ同時(shí)切割兩種標(biāo)記基因,不能選用BamHⅠ剪切,B項(xiàng)錯(cuò)誤;圖2中目的基因左側(cè)只能用BclⅠ切割,而質(zhì)粒上沒(méi)有目的基因右側(cè)Sau3A的切點(diǎn),兩者都有HindⅢ的切點(diǎn),為了防止目的基因與質(zhì)粒自身環(huán)化,應(yīng)選用BclⅠ和HindⅢ剪切質(zhì)粒和目的基因,C項(xiàng)正確;在構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí),使用BclⅠ和HindⅢ

2種限制酶切割質(zhì)粒,氨芐青霉素抗性基因被破壞,不能表達(dá),四環(huán)素抗性基因能表達(dá),D項(xiàng)正確。3.(2022江西模擬)下圖1所示為用PvuⅠ限制酶切下的某目的基因及其上DNA片段示意圖;圖2所示為三種質(zhì)粒示意圖。圖中AP為氨芐青霉素抗性基因,Tc為四環(huán)素抗性基因。EcoRⅠ、PvuⅠ等為限制酶及其切割的位點(diǎn)。復(fù)制原點(diǎn)是在基因組上復(fù)制起始的一段序列,是指質(zhì)粒在受體細(xì)胞中復(fù)制時(shí)的起點(diǎn)。(1)組成片段D的基本骨架與細(xì)胞膜的基本骨架共同含有的元素是

。

(2)圖2中質(zhì)粒A、質(zhì)粒C能否作為目的基因最理想的運(yùn)載體?

(填“能”或“否”),請(qǐng)說(shuō)明理由。

。

(3)重組質(zhì)粒成功導(dǎo)入受體細(xì)胞的概率一般為10-7,用質(zhì)粒B構(gòu)建重組質(zhì)粒,為了篩選出導(dǎo)入了重組質(zhì)粒的大腸桿菌,在導(dǎo)入完成后,將所有大腸桿菌分別在含有四環(huán)素和氨芐青霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng),大腸桿菌在兩種培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)狀況不可能的是

,可能性最大的是

。

(4)若想在山羊的乳汁中收獲上述目的基因的表達(dá)產(chǎn)物,則需要將重組質(zhì)粒導(dǎo)入山羊的

(細(xì)胞)中。

答案

(1)C、H、O、P(2)否質(zhì)粒A缺少標(biāo)記基因;質(zhì)粒C在用和目的基因相同的限制酶切割時(shí),復(fù)制原點(diǎn)會(huì)被限制酶切割,會(huì)影響重組質(zhì)粒的自主復(fù)制(3)在含四環(huán)素的培養(yǎng)基上能正常生長(zhǎng),在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上不能正常生長(zhǎng)在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基和含四環(huán)素的培養(yǎng)基上都不能正常生長(zhǎng)(4)受精卵解析

