食品質(zhì)量安全檢驗人員微生物培訓(xùn)班基礎(chǔ)

第六期全省質(zhì)監(jiān)系統(tǒng)食品質(zhì)量安全檢驗人員（微生物）培訓(xùn)班

食品微生物實驗基礎(chǔ)知識南京市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗院

國家農(nóng)副產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心

劉新梅

2023/12/101●食品微生物實驗室的基本要求

●微生物檢驗人員的工作規(guī)范

●微生物檢驗的基礎(chǔ)知識2023/12/102一、食品微生物實驗室的基本要求GB4789.1—2010食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗總則NationalfoodsafetystandardFoodmicrobiologicalexamination:Generalguidelines

3.1環(huán)境3.2人員3.3設(shè)備3.4檢驗用品3.5培養(yǎng)基、試劑及菌種2023/12/1033.1環(huán)境3.1.1實驗室環(huán)境不應(yīng)影響檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。3.1.2實驗室的工作區(qū)域應(yīng)與辦公室區(qū)域明顯分開。3.1.3實驗室工作面積和總體布局應(yīng)能滿足從事檢驗工作的需要，實驗室布局應(yīng)采用單方向工作流程，避免交叉污染。3.1.4實驗室內(nèi)環(huán)境的溫度、濕度、照度、噪聲和潔凈度等應(yīng)符合工作要求。3.1.5一般樣品檢驗應(yīng)在潔凈區(qū)域[包括超凈工作臺或潔凈實驗室]進(jìn)行，潔凈區(qū)域應(yīng)有明顯的標(biāo)示。

3.1.6病原微生物分離鑒定工作應(yīng)在二級生物安全實驗室（Biosafetylevel2,BSL-2）進(jìn)行。2023/12/104實驗室的分類、分級及適用范圍實驗室分級根據(jù)所操作的生物因子的危害程度和采取的防護(hù)措施，將生物安全防護(hù)水平分為四級。各級實驗室的生物防護(hù)水平依次為：一級最低，四級最高。2023/12/105生物安全防護(hù)水平（BSL）一級生物安全防護(hù)水平（BSL－1）二級生物安全防護(hù)水平（BSL－2）三級生物安全防護(hù)水平（BSL－3）四級生物安全防護(hù)水平（BSL－4）2023/12/106實驗室的分類、分級及適用范圍實驗室各級定義及適用范圍一級生物安全防護(hù)實驗室

實驗室結(jié)構(gòu)和設(shè)施、安全操作規(guī)程、安全設(shè)備適用于對健康成年人已知無致病作用的微生物，如用于教學(xué)的普通微生物實驗室等。2023/12/107一級生物安全防護(hù)實驗室

BSL－1：

不需要特殊的防護(hù)屏障、除需要洗手池外，依靠標(biāo)準(zhǔn)的微生物操作即可獲得基本的防護(hù)水平。2023/12/108一級生物安全防護(hù)實驗室2023/12/109實驗室的分類、分級及適用范圍實驗室各級定義及適用范圍二級生物安全防護(hù)實驗室

實驗室結(jié)構(gòu)和設(shè)施、安全操作規(guī)程、安全設(shè)備適用于對人或環(huán)境具有中等潛在危害的微生物。如臨床檢驗實驗室等。

普通微生物實驗室加上使用生物安全柜。2023/12/1010BSL－2：安全設(shè)備(一級屏障)

在BSL-1設(shè)施基礎(chǔ)上增加:生物安全柜（BSC，二級）：在涉及下例情況，從事感染性生物因子工作時應(yīng)該使用氣溶膠和飛濺大容量培養(yǎng)高濃度2023/12/1011BSL－2：安全設(shè)備(一級屏障)在BSL-1設(shè)施的基礎(chǔ)上，增加:高壓滅菌鍋眼睛清洗站2023/12/1012二級生物安全防護(hù)實驗室典型的二級生物安全水平實驗室（圖片由CUH2A，Princeton，NJ，USA提供）。在生物安全柜中進(jìn)行可能發(fā)生氣溶膠的操作程序。門保持關(guān)閉并貼上適當(dāng)?shù)奈ｋU標(biāo)志。潛在被污染的廢棄物同普通廢棄物隔開。2023/12/1013二級生物安全防護(hù)實驗室基本生物安全設(shè)備

1、移液輔助器——避免用口吸的方式移液。有不同設(shè)計的多種產(chǎn)品可供使用。

2、生物安全柜，在以下情況使用：—— 處理感染性物質(zhì)；如果使用密封的安全離心杯，并在生物安全柜內(nèi)裝樣、取樣，則這類材料可在開放實驗室離心—— 空氣傳播感染的危險增大時—— 進(jìn)行極有可能產(chǎn)生氣溶膠的操作時（包括離心、研磨、混勻、劇烈搖動、超聲破碎、打開內(nèi)部壓力和周圍環(huán)境壓力不同的盛放有感染性物質(zhì)的容器、動物鼻腔接種以及從動物或卵胚采集感染性組織）。

