分子光譜基礎(chǔ)知識

分光光度計的原理分光光度法測量的理論依據(jù)是伯郎—比耳定律：當容液中的物質(zhì)在光的液對光的吸取程度A與溶液的濃度c〔g/l〕或液層厚度b(cm)成正比。其定律表達式A=abc熒光分光光度計原理:在溶液中，當熒光物質(zhì)的濃度較低時,其熒光強度與該物質(zhì)的濃度通常有良好的正比關(guān)系,即IF=KC,利用這種關(guān)系可以進展熒光物質(zhì)的定量分析,與紫外-可見分光光電倍增管所承受，然后以圖或數(shù)字的形式顯示出來。物質(zhì)熒光的產(chǎn)生是由在通常狀況下處于基態(tài)的物質(zhì)分子吸取激發(fā)光后變?yōu)榧ぐl(fā)態(tài),這些處于激發(fā)態(tài)的分子是不穩(wěn)定的,在返回基態(tài)的過程中將一局部的能量又以光的形式放出，從而產(chǎn)生熒光．三.熒光與分子構(gòu)造的關(guān)系1.分子構(gòu)造與熒光具有p、p及n、p電子共軛構(gòu)造的分子能吸取紫外和可見輻射而發(fā)生p-p*或n-p*躍遷，然后在受激分子的去活化過程中發(fā)生p*-p或p*-n躍遷而放射熒光。發(fā)生p-p*躍遷分子，其摩爾吸光系數(shù)〔?〕比n-p*躍遷分子的大100—1000倍，它的激發(fā)單線態(tài)與三線態(tài)間的能量差異比n-p* 的大的多，電子不易形成自旋反轉(zhuǎn)，體系間跨越幾率很小，因此，p-p*躍遷的分子，發(fā)生熒光的量子效率高，速率常數(shù)大，熒光也強。所以——只有那些具有p-p共軛雙鍵的分子才能放射較強的熒光；p電子共軛程度越大，熒光強度就越大〔lex與lem長移〕大多數(shù)含芳香環(huán)、雜環(huán)的化合物能發(fā)出熒光，且p電子共軛越長F越大。2.取代基對分子放射熒光的影響1〔苯環(huán)上〕取代給電子基團使p共軛程度上升à熒光強度增加如–CH3，–NH2，–OH，–OR〔2〕〔3〕高原子序數(shù)原子，增加體系間跨越的發(fā)生，使熒光減弱甚至熄滅。如Br，I。3.共面有剛性，它是強熒光物質(zhì)；而酚酞分子由于不易保持平面構(gòu)造，故而不是熒光物質(zhì)。有機化合物的紫外-〔三種：σ電子、π電子、n電子〕態(tài)向激發(fā)態(tài)(反鍵軌道)〔ΔΕ〕n→π*<π→π*<n→σ*<σ→σ*1．σ→σ*躍遷飽和烷烴的分子吸取光譜消滅在遠紫外區(qū)(吸取波長λ<200nm，只能被真空紫外分光光度計檢測到)。如甲烷的λmax為125nm,乙烷λmax為135n2n→σ躍遷含NOS均呈現(xiàn)n→σ*躍遷。分子吸取光譜儀分子中包含有原子和電子,分子,原子,電子都是運動著的物質(zhì),都具有能量,且都是量子化的.在肯定的條件下,分子處于肯定的運動狀態(tài),物質(zhì)分子內(nèi)部運動狀態(tài)有三種形式:1電子運動:電子繞原子核作相對運動;2原子運動:分子中原子或原子團在其平衡位置上作相對振動;3分子轉(zhuǎn)動;整個分子繞其重心作旋轉(zhuǎn)運動.1.原理：原子吸取光譜法，即基于原原子的數(shù)量有關(guān)，即由吸取前后輻射光強度的變化可確定待測元素的濃度。熒光光度計工作原理：由光源發(fā)出的光，經(jīng)第一單色器〔激發(fā)光單色器〕后，得到所需要的激發(fā)光波長的光。設(shè)其強度為I0，通過試樣池后，由于一局部光被熒光物質(zhì)所吸取，故其透射強度減為I。熒光物質(zhì)被激發(fā)后，將向四周八方放射熒光，但為了消退入射光及散射光的作用是消退溶液是可能共存的其它光線的干擾，以獲得所需要的熒光。熒光、磷光與有機化合物構(gòu)造的關(guān)系躍遷類型：大多數(shù)熒光物質(zhì)受激發(fā)后：經(jīng)受：π→π*，n→π*，躍遷〔激發(fā)。經(jīng)過振動弛豫或無輻射躍遷發(fā)生π*→π，π*→n躍遷產(chǎn)生熒光。π→π*n→π*躍遷大102～103倍，π→π*躍遷的壽命〔10－7～10－9s〕比n→π*〔10－5～10－7s〕π*→π躍遷常能產(chǎn)生較強的熒光。π*→n躍遷產(chǎn)生的熒光n→π*π*π總之，π→π*躍遷是產(chǎn)生熒光的主要躍遷類型化學(xué)發(fā)光分析的根本原理1、原理：基于化學(xué)反響供給足夠的能量，使其中一種反響產(chǎn)物的光。紫外吸取法測蛋白質(zhì)含量蛋白質(zhì)分子中含有酪氨酸,色氨酸及苯丙氨酸殘基,它們的構(gòu)造中具有共軛雙鏈,對紫外光有吸取作用,其最大值在280nm波特長.在此波長四周,蛋白質(zhì)溶液的光吸取值與其含量(范圍是0.1~1.0mg/ml)成正比,因此,280nm的吸光度可用作蛋白質(zhì)的定量測定.但不同種的蛋白質(zhì)對280nm波長的光吸取強度因芳香性氨基酸殘基含量的不同而有差異,因此需用同種蛋白質(zhì)作比照,.在半定量測定和純蛋白的定量測定時,可用280nm的光吸取法.此外,局部純化的蛋白質(zhì)常含有核酸,核酸,核苷酸和堿基等物質(zhì)在紫外區(qū)也有強的光吸取,常與蛋白質(zhì)類相互干擾.但二者的紫外吸取特性不一樣,由于核酸類物260nm有最大吸取值,因此,可利用蛋白質(zhì)280nm260nm的吸取差法來測定計算蛋白質(zhì)濃度.紫外吸取法操作簡便快捷,不消耗樣品,低濃度的鹽類不干擾測定,在蛋白質(zhì)和酶的生化制備及其它爭論中應(yīng)用廣泛,尤其是適合于柱層析分別中蛋白質(zhì)洗脫狀況的檢測.蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光含有芳香族氨基酸(色氨酸(trptophan,Trp)、酪氨酸(tyrosine,Tyr)和苯丙氨酸(phenylalanine,Phe))殘基的蛋白質(zhì)在280nm或295nm的激發(fā)光的激發(fā)下會產(chǎn)生熒光,這種熒光稱為內(nèi)源性熒光(自然熒光)。蛋白質(zhì)熒光來自于Trp、以及Phe,其Tyr熒光光譜對環(huán)境極為敏感,成為爭論蛋白質(zhì)的構(gòu)造、折疊動力學(xué)以及蛋Trp、和Phe由于其側(cè)鏈生色基團的不同Tyr而有348303nm,其中Trp的熒光強度最大,而Phe的282熒光強度則很低,因此蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