(1)脫氧核糖和磷酸交替連接構(gòu)成DNA片段D的基本骨架,脫氧核糖由C、H、O

3種元素組成,組成磷酸的元素是H、P、O;磷脂雙分子層構(gòu)成細(xì)胞膜的基本骨架,磷脂分子是由C、H、O、N、P組成;可見(jiàn),組成片段D的基本骨架與細(xì)胞膜的基本骨架共同含有的元素是C、H、O、P。(2)分析圖2可知,質(zhì)粒A缺少標(biāo)記基因,質(zhì)粒C在用和目的基因相同的限制酶切割時(shí),復(fù)制原點(diǎn)會(huì)被限制酶切割,進(jìn)而影響重組質(zhì)粒的自主復(fù)制,所以質(zhì)粒A、質(zhì)粒C均不能作為目的基因最理想的運(yùn)載體。(3)用質(zhì)粒B構(gòu)建重組質(zhì)粒,當(dāng)用和目的基因相同的限制酶(PvuⅠ)切割時(shí),Tc(四環(huán)素抗性基因)遭到破壞,而AP(氨芐青霉素抗性基因)結(jié)構(gòu)完好,因此在重組質(zhì)粒導(dǎo)入完成后,將所有大腸桿菌分別在含有四環(huán)素和氨芐青霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng),大腸桿菌在兩種培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)狀況不可能的是在含四環(huán)素的培養(yǎng)基上能正常生長(zhǎng),在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上不能正常生長(zhǎng)。因重組質(zhì)粒成功導(dǎo)入受體細(xì)胞的概率一般為10-7,所以可能性最大的是在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基和含四環(huán)素的培養(yǎng)基上都不能正常生長(zhǎng)。(4)若想在山羊的乳汁中收獲上述目的基因的表達(dá)產(chǎn)物,則需要將重組質(zhì)粒導(dǎo)入山羊的受精卵中?？枷?DNA的提取和鑒定4.(2022貴州遵義模擬)下圖是“DNA的粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)中的兩個(gè)操作步驟示意圖,相關(guān)敘述正確的是(

)A.圖1中溶液a是物質(zhì)的量濃度為0.14mol/L的NaCl溶液B.圖2所示實(shí)驗(yàn)操作中有一處明顯錯(cuò)誤,可能導(dǎo)致試管2中藍(lán)色變化不明顯C.圖1所示操作的原理是DNA能溶于酒精,而蛋白質(zhì)等雜質(zhì)不溶D.圖2中的試管1的作用是證明物質(zhì)的量濃度為2mol/L的NaCl溶液遇二苯胺出現(xiàn)藍(lán)色答案

B

解析

圖1中的溶液a是研磨液的上清液,A項(xiàng)錯(cuò)誤;圖2所示實(shí)驗(yàn)的試管中溶液的液面高于燒杯中的液面,可能導(dǎo)致加熱不充分,試管2中藍(lán)色變化不明顯,B項(xiàng)正確;圖1所示操作的原理是DNA不能溶于酒精,而蛋白質(zhì)等雜質(zhì)能溶于酒精,C項(xiàng)錯(cuò)誤;圖2中的試管1起對(duì)照作用,目的是證明在沸水浴條件下,物質(zhì)的量濃度為2

mol/L的NaCl溶液遇二苯胺不會(huì)出現(xiàn)藍(lán)色,而DNA遇二苯胺出現(xiàn)藍(lán)色,D項(xiàng)錯(cuò)誤。方法突破1.與DNA有關(guān)的幾種酶的比較2.圖解限制酶的選擇原則

3.DNA的粗提取與鑒定實(shí)驗(yàn)中的注意事項(xiàng)

考點(diǎn)二基因工程的基本操作程序新教材新高考(1)教材新增:DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定(2)教材改動(dòng):PCR技術(shù)內(nèi)容更充實(shí);農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法變?yōu)橘Y料卡(3)教材刪除:基因槍法(1)結(jié)合目的基因的選擇與獲取方法,結(jié)合將目的基因?qū)氩煌荏w細(xì)胞的方法,突出對(duì)生命觀念的考查(2)依據(jù)PCR技術(shù),掌握擴(kuò)增目的基因的方法,突出對(duì)科學(xué)思維的考查(3)依據(jù)基因表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)和建構(gòu)方法,突出對(duì)科學(xué)思維和科學(xué)探究的考查(4)依據(jù)目的基因的檢測(cè)與鑒定的不同方法,突出對(duì)科學(xué)探究的考查考向探究考向1結(jié)合目的基因的篩選與獲取,考查科學(xué)思維能力1.(2022福建上杭一中一模)Kisspeptin(Kp)是脊椎動(dòng)物的一種肽類激素,對(duì)下丘腦分泌促性腺激素釋放激素(GnRH)的神經(jīng)元有活化作用。研究者為探究Kp、GnRH以及GnRH受體的相關(guān)基因在下丘腦和垂體中的表達(dá)情況,提取下丘腦和垂體中的RNA,采用RT-PCR擴(kuò)增DNA(RT是反轉(zhuǎn)錄)進(jìn)行檢測(cè)。下列敘述錯(cuò)誤的是(