3、一次性塑料接種環(huán)，也可在生物安全柜內(nèi)使用電加熱接種環(huán)，以減少生成氣溶膠。

4、螺口蓋試管及瓶子。

5、用于清除感染性材料污染的高壓滅菌器或其他適當(dāng)工具。

6、一次性塑料移液管，盡量避免使用玻璃制品。

7、在投入使用前，像高壓滅菌器和生物安全柜等設(shè)備必須用正確方法進(jìn)行驗收。應(yīng)參照生產(chǎn)商的說明書定期檢測。2023/12/1014實驗室的分類、分級及適用范圍實驗室各級定義及適用范圍三級生物安全防護(hù)實驗室

實驗室結(jié)構(gòu)和設(shè)施、安全操作規(guī)程、安全設(shè)備適用于主要通過呼吸途徑使人傳染上嚴(yán)重的甚至是致死疾病的致病微生物及其毒素，通常已有預(yù)防傳染的疫苗。

2023/12/1015BSL－3：安全設(shè)備(一級屏障)在BSL-1and2安全設(shè)備的基礎(chǔ)上，加:

感染性材料的操作在II級或III級生物安全柜

呼吸道保護(hù)在二級生物安全防護(hù)水平上增加特殊防護(hù)服、進(jìn)入制度、定向氣流2023/12/1016三級生物安全防護(hù)實驗室

典型的三級生物安全水平實驗室。實驗室與公共通道分開并通過緩沖間（雙門入口或二級生物安全水平的基礎(chǔ)實驗室）或氣鎖室進(jìn)入。處理廢棄物前，在實驗室內(nèi)先進(jìn)行高壓滅菌以清除污染。應(yīng)有非手控的水槽。形成向內(nèi)氣流而且涉及感染性材料的全部工作應(yīng)在生物安全柜中進(jìn)行。在二級生物安全防護(hù)水平上增加特殊防護(hù)服、進(jìn)入制度、定向氣流2023/12/1017實驗室的分類、分級及適用范圍實驗室各級定義及適用范圍四級生物安全防護(hù)實驗室

實驗室結(jié)構(gòu)和設(shè)施、安全操作規(guī)程、安全設(shè)備適用于對人體具有高度的危險性，通過氣溶膠途徑傳播或傳播途徑不明，目前尚無有效的疫苗或治療方法的致病微生物及其毒素。與上述情況類似的不明微生物，也必須在四級生物安全防護(hù)實驗室中進(jìn)行。待有充分?jǐn)?shù)據(jù)后再決定此種微生物或毒素應(yīng)在四級還是在較低級別的實驗室中處理。2023/12/1018最高防護(hù)實驗室——四級生物安全防護(hù)實驗室實驗室操作：在三級生物安全防護(hù)水平上增加氣鎖入口、出口淋浴、污染物安全設(shè)施：Ⅲ級BSC或Ⅱ級BSC并穿著正壓服、雙開門高壓滅菌器（穿過墻體）、經(jīng)過濾的空氣2023/12/10193.2人員3.2.1檢驗人員應(yīng)具有相應(yīng)的教育、微生物專業(yè)培訓(xùn)經(jīng)歷，具備相應(yīng)的資質(zhì)，能夠理解并正確實施檢驗。3.2.2檢驗人員應(yīng)掌握實驗室生物檢驗安全操作知識和消毒知識。

3.2.3檢驗人員應(yīng)在檢驗過程中保持個人整潔與衛(wèi)生，防止人為污染樣品。3.2.4檢驗人員應(yīng)在檢驗過程中遵守相關(guān)預(yù)防措施的規(guī)定，保證自身安全。3.2.5有顏色視覺障礙的人員不能執(zhí)行涉及到辨色的實驗。一、食品微生物實驗室的基本要求2023/12/10203.3設(shè)備3.3.1實驗設(shè)備應(yīng)滿足檢驗工作的需要。

3.3.2實驗設(shè)備應(yīng)放置于適宜的環(huán)境條件下，便于維護(hù)、清潔、消毒與校準(zhǔn)，并保持整潔與良好的工作狀態(tài)。3.3.3實驗設(shè)備應(yīng)定期進(jìn)行檢查、檢定（加貼標(biāo)識）、維護(hù)和保養(yǎng)，以確保工作性能和操作安全。3.3.4實驗設(shè)備應(yīng)有日常性監(jiān)控記錄和使用記錄。一、食品微生物實驗室的基本要求2023/12/1021微生物檢測設(shè)施、設(shè)備一覽超凈工作臺或生物潔凈室微生物培養(yǎng)箱（36℃±1℃等

）天平：（感量0.1g，0.01g）電熱干燥箱（干熱滅菌）高壓滅菌鍋（濕熱滅菌）生物安全柜（最重要的安全設(shè)備，形成最主要的防護(hù)屏障）顯微鏡水浴鍋、冰箱、冰柜2023/12/10223.4檢驗用品3.4.1常規(guī)檢驗用品主要有接種環(huán)（針）、酒精燈、鑷子、剪刀、藥匙、消毒棉球、硅膠（棉）塞、微量移液器、吸管、吸球、試管、平皿、微孔板、廣口瓶、量筒、玻棒及L形玻棒等。