)A.RT-PCR過(guò)程需要的酶有反轉(zhuǎn)錄酶、耐高溫的DNA聚合酶B.PCR擴(kuò)增時(shí)能以相關(guān)基因的mRNA的核苷酸序列為依據(jù)設(shè)計(jì)引物C.檢測(cè)RT-PCR的產(chǎn)物可采用DNA分子雜交和熒光分子雜交技術(shù)D.可檢測(cè)到Kp、GnRH、GnRH受體相關(guān)基因均在下丘腦中表達(dá)量最高答案

D

解析

RT-PCR是指以RNA為模板通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,并對(duì)cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增的過(guò)程,所以RT-PCR過(guò)程需要的酶有反轉(zhuǎn)錄酶、耐高溫的DNA聚合酶,A項(xiàng)正確;PCR擴(kuò)增時(shí),引物要與目的基因結(jié)合,根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則,引物也能與目的基因的mRNA結(jié)合,所以能以相關(guān)基因的mRNA的核苷酸序列為依據(jù)設(shè)計(jì)引物,B項(xiàng)正確;RT-PCR的產(chǎn)物是DNA,檢測(cè)RT-PCR的產(chǎn)物可根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則,采用DNA分子雜交和熒光分子雜交技術(shù),C項(xiàng)正確;根據(jù)題意,Kp和GnRH的受體基因在下丘腦中表達(dá)量會(huì)比較高,但GnRH受體基因應(yīng)該是在性腺中的表達(dá)較高,因?yàn)樾韵偌?xì)胞才是GnRH的靶細(xì)胞,D項(xiàng)錯(cuò)誤?？枷?結(jié)合基因表達(dá)載體的構(gòu)建,考查科學(xué)實(shí)踐能力2.(2022天津南開(kāi)中學(xué)聯(lián)考)右圖為基因表達(dá)載體的模式圖,下列有關(guān)基因工程中載體的說(shuō)法,錯(cuò)誤的是(

)A.基因工程的核心步驟是基因表達(dá)載體的構(gòu)建B.基因表達(dá)載體的構(gòu)建并不一定相同C.圖中啟動(dòng)子位于目的基因的首端,是核糖體識(shí)別和結(jié)合的部位D.抗生素抗性基因的作用是作為標(biāo)記基因,用于鑒別受體細(xì)胞中是否導(dǎo)入了目的基因答案

C

解析

由于受體細(xì)胞有植物、動(dòng)物、微生物之分,以及目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法不同,因此基因表達(dá)載體的構(gòu)建也會(huì)有所差別,不可能是千篇一律的;啟動(dòng)子是一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段,位于目的基因的上游,它是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位,有了它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA。考向3結(jié)合將目的基因?qū)氩煌荏w細(xì)胞的操作,考查科學(xué)實(shí)踐能力3.(2022適應(yīng)性考試遼寧卷)菊花是一種雙子葉植物,易感桃蚜。桃蚜不但直接影響植物生長(zhǎng),還是多種植物病毒的傳播媒介。雪花蓮凝集素基因GNA的表達(dá)產(chǎn)物能有效抑制桃蚜生長(zhǎng)。某科研團(tuán)隊(duì)運(yùn)用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法獲得了轉(zhuǎn)GNA基因菊花。下列有關(guān)敘述錯(cuò)誤的是(

)A.受體細(xì)胞可以選擇菊花葉片細(xì)胞或桃蚜細(xì)胞B.將目的基因GNA插入Ti質(zhì)粒的T-DNA上構(gòu)建表達(dá)載體C.菊花外植體產(chǎn)生的酚類化合物能吸引農(nóng)桿菌移向受體細(xì)胞D.應(yīng)用抗蟲接種實(shí)驗(yàn),檢測(cè)轉(zhuǎn)基因菊花對(duì)桃蚜的抗性及抗性的程度答案