3.4.2檢驗用品在使用前應(yīng)保持清潔和/或無菌。常用的滅菌方法包括濕熱法、干熱法、化學(xué)法等。3.4.3需要滅菌的檢驗用品應(yīng)放置在特定容器內(nèi)或用合適的材料（如專用包裝紙、鋁箔紙等）包裹或加塞，應(yīng)保證滅菌效果。3.4.4可選擇適用于微生物檢驗的一次性用品來替代反復(fù)使用的物品與材料（如培養(yǎng)皿、吸管、吸頭、試管、接種環(huán)等）。3.4.5檢驗用品的儲存環(huán)境應(yīng)保持干燥和清潔,已滅菌與未滅菌的用品應(yīng)分開存放并明確標(biāo)識。3.4.6滅菌檢驗用品應(yīng)記錄滅菌/消毒的溫度與持續(xù)時間。2023/12/10233.5培養(yǎng)基和試劑3.5.1培養(yǎng)基培養(yǎng)基的制備和質(zhì)量控制按照GB/T4789.28的規(guī)定執(zhí)行。3.5.2試劑檢驗試劑的質(zhì)量及配制應(yīng)適用于相關(guān)檢驗。對檢驗結(jié)果有重要影響的關(guān)鍵試劑應(yīng)進(jìn)行適用性驗證。3.6菌株3.6.1應(yīng)使用微生物菌種保藏專門機構(gòu)或同行認(rèn)可機構(gòu)保存的、可溯源的標(biāo)準(zhǔn)或參考菌株。3.6.2應(yīng)對從食品、環(huán)境或人體分離、純化、鑒定的，未在微生物菌種保藏專門機構(gòu)登記注冊的原始分離菌株（野生菌株）進(jìn)行系統(tǒng)、完整的菌株信息記錄，包括分離時間、來源，表型及分子鑒定的主要特征等。3.6.3實驗室應(yīng)保存能滿足實驗需要的標(biāo)準(zhǔn)或參考菌株，在購入和傳代保藏過程中，應(yīng)進(jìn)行驗證試驗，并進(jìn)行文件化管理。2023/12/1024微生物檢驗人員的工作規(guī)范■

無菌操作■生物安全2023/12/1025無菌操作（徹底滅菌、防止污染）無菌及無菌操作的概念：無菌是指在環(huán)境中一切有生命活動的微生物的營養(yǎng)細(xì)胞及其芽孢或孢子都不存在的狀態(tài)。無菌操作是指在無菌環(huán)境下進(jìn)行的細(xì)胞傳代培養(yǎng)、植物組織培養(yǎng)、細(xì)菌接種等操作,目的是防止微生物進(jìn)入人體組織或其他無菌范圍。泛指在培養(yǎng)微生物的操作中，所有防止雜菌污染的方法?！駸o菌環(huán)境（無菌室、超凈工作臺）●無菌材料（培養(yǎng)基和試劑、器皿、用具的滅菌）●防止污染，保持無菌狀態(tài)2023/12/1026無菌室

ⅰ、無菌室應(yīng)完全封閉，進(jìn)出無菌室至少要經(jīng)兩道門，中間隔有緩沖間，無菌室與外間設(shè)置一個可開閉的窗口，用于傳遞器具。

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ⅱ、無菌室必須保持整潔。工作人員進(jìn)入無菌室應(yīng)換專用鞋、專用衣。無菌室使用前須用紫外線消毒30min，操作結(jié)束后清潔臺面，再用紫外線消毒30min。定期用乳酸或甲醛熏蒸，徹底消毒。2023/12/1028

ⅲ、無菌室僅用于培養(yǎng)基分裝等無菌操作，不能進(jìn)行有菌標(biāo)本的操作。操作人員操作時應(yīng)嚴(yán)格關(guān)門，并戴好專用的手套、口罩、帽子、防護(hù)服等個人防護(hù)裝備

ⅳ、無菌室內(nèi)應(yīng)有空氣過濾裝置，并安裝空調(diào)。2023/12/1029微生物檢驗人員的工作規(guī)范無菌操作要求食品微生物實驗室工作人員，必須有嚴(yán)格的無菌觀念，微生物實驗的許多試驗要求在無菌條件下進(jìn)行，主要原因是防止試驗操作中人為污染樣品。1．接種細(xì)菌時必須穿工作服、戴工作帽。2．進(jìn)行接種食品樣品時，必須穿專用的工作服、帽及拖鞋，應(yīng)放在無菌室緩沖間，工作前經(jīng)紫外線消毒后使用。3．接種食品樣品時，應(yīng)在進(jìn)無菌室前用肥皂洗手，然后用75％酒精棉球?qū)⑹植粮蓛簟?．進(jìn)行接種所用的吸管，平皿及培養(yǎng)基等必須經(jīng)消毒滅菌，打開包裝未使用完的器皿，不能放置后再使用，金屬用具應(yīng)高壓滅菌或用95%酒精點燃燒灼三次后使用。5．從包裝中取出吸管時，吸管尖部不能觸及外露部位，使用吸管接種于試管或平皿時，吸管尖不得觸及試管或平皿邊。6．接種樣品、轉(zhuǎn)種細(xì)菌必須在酒精燈前操作，接種細(xì)菌或樣品時，吸管從包裝中取出后及打開試管塞都要通過火焰消毒。7．接種環(huán)和針在接種細(xì)菌前應(yīng)經(jīng)火焰燒灼全部金屬絲，必要時還要燒到環(huán)和針與桿的連接處。8．吸管吸取菌液或樣品時，應(yīng)用相應(yīng)的橡皮頭吸取，不得直接用口吸。2023/12/1030微生物檢驗人員的工作規(guī)范9無菌間使用要求1）無菌間內(nèi)應(yīng)保持清潔，工作后用消毒液擦拭工作臺面，不得存放與實驗無關(guān)的物品。2)無菌間使用前后應(yīng)將門關(guān)緊，打開紫外燈，如采用室內(nèi)懸吊紫外燈消毒時，需30W紫外燈，距離在1.0m處，照射時間不少于30min，燈管每隔兩周需用酒精棉球輕輕擦拭，除去上面灰塵和油垢，以減少紫外線穿透的影響。處理和接種食品標(biāo)本時，進(jìn)入無菌間操作，不得隨意出入，如需要傳遞物品，可通過傳遞窗傳遞。定期對無菌間進(jìn)行沉降菌的監(jiān)測和記錄。2023/12/1031檢查無菌操作是否規(guī)范的直接方法------空白對照根據(jù)GB4789.2菌落總數(shù)測定，將營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傾入加有1ml滅菌生理鹽水滅菌培養(yǎng)皿內(nèi)作空白對照。空白對照的結(jié)果至少可以說明三個問題：（1）實驗所使用的材料滅菌是否徹底，儲存是否合理得當(dāng)。（2）無菌室的空氣條件是否達(dá)到要求。（3）操作人員的無菌操作技術(shù)是否規(guī)范。由此可見，通過空白對照可直接檢驗實驗器皿、實驗條件以及實驗人員是否符合無菌操作的規(guī)定。如果從空白對照中看出無菌操作不規(guī)范，通過實驗進(jìn)一步找出原因所在，最終達(dá)到規(guī)范的無菌操作。2023/12/1032微生物檢驗人員的工作規(guī)范生物安全什么是生物危害？從廣義上：指有害或有潛在危害的生物因子對人、環(huán)境、生態(tài)和社會造成的危害或潛在危害。而狹義上：指在微生物和生物醫(yī)學(xué)實驗室研究過程中對工作人員造成的危害和對環(huán)境造成的污染。2023/12/1033生物安全GB19489-2004標(biāo)準(zhǔn)的內(nèi)涵:

對實驗室生物安全的通用要求，以保障工作人員充分避免所操作生物因子的危害，保證危險生物因子不向?qū)嶒炇彝鈹U(kuò)散?！吧锇踩R、防護(hù)技術(shù)的加強和安全設(shè)備的使用，對于防止大多數(shù)實驗室感染的發(fā)生是非常有效的”。

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微生物檢驗人員生物安全工作行為

1、實驗室內(nèi)禁止飲食、吸煙、處理隱形眼鏡、化妝及儲存食物；以移液器吸取液體，禁止口吸；非特殊情況，禁止使用針、注射器及其他利器，盡可能使用塑料器材代替玻璃器材，禁止用手處理破碎的玻璃器具。2、在實驗室中應(yīng)穿著工作服或罩衫等防護(hù)服。離開實驗室時，防護(hù)服必須脫下并留在實驗室內(nèi)，不得穿著外出。用過的工作服應(yīng)先消毒后再洗滌。3、當(dāng)手可能接觸感染材料、污染的表面或設(shè)備時應(yīng)戴手套，必要時宜戴兩副手套。不得戴著手套離開實驗室。工作完全結(jié)束后方可除去手套。一次性手套不得清洗和再次使用。4、可能產(chǎn)生致病微生物氣溶膠或出現(xiàn)濺出的操作以及處理高濃度或大容量感染性從材料均應(yīng)在生物安全柜中進(jìn)行，并使用個體防護(hù)設(shè)備。5、接觸微生物或含有微生物的物品后，脫掉手套后離開實驗室要洗手。6、所有樣本、培養(yǎng)物和廢棄物應(yīng)被假定含有傳染性生物因子應(yīng)以安全方式處理和處置，如高壓滅活。需運出實驗室滅活的物品必須放在專用密閉容器內(nèi)。2023/12/1035