A

解析

據(jù)題意可知,要想獲得轉(zhuǎn)GNA基因菊花,應(yīng)選擇菊花的體細(xì)胞作為受體細(xì)胞,A項(xiàng)錯(cuò)誤;基因工程中構(gòu)建表達(dá)載體時(shí),由于T-DNA可以轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞內(nèi),可以將目的基因GNA插入Ti質(zhì)粒的T-DNA上,B項(xiàng)正確;菊花外植體產(chǎn)生的酚類化合物能吸引農(nóng)桿菌移向受體細(xì)胞,有利于目的基因成功導(dǎo)入,C項(xiàng)正確;已知雪花蓮凝集素基因GNA的表達(dá)產(chǎn)物能有效抑制桃蚜生長(zhǎng),故應(yīng)用抗蟲接種實(shí)驗(yàn),檢測(cè)轉(zhuǎn)基因菊花對(duì)桃蚜的抗性及抗性的程度,D項(xiàng)正確。考向4結(jié)合目的基因的檢測(cè)與鑒定,考查生命觀念4.(2022山西太原模擬)核酸疫苗是將編碼某種抗原蛋白的外源基因(DNA或RNA片段)導(dǎo)入動(dòng)物體細(xì)胞內(nèi),通過(guò)宿主細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)合成抗原蛋白,誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生對(duì)該抗原蛋白的免疫應(yīng)答,以達(dá)到預(yù)防或治療相應(yīng)疾病的一類新型疫苗。研究表明核酸疫苗不僅具有良好的免疫原性與安全性,且由于核酸更易于修飾與改造,較以往蛋白疫苗具有更大的靈活性和更廣闊的應(yīng)用前景。請(qǐng)回答下列問(wèn)題。(1)研發(fā)DNA疫苗時(shí),構(gòu)建含有病原體抗原基因表達(dá)載體的過(guò)程中需要用到的工具酶有

。

(2)圖中所用的載體是

,構(gòu)建基因表達(dá)載體的目的是

,基因表達(dá)載體中,驅(qū)動(dòng)病原體抗原基因轉(zhuǎn)錄的結(jié)構(gòu)為

。

(3)mRNA疫苗可以由計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)、制造并通過(guò)高速機(jī)器大批量生產(chǎn)。目前用于制造疫苗的RNA有兩種,非復(fù)制型mRNA和自我擴(kuò)增型mRNA,從圖中可以看出,自我擴(kuò)增型mRNA的優(yōu)點(diǎn)是可在細(xì)胞內(nèi)

。mRNA常被包裹在脂質(zhì)體顆粒中注射到相關(guān)人員的手臂肌肉中,脂質(zhì)體顆粒的作用是

。

(4)病毒核酸檢測(cè)試劑盒通常以病毒獨(dú)特的基因序列為檢測(cè)靶標(biāo)。PCR擴(kuò)增時(shí)每一個(gè)循環(huán)分為

3步,使靶標(biāo)DNA序列呈指數(shù)增加。每一個(gè)擴(kuò)增出來(lái)的DNA序列都與預(yù)先加入的一段熒光標(biāo)記

結(jié)合,產(chǎn)生熒光信號(hào),擴(kuò)增出來(lái)的靶標(biāo)DNA序列越多,累積的熒光信號(hào)就越強(qiáng)。在沒(méi)有病毒的樣本中,因?yàn)闆](méi)有靶標(biāo)DNA序列擴(kuò)增,所以就檢測(cè)不到熒光信號(hào)。

答案

(1)限制性內(nèi)切核酸酶(限制酶)、DNA連接酶(2)質(zhì)粒使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在并遺傳給下一代,同時(shí)使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用啟動(dòng)子(3)大量復(fù)制,提高蛋白質(zhì)合成效率保護(hù)mRNA,防止其被酶降解(4)變性、復(fù)性、延伸探針解析

(1)構(gòu)建基因表達(dá)載體的過(guò)程中需要用到的工具酶有限制性內(nèi)切核酸酶(限制酶)、DNA連接酶。(2)圖中所用的質(zhì)?？梢猿洚?dāng)運(yùn)載體,構(gòu)建基因表達(dá)載體可以使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在并遺傳給下一代,同時(shí)使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用?；虮磉_(dá)載體中的啟動(dòng)子可以驅(qū)動(dòng)目的基因的轉(zhuǎn)錄。(3)從圖中可以看出,自我擴(kuò)增型mRNA可在細(xì)胞內(nèi)大量復(fù)制,提高蛋白質(zhì)合成效率。mRNA常被包裹在脂質(zhì)體顆粒中注射到相關(guān)人員的手臂肌肉中,其中的脂質(zhì)體顆?？梢员Ｗo(hù)mRNA,防止其被酶降解。(4)PCR擴(kuò)增時(shí)每一個(gè)循環(huán)分為變性、復(fù)性、延伸3步,使靶標(biāo)DNA序列呈指數(shù)增加。每一個(gè)擴(kuò)增出來(lái)的DNA序列都與預(yù)先加入的一段熒光標(biāo)記探針結(jié)合,產(chǎn)生熒光信號(hào),擴(kuò)增出來(lái)的靶標(biāo)DNA序列越多,累積的熒光信號(hào)就越強(qiáng)。方法突破1.目的基因的獲取方法(1)利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因。(2)人工合成目的基因①反轉(zhuǎn)錄法:主要用于相對(duì)分子質(zhì)量較大而又不知其核苷酸序列的基因。它以目的基因的mRNA為模板,借助逆轉(zhuǎn)錄酶合成雙鏈DNA,其過(guò)程如下:目的基因的mRNA雙鏈DNA(目的基因)②化學(xué)合成法:依據(jù)某一蛋白質(zhì)的氨基酸序列,推測(cè)出其基因序列,然后直接合成目的基因,其過(guò)程如下:(3)從基因文庫(kù)中獲取目的基因根據(jù)目的基因的有關(guān)信息,例如,根據(jù)基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色體上的位置、基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物——mRNA,以及基因的表達(dá)產(chǎn)物——蛋白質(zhì)等特性來(lái)獲取目的基因。2.啟動(dòng)子≠起始密碼子,終止子≠終止密碼子(1)啟動(dòng)子是位于基因首端的一段特殊序列,它是RNA聚合酶識(shí)別、結(jié)合的部位。終止子是位于基因尾端的一段特殊序列,作用是使轉(zhuǎn)錄過(guò)程停止。(2)起始密碼子和終止密碼子均位于mRNA上,分別控制翻譯過(guò)程的啟動(dòng)和終止。3.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中的兩次拼接和兩次導(dǎo)入PCR技術(shù)知識(shí)儲(chǔ)備1.PCR技術(shù)的過(guò)程2.DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定(1)原理①PCR原理:DNA熱變性原理。②電泳

(2)方法步驟①PCR擴(kuò)增

使掛在管壁上的液體全部甩下準(zhǔn)備?移液?混合?離心?反應(yīng)②鑒定PCR產(chǎn)物→瓊脂糖凝膠電泳法→配制瓊脂糖溶液→制備瓊脂糖凝膠→電泳緩沖液加入電泳槽中→加樣→電泳→取出凝膠置于紫外燈下觀察和照相。(3)使用提示①為避免外源DNA等因素的污染,PCR實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌處理。②該實(shí)驗(yàn)所需材料可以直接從公司購(gòu)買,緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份,并在-20℃儲(chǔ)存。使用前,將所需試劑從冰箱拿出,放在冰塊上緩慢融化。③在向微量離心管中添加反應(yīng)組分時(shí),每吸取一種試劑后,移液器上的槍頭都必須更換,避免試劑的污染。④在進(jìn)行操作時(shí),一定要戴好一次性手套。⑤觀察DNA帶的分布及粗細(xì)程度來(lái)評(píng)價(jià)擴(kuò)增的效果。專項(xiàng)突破典例.(2020江蘇)如果已知一小段DNA的序列,可采用PCR的方法,簡(jiǎn)捷地分析出已知序列兩側(cè)的序列,具體流程如下圖(以EcoRⅠ酶切為例)。請(qǐng)據(jù)圖回答問(wèn)題。(1)步驟Ⅰ用的EcoRⅠ是一種