微生物檢驗人員生物安全工作行為

1、實驗室內(nèi)禁止飲食、吸煙、處理隱形眼鏡、化妝及儲存食物；以移液器吸取液體，禁止口吸；非特殊情況，禁止使用針、注射器及其他利器，盡可能使用塑料器材代替玻璃器材，禁止用手處理破碎的玻璃器具。2、在實驗室中應(yīng)穿著工作服或罩衫等防護(hù)服。離開實驗室時，防護(hù)服必須脫下并留在實驗室內(nèi)，不得穿著外出。用過的工作服應(yīng)先消毒后再洗滌。3、當(dāng)手可能接觸感染材料、污染的表面或設(shè)備時應(yīng)戴手套，必要時宜戴兩副手套。不得戴著手套離開實驗室。工作完全結(jié)束后方可除去手套。一次性手套不得清洗和再次使用。4、可能產(chǎn)生致病微生物氣溶膠或出現(xiàn)濺出的操作以及處理高濃度或大容量感染性從材料均應(yīng)在生物安全柜中進(jìn)行，并使用個體防護(hù)設(shè)備。5、接觸微生物或含有微生物的物品后，脫掉手套后離開實驗室要洗手。6、所有樣本、培養(yǎng)物和廢棄物應(yīng)被假定含有傳染性生物因子應(yīng)以安全方式處理和處置，如高壓滅活。需運出實驗室滅活的物品必須放在專用密閉容器內(nèi)。2023/12/1036

微生物檢驗的基礎(chǔ)知識

一、培養(yǎng)基的配制與滅菌二、微生物的顯微鏡檢查2023/12/10371、教學(xué)要求

1.1了解培養(yǎng)基的分類

1.2了解并掌握培養(yǎng)基的配制、分裝方法

1.3掌握各種實驗室滅菌方法及技術(shù)

培養(yǎng)基的配制與滅菌

2023/12/10382、原理

培養(yǎng)基是供微生物生長、繁殖、代謝的混合養(yǎng)料。由于微生物具有不同的營養(yǎng)類型，對營養(yǎng)物質(zhì)的要求也各不相同，加之實驗和研究的目的不同，所以培養(yǎng)基的種類很多，使用的原料也各有差異，但從營養(yǎng)角度分析，培養(yǎng)基中一般含有微生物所必需的碳源、氮源、無機鹽、生長素以及水分等。另外，培養(yǎng)基還應(yīng)具有適宜的pH值、一定的緩沖能力、一定的氧化還原電位及合適的滲透壓。

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瓊脂是從石花菜等海藻中提取的膠體物質(zhì)，是應(yīng)用最廣的凝固劑。加瓊脂制成的培養(yǎng)基在98～100℃下融化，于45℃以下凝固。但多次反復(fù)融化，其凝固性降低。

任何一種培養(yǎng)基一經(jīng)制成就應(yīng)及時徹底滅菌，以備純培養(yǎng)用。一般培養(yǎng)基的滅菌采用高壓蒸汽滅菌。普通瓊脂培養(yǎng)基

2023/12/10403、分類

3.1按照培養(yǎng)基的成分分為：

(1)合成培養(yǎng)基：合成培養(yǎng)基的各種成分完全是已知的各種化學(xué)物質(zhì)。這種培養(yǎng)基的化學(xué)成分清楚，組成成分精確，重復(fù)性強，但價格較貴，而且微生物在這類培養(yǎng)基中生長較慢。如高氏一號合成培養(yǎng)基、察氏（Czapek）培養(yǎng)基等。

(2)天然培養(yǎng)基：由天然物質(zhì)制成，如蒸熟的馬鈴薯和普通牛肉湯，前者用于培養(yǎng)霉菌，后者用于培養(yǎng)細(xì)菌。這類培養(yǎng)基的化學(xué)成分很不定，也難以確定，但配制方便，營養(yǎng)豐富，所以常被采用。

(3)半合成培養(yǎng)基：在天然有機物的基礎(chǔ)上適當(dāng)加入已知成分的無機鹽類，或在合成培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加某些天然成分，如培養(yǎng)霉菌用的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。這類培養(yǎng)基能更有效地滿足微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的需要。2023/12/10413.2按照培養(yǎng)基的物理狀態(tài)分為：

(1)固體培養(yǎng)基：是在培養(yǎng)基中加入凝固劑，有瓊脂、明膠、硅膠等。固體培養(yǎng)基常用于微生物分離、鑒定、計數(shù)和菌種保存等方面。

(2)液體培養(yǎng)基：體培養(yǎng)基中不加任何凝固劑。這種培養(yǎng)基的成分均勻，微生物能充分接觸和利用培養(yǎng)基中的養(yǎng)料，適于作生理等研究，由于發(fā)酵率高，操作方便，也常用于發(fā)酵工業(yè)。

(3)半固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基中加入少量凝固劑而呈半固體狀態(tài)?？捎糜谟^察細(xì)菌的運動、鑒定菌種和測定噬菌體的效價等方面。常用凝固劑為瓊脂（其次為明膠），又叫洋菜、凍粉。

2023/12/10423.3按照微生物的種類分為：

細(xì)菌培養(yǎng)基、放線菌培養(yǎng)基、酵母菌培養(yǎng)基和霉菌培養(yǎng)基等四類。常用的細(xì)菌培養(yǎng)基有營養(yǎng)肉湯和營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基；常用的放線菌培養(yǎng)基為高氏1號培養(yǎng)基；常用的酵母菌培養(yǎng)基有馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基和麥芽汁培養(yǎng)基；常用的霉菌培養(yǎng)基有馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基、豆芽汁葡萄糖（或蔗糖）瓊脂培養(yǎng)基和察氏培養(yǎng)基等。2023/12/1043微小毛霉菌落沙堡弱培養(yǎng)基酵母菌在孟加拉紅培養(yǎng)基上

2023/12/10443.4按照培養(yǎng)基用途分為：

(1)加富培養(yǎng)基：是在培養(yǎng)基中加入血、血清、動植物組織提取液，用以培養(yǎng)要求比較苛刻的某些微生物。

(2)選擇性培養(yǎng)基：是根據(jù)某一種或某一類微生物的特殊營養(yǎng)要求或?qū)σ恍┪锢怼⒒瘜W(xué)抗性而設(shè)計的培養(yǎng)基。利用這種培養(yǎng)基可以將所需要的微生物從混雜的微生物中分離出來。

(3)鑒別培養(yǎng)基：是在培養(yǎng)基中加入某種試劑或化學(xué)藥品，使培養(yǎng)后會發(fā)生某種變化，從而區(qū)別不同類型的微生物。2023/12/10454操作流程和步驟1)稱量及溶化2)調(diào)pH

3)加瓊脂、溶化、定容、（過濾）4)分裝、加塞、包扎5)滅菌（高壓蒸汽滅菌法）2023/12/10465.1培養(yǎng)基的制備

1、稱量藥品:根據(jù)培養(yǎng)基配方依次準(zhǔn)確稱取各種藥品，放入適當(dāng)大小的燒杯中，瓊脂不要加入。蛋白胨極易吸潮，故稱量時要迅速。

2、溶解：用量筒取一定量(約占總量的1/2)蒸餾水倒入燒杯中，在放有石棉網(wǎng)的電爐上小火加熱，并用玻棒攪拌，以防液體溢出。待各種藥品完全溶解后，停止加熱，補足水分。如果配方中有淀粉，則先將淀粉用少量冷水調(diào)成糊狀，并在火上加熱攪拌，然后加足水分及其它原料，待完全溶化后，補足水分。

2023/12/1047

3

、調(diào)節(jié)pH

根據(jù)培養(yǎng)基對pH的要求，用5%NaOH或5%HCl溶液調(diào)至所需pH。測定pH可用pH試紙或酸度計等。

4

、溶化瓊脂

固體或半固體培養(yǎng)基須加入一定量瓊脂。瓊脂加入后，置電爐上一面攪拌一面加熱，直至瓊脂完全融化后才能停止攪拌，并補足水分(水需預(yù)熱)。注意控制火力不要使培養(yǎng)基溢出或燒焦。

2023/12/1048

5、過濾分裝

先將過濾裝置安裝好。如果是液體培養(yǎng)基，玻璃漏斗中放一層濾紙，如果是固體或半固體培養(yǎng)基，則需在漏斗中放多層紗布，或兩層紗布夾一層薄薄的脫脂棉趁熱進(jìn)行過濾。過濾后立即進(jìn)行分裝。分裝時注意不要使培養(yǎng)基沾染在管口或瓶口，以免浸濕棉塞引起污染。液體分裝高度以試管高度的1/4左右為宜。固體分裝裝量為管高的1/5，半固體分裝試管一般以試管高度的1/3為宜；分裝三角瓶，其裝量以不超過三角瓶容積的一半為宜。

2023/12/1049培養(yǎng)基的分裝（圖中是利用培養(yǎng)基分裝泵進(jìn)行分裝）2023/12/1050

6、包扎標(biāo)記

培養(yǎng)基分裝后加好棉塞或試管帽，再包上一層防潮紙，用棉繩系好。在包裝紙上標(biāo)明培養(yǎng)基名稱，制備組別和姓名、日期等。

7、滅菌

上述培養(yǎng)基應(yīng)按培養(yǎng)基配方中規(guī)定的條件及時進(jìn)行滅菌。普通培養(yǎng)基為121℃20min，以保證滅菌效果和不損傷培養(yǎng)基的有效成份。培養(yǎng)基經(jīng)滅菌后，如需要作斜面固體培養(yǎng)基，則滅菌后立即擺放成斜面，斜面長度一般以不超過試管長度的1/2為宜；半固體培養(yǎng)基滅菌后，垂直冷凝成半固體深層瓊脂。