酶,它通過(guò)識(shí)別特定的

切割特定位點(diǎn)。

(2)步驟Ⅱ用的DNA連接酶催化相鄰核苷酸之間的3'-羥基與5'-磷酸間形成

;PCR循環(huán)中,升溫到90℃是為了獲得

;TaqDNA聚合酶的作用是催化

。

(3)若下表所列為已知的DNA序列和設(shè)計(jì)的一些PCR引物,步驟Ⅲ選用的PCR引物必須是

(從引物①②③④中選擇,填編號(hào))。

(4)對(duì)PCR產(chǎn)物測(cè)序,經(jīng)分析得到了片段F的完整序列。下列DNA單鏈序列中(虛線處省略了部分核苷酸序列),結(jié)果正確的是

。

A.5'-AACTATGCG----AGCCCTT-3'B.5'-AATTCCATG----CTGAATT-3'C.5'-GCAATGCGT----TCGGGAA-3'D.5'-TTGATACGC----CGAGTAC-3'答案

(1)限制性內(nèi)切核酸(或限制)核苷酸序列(2)磷酸二酯鍵DNA單鏈以DNA為模板的DNA鏈的延伸(3)②④(4)B解析

(1)由圖可知,EcoRⅠ將DNA分子切出兩個(gè)黏性末端,可判斷EcoRⅠ是一種限制性內(nèi)切核酸(或限制)酶;限制酶能夠識(shí)別雙鏈DNA分子的某種特定核苷酸序列,并且使每一條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷裂。(2)DNA連接酶催化相鄰核苷酸之間的3'-羥基與5'-磷酸間形成磷酸二酯鍵;PCR擴(kuò)增DNA的過(guò)程包括變性、復(fù)性和延伸,高溫90

℃變性是為了破壞堿基對(duì)之間的氫鍵,獲得DNA單鏈,TaqDNA聚合酶能夠催化以DNA為模板的DNA子鏈沿引物的3'端延伸。(3)引物是一小段單鏈DNA,引物5'端的堿基可以與DNA兩條鏈的3'端的堿基進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì),可作為DNA復(fù)制的起始點(diǎn),子鏈的延伸方向?yàn)?'→3'。據(jù)題圖分析,結(jié)合已知序列可知,能與片段F左邊配對(duì)的引物為④,與右邊配對(duì)的引物為②,故步驟Ⅲ選用的PCR引物應(yīng)為②④。(4)對(duì)PCR產(chǎn)物測(cè)序,得到了片段F的完整序列,由于片段F具有被限制酶EcoRⅠ剪切的黏性末端,EcoRⅠ識(shí)別的序列是GAATTC,且在G與A之間切割,所以5'端應(yīng)該是AATTC,3'端是GAATT。解題指引

信息指引(1)已知一小段DNA的序列,采用PCR擴(kuò)增目的基因(2)已知的DNA序列和PCR引物序列(3)PCR產(chǎn)物測(cè)序誤區(qū)點(diǎn)睛(1)EcoRⅠ酶不僅能夠切下目的基因,還能夠切開(kāi)載體(2)質(zhì)粒是環(huán)狀DNA分子,限制酶切割后得到一個(gè)DNA雙鏈(3)一個(gè)目的基因的引物有兩種答題要語(yǔ)(1)基因工程的剪刀是限制酶(2)DNA聚合酶催化磷酸二酯鍵形成(3)高溫具有和解旋酶相似的作用,可使氫鍵斷裂核心素養(yǎng)(1)結(jié)合題干信息,分析PCR技術(shù)的過(guò)程,形成科學(xué)思維習(xí)慣(2)掌握PCR技術(shù)的原理和三個(gè)基本步驟,學(xué)以致用,指導(dǎo)生產(chǎn)生活,培養(yǎng)社會(huì)責(zé)任專項(xiàng)訓(xùn)練1.(2022湖北)某實(shí)驗(yàn)利用PCR技術(shù)獲取目的基因,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示除目的基因條帶(引物與模板完全配對(duì))外,還有2條非特異條帶(引物和模板不完全配對(duì))。為了減少反應(yīng)非特異條帶的產(chǎn)生,以下措施中有效的是(