8、倒平板

將需倒平板的培養(yǎng)基，于水浴鍋中冷卻到45～50℃,立刻倒平板2023/12/1051

5.2

滅菌方法和步驟

滅菌是指殺死或消滅一定環(huán)境中的所有微生物，滅菌的方法分物理和化學(xué)滅菌法兩大類。本次課主要介紹物理方法的一種，即加熱滅菌。

加熱滅菌包括濕熱和干熱滅菌兩種。通過加熱使菌體內(nèi)蛋白質(zhì)凝固變性，從而達(dá)到殺菌目的。蛋白質(zhì)的凝固變性與其自身含水量有關(guān)，含水量越高，其凝固所需要的溫度越低。在同一溫度下，濕熱的殺菌效力比干熱大，因為：(1)在濕熱條件下，細(xì)菌吸收水分，使菌體蛋白質(zhì)易于凝固變性。(2)溫?zé)嵴魵獾拇┩噶Ρ雀蔁峥諝鈴?，能較快提高滅菌物品內(nèi)部的溫度。(3)熱蒸氣與物品接觸，由氣態(tài)變?yōu)橐簯B(tài)時可放出大量潛熱，能迅速提高滅菌物品的溫度。2023/12/10521濕熱滅菌

1、煮沸消毒法

注射器和解剖器械等均可采用此法。先將注射器等用紗布包好，然后放進(jìn)煮沸消毒器內(nèi)加水煮沸。對于細(xì)菌的營養(yǎng)體煮沸約15～30min，對于芽孢則需煮沸約1～2h。

2、高壓蒸汽滅菌法

高壓蒸汽滅菌用途廣，效率高，是微生物學(xué)實驗中最常用的滅菌方法。這種滅菌方法是基于水的沸點隨著蒸汽壓力的升高而升高的原理設(shè)計的。當(dāng)蒸汽壓力達(dá)到1.05kg/cm2時，水蒸氣的溫度升高到121℃，經(jīng)15～30min，可全部殺死鍋內(nèi)物品上的各種微生物和它們的孢子或芽孢。一般培養(yǎng)基、玻璃器皿以及傳染性標(biāo)本和工作服等都可應(yīng)用此法滅菌。2023/12/1053

3、操作方法和注意事項如下

（1）加水

打開滅菌鍋蓋，向鍋內(nèi)加水到水位線。立式消毒鍋最好用已煮開過的水，以便減少水垢在鍋內(nèi)的積存。注意水要加夠，防止滅菌過程中干鍋。

（2）裝料、加蓋

滅菌材料放好后，關(guān)閉滅菌器蓋，采用對角式均勻擰緊鍋蓋上的螺旋，使蒸汽鍋密閉，勿使漏氣。2023/12/1054

（3）

排氣

打開排氣口(也叫放氣閥)。用電爐加熱，待水煮沸后，水蒸氣和空氣一起從排氣孔排出，當(dāng)有大量蒸汽排出時，維持5min，使鍋內(nèi)冷空氣完全排凈（4）

升壓、保壓和降壓

當(dāng)鍋內(nèi)冷空氣排凈時，即可關(guān)閉排氣閥，壓力開始上升。當(dāng)壓力上升至所需壓力時，控制電壓以維持恒溫，并開始計算滅菌時間，待時間達(dá)到要求（一般培養(yǎng)基和器皿滅菌控制在121℃，20min）后，停止加熱，待壓力降至接近“0”時，打開放氣閥。注意不能過早過急地排氣，否則會由于瓶內(nèi)壓力下降的速度比鍋內(nèi)慢而造成瓶內(nèi)液體沖出容器之外。

2023/12/1055（5）滅菌后的培養(yǎng)基空白培養(yǎng)

滅菌后的培養(yǎng)基放于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，經(jīng)24h培養(yǎng)無菌生長，可保存?zhèn)溆茫恍泵媾囵B(yǎng)基取出后，立即擺成斜面后空白培養(yǎng)；半固體的培養(yǎng)基垂直放置凝成半固體深層瓊脂后，空白培養(yǎng)。

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2、干熱滅菌法

通過使用干熱空氣殺滅微生物的方法叫干熱滅菌。一般是把待滅菌的物品包裝就緒后，放入電烘箱中烘烤，即加熱至160～170℃維持1～2h。

干熱滅菌法常用于空玻璃器皿、金屬器具的滅菌。凡帶有膠皮的物品，液體及固體培養(yǎng)基等都不能用此法滅菌。用此法滅菌時，絕不能用油、蠟紙包扎物品溫度降至60～70℃時方可打開箱門，取出物品，否則玻璃器皿會因驟冷而爆裂。2023/12/1057

3、火焰滅菌

直接用火焰灼燒滅菌，迅速徹底。對于接種環(huán)，接種針或其它金屬用具，可直接在酒精燈火焰上燒至紅熱進(jìn)行滅菌。此外，在接種過程中，試管或三角瓶口，也采用通過火焰而達(dá)到滅菌的目的。

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6、注意事項

1、要嚴(yán)格按配方配制。

2、培養(yǎng)基分裝過程中注意不要使培養(yǎng)基沾管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。

3、使用滅菌鍋應(yīng)嚴(yán)格按照操作程序進(jìn)行。滅菌所需時間到后，要先切斷電源，讓滅菌鍋內(nèi)溫度自然下降，當(dāng)壓力表的壓力降至0時，才能打開排氣閥。

4、每次制備培養(yǎng)基均應(yīng)有記錄，包括培養(yǎng)基名稱，配方及其來源和各種成分的牌號最終pH值、消毒的溫度和時間、制備的日期和制備者等，記錄應(yīng)復(fù)制一份原記錄保存?zhèn)洳?，?fù)制記錄隨制好的培養(yǎng)基一同存放，以防發(fā)生混亂。2023/12/1059

二、微生物的顯微鏡檢查微生物個體微小，其形態(tài)結(jié)構(gòu)用肉眼直接觀察不到，要利用顯微鏡。顯微鏡有不同類型，如普通光學(xué)顯微鏡、暗視野顯微鏡、相差顯微鏡、熒光顯微鏡、電子顯微鏡等，其應(yīng)用目的是不同的，實驗室可根據(jù)觀測項目不同選擇相應(yīng)的類型。2023/12/1060

由于微生物細(xì)胞含有大量水分（一般在80%～90%以上），對光線的吸收和反射與水溶液的差別不大，與周圍背景沒有明顯的明暗差。所以，除了觀察活體微生物細(xì)胞的運動性和直接計算菌數(shù)外，絕大多數(shù)情況下都必須經(jīng)過染色后，才能在顯微鏡下進(jìn)行觀察。但是，任何一項技術(shù)都不是完美無缺的。染色后的微生物標(biāo)本是死的，在染色過程中微生物的形態(tài)與結(jié)構(gòu)均會發(fā)生一些變化，不能完全代表其生活細(xì)胞的真實情況，染色觀察時必須注意。2023/12/1061

染色Ⅰ、染色的基本原理

微生物染色的基本原理，是借助物理因素和化學(xué)因素作用而進(jìn)行的。物理因素如細(xì)胞及細(xì)胞物質(zhì)對染料的毛細(xì)現(xiàn)象、滲透、吸附作用等?；瘜W(xué)因素則是根據(jù)細(xì)胞物質(zhì)和染料的不同性質(zhì)而發(fā)生的各種化學(xué)反應(yīng)。細(xì)菌的等電點較低，PH值大約在2～5之間，故在中性、堿性或弱酸性溶液中，菌體蛋白質(zhì)電離后帶負(fù)電荷；而堿性染料電離時染料離子帶正電。

所以，在細(xì)菌學(xué)上常用堿性染料進(jìn)行染色。2023/12/1062

影響染色的其他因素還有菌體細(xì)胞的構(gòu)造和其外膜的通透性，如細(xì)胞膜的通透性、膜孔的大小和細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整與否，在染色上都起一定作用。此外，培養(yǎng)基的組成、菌齡、染色液中的電介質(zhì)含量和PH、溫度、藥物的作用等，也都能影響細(xì)菌的染色。2023/12/1063Ⅱ、染色方法

微生物的染色方法很多，各種方法應(yīng)用的染料也不盡相同，但是一般染色都要通過制片及一套染色操作程序，即：

制片、固定、媒染、染色、脫色、復(fù)染、水洗、干燥、鏡檢2023/12/1064

微生物染色方法一般分為單染色法和復(fù)染色法兩種。前者用一種染料使微生物染色，但不能鑒別微生物。復(fù)染色法是用兩種或兩種以上染料，有協(xié)助鑒別微生物的作用。故亦稱鑒別染色法。常用的復(fù)染色法有革蘭染色法和抗酸性染色法，此外還有鑒別細(xì)胞各部分結(jié)構(gòu)的（如芽孢、鞭毛、細(xì)胞核等）特殊染色法。2023/12/1065ⅰ、單染色法

用一種染色劑對涂片進(jìn)行染色，簡便易行，適于進(jìn)行微生物的形態(tài)觀察。在一般情況下，常用堿性染料進(jìn)行單染色，如美蘭、孔雀綠、堿性復(fù)紅、結(jié)晶紫和中性紅等。若使用酸性染料，多用剛果紅、伊紅、藻紅和酸性品紅等。使用酸性染料時，必須降低染液的PH值，使其呈現(xiàn)強酸性（低于細(xì)菌菌體等電點），讓菌體帶正電荷，才易于被酸性染料染色。2023/12/1066染色結(jié)果依染料不同而不同：石碳酸復(fù)紅染色液：著色快，時間短，菌體呈紅色美蘭染色液：著色慢，時間長，效果清晰，菌體呈蘭色

草酸銨結(jié)晶紫染色液：染色迅速，著色深，菌體呈紫色2023/12/1067

ⅱ、革蘭染色法

革蘭染色法是細(xì)菌學(xué)中廣泛使用的一種鑒別染色法，1884年由丹麥醫(yī)師Gram創(chuàng)立。細(xì)菌先經(jīng)堿性染料結(jié)晶染色，而經(jīng)碘液媒染后，用酒精脫色，在一定條件下有的細(xì)菌此色不被脫去，