)A.增加模板DNA的量 B.延長(zhǎng)熱變性的時(shí)間C.延長(zhǎng)延伸的時(shí)間

D.提高復(fù)性的溫度答案

D

解析

增加模板DNA的量可以提高反應(yīng)速度,但不能有效減少非特異條帶的產(chǎn)生,A項(xiàng)不符合題意;延長(zhǎng)熱變性的時(shí)間和延長(zhǎng)延伸的時(shí)間會(huì)影響變性延伸過(guò)程,但對(duì)于延伸中的配對(duì)影響不大,故不能有效減少反應(yīng)非特異條帶的產(chǎn)生,B、C兩項(xiàng)不符合題意;非特異性產(chǎn)物增加的原因可能是復(fù)性溫度過(guò)低,造成引物與模板的結(jié)合位點(diǎn)增加,故可通過(guò)提高復(fù)性的溫度來(lái)減少反應(yīng)非特異條帶的產(chǎn)生,D項(xiàng)符合題意。2.(2022湖北開(kāi)學(xué)考試)熒光定量PCR技術(shù)可定量檢測(cè)樣本中DNA含量,其原理是:在PCR反應(yīng)體系中加入引物的同時(shí),加入與某條模板鏈互補(bǔ)的熒光探針,當(dāng)Taq酶催化子鏈延伸至探針處會(huì)水解探針,使熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)接收到熒光信號(hào),即每擴(kuò)增一次,就有一個(gè)熒光分子生成(如下圖)。下列說(shuō)法不正確的是(

)A.該技術(shù)的原理是DNA的體外復(fù)制,需要用到解旋酶和Taq酶B.該技術(shù)需要用到一對(duì)引物,且引物之間的堿基序列不能互補(bǔ)C.該技術(shù)中DNA聚合酶只能從引物的3'端開(kāi)始延伸DNA鏈D.若循環(huán)次數(shù)相同,熒光值越高,證明新冠病毒感染程度越高熒光定量PCR技術(shù)答案

A

解析

PCR技術(shù)用的原理是DNA的體外復(fù)制,其中雙鏈解聚靠的是高溫,不需要解旋酶,A項(xiàng)錯(cuò)誤;PCR技術(shù)用到的引物之間的堿基序列不能互補(bǔ),以免影響引物與模板鏈的結(jié)合,B項(xiàng)正確;DNA聚合酶只能從引物的3'端開(kāi)始延伸DNA鏈,C項(xiàng)正確;循環(huán)次數(shù)相同時(shí),熒光值越高,證明感染的新冠病毒越多,感染程度越高,D項(xiàng)正確。3.(2022江蘇連云港模擬)常用的PCR技術(shù)有實(shí)時(shí)熒光定量PCR、RT-PCR、重疊延伸PCR等,其中重疊延伸PCR技術(shù)是一種通過(guò)寡聚核苷酸鏈之間重疊的部分互相搭橋、互為模板,通過(guò)多次PCR擴(kuò)增,從而獲得目的基因的方法。該技術(shù)在擴(kuò)增較長(zhǎng)片段的DNA、不同來(lái)源的DNA片段拼接、基因的定點(diǎn)誘變等方面具有廣泛的應(yīng)用前景。利用重疊延伸PCR技術(shù)進(jìn)行定點(diǎn)突變可以實(shí)現(xiàn)對(duì)纖維素酶基因的合理改造,