臨床基因擴(kuò)增(PCR)診斷實(shí)驗(yàn)室工作規(guī)范

2臨床基因擴(kuò)增〔PCR〕診斷試驗(yàn)室工作標(biāo)準(zhǔn)〔試行〕效勞，特制定本標(biāo)準(zhǔn)。臨床基因擴(kuò)增試驗(yàn)室的設(shè)置：和儀器設(shè)備臨床PCR試驗(yàn)室應(yīng)分為四個(gè)隔開(kāi)的工作區(qū)域，每一區(qū)域都應(yīng)有專用的儀器設(shè)備。即1〕擴(kuò)增反響混合物配制和擴(kuò)增區(qū)和的擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。如使用擴(kuò)增和產(chǎn)物檢測(cè)同時(shí)完成的熒光定量PCR方法或全自動(dòng)如CobasT〔Anplicor〕3〕4〕兩個(gè)區(qū)可合并。與上述特定試驗(yàn)區(qū)有關(guān)的各個(gè)房間必需有明確的標(biāo)記如加樣器、試劑等的移出或不同的工作區(qū)間發(fā)生混淆。進(jìn)入各個(gè)工作區(qū)必需遵循一嚴(yán)格的〕～標(biāo)本制備區(qū)～擴(kuò)增反響混合物配制和擴(kuò)增區(qū)～擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。不同的工作區(qū)必需使用不同的工作服，可以不同的顏色來(lái)區(qū)分。此外，當(dāng)工作人員離開(kāi)各工作區(qū)時(shí)，不得將各區(qū)特定的工作服帶出。1．l．試劑貯存和預(yù)備區(qū)4冰箱和一20〔〕〔3〕微量加樣器假設(shè)干支〔掩蓋11000p〔〕專用〕〕消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離。心管和加樣器吸頭〔帶濾心〕可移動(dòng)紫外燈〔近工作臺(tái)面。標(biāo)本制備區(qū)標(biāo)本貯存、核酸提取及貯存均在本區(qū)內(nèi)進(jìn)展。RNA測(cè)定時(shí)的單鍵。cDNA合成也在本區(qū)進(jìn)展。本區(qū)儀器設(shè)備自己置〔420-70冰柜三〔2〕高達(dá)臺(tái)式冷凍離心〕4〕水浴箱或加熱模塊〔5〕微量如排器假設(shè)干支〔掩蓋1000μ專用工作服和工作鞋〔〕專用辦公用品8〕消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的部心管和加樣器吸頭〔帶濾心〔9〕可移動(dòng)紫外燈〔近工作臺(tái)面〔10〕超凈工1〕超聲波水浴〔處理大分子DNA適用。擴(kuò)增反響混合物配制和擴(kuò)增區(qū)模板材料〔來(lái)自標(biāo)本制備區(qū)〕〔來(lái)自試劑貯存和預(yù)備區(qū)〕的參與以及擴(kuò)〔〕核酸擴(kuò)增僅三〔2〕微量加樣器〔掩蓋～1000μ〕專用工作服和工作鞋〔〕專用辦公用品〕消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、高壓處理的部心管和加樣器吸頭〔帶濾心〔〕可移動(dòng)紫外燈〔近工作臺(tái)面。擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)6～8m。擴(kuò)增嚴(yán)物的分析在本區(qū)進(jìn)展。本區(qū)儀器設(shè)備配置：視檢測(cè)方法不同而定，如為PCR�ELISA，則需〔l〕微量加樣器假設(shè)干支〔掩蓋l～2s〔2〕酶標(biāo)權(quán)、〔〕專用工作服和工作鞋〔〕專用辦么，用品〔〕消耗品：～次性手套、一次性吸水紙、加樣器吸頭〔帶濾心〕可移動(dòng)紫外燈〔近工作臺(tái)面。臨床基因擴(kuò)增診斷試驗(yàn)室質(zhì)量保證臨床基因擴(kuò)增診斷試驗(yàn)室質(zhì)量保證涉及到整個(gè)基因擴(kuò)增檢測(cè)的全部階段的標(biāo)原來(lái)集處理、測(cè)定中的核酸提取、擴(kuò)增和產(chǎn)物分析以及測(cè)定后的結(jié)果報(bào)告等。標(biāo)本的采集常用于基因擴(kuò)增檢測(cè)的臨床標(biāo)本包括EDTA或拘檬酸鈉抗凝全血或骨髓、血清或血漿．痰、腦普液、尿及分泌物等。采樣容器最好是密閉的一次性的，如真空系血管。一次性塑〔ANA酶。RNA酶的主要來(lái)源是試驗(yàn)人員的手。最好是熱滅菌，250烘烤4RNA酶永久性失活。全血和骨髓標(biāo)本必需進(jìn)展抗凝處理。通常EDTA和拘檬酸鹽是首選的抗凝劑。不能使用肝素抗TaqRNA〔HCVRNA〕〔3小時(shí)以內(nèi)避開(kāi)RNA的降解。如未作抗凝處理，則物血后，必需在1小時(shí)內(nèi)分別血清。標(biāo)本的穩(wěn)定化處DNA分析，標(biāo)本采集后一般不需要特別的穩(wěn)定化處理，但標(biāo)本應(yīng)準(zhǔn)時(shí)送到試驗(yàn)室。由RNARNA測(cè)定的標(biāo)本的穩(wěn)定化處理有時(shí)是必不行少的，Chaotropic物質(zhì)[〔Guanidinethiocyanate，GITC〕]DNAseRNAse馬上失活。在采集標(biāo)本時(shí)，可將標(biāo)本材料如血清或血漿參與含有GITC的試劑管中進(jìn)展穩(wěn)定化處理。GITCRNAse5mol/LGITC濃度小于4mol／L；RNA會(huì)很快降解。在適當(dāng)?shù)姆€(wěn)定化處理后，標(biāo)本一般不需要冷藏即可郵寄。假設(shè)溫度低于室溫，GITC即會(huì)結(jié)晶，所以在參與標(biāo)本前應(yīng)使之完全溶解。如標(biāo)本不能準(zhǔn)時(shí)送到試驗(yàn)室，最好選用GITC處理方法以穩(wěn)定標(biāo)本。2．3標(biāo)本的運(yùn)送標(biāo)原來(lái)集后應(yīng)盡快送至試驗(yàn)室，經(jīng)過(guò)適當(dāng)穩(wěn)定化處理的標(biāo)本可在常溫下通過(guò)郵寄運(yùn)送。如用于DNA提取的含EDTA的全血標(biāo)本及用于RNA提取的經(jīng)GITC穩(wěn)定化處理的標(biāo)RNA放在干冰中運(yùn)送。標(biāo)本的貯存臨床體液標(biāo)本如血清／血漿等可于-70下長(zhǎng)時(shí)間貯存。用于DNA測(cè)定的核酸樣本應(yīng)在10mmol／LTris，lmmol／LEDTA緩沖液〔pH7．5－8．0〕中4保存。用于RNA測(cè)定80C或液氮中貯存。用乙醇沉淀的核酸樣本貯存在一20OC即可。用GIT〔：穩(wěn)定化處理的RNA標(biāo)本在室溫可保存7天，如貯存時(shí)間較長(zhǎng)，則RNA測(cè)定敏感性略有下降。標(biāo)本的處理〔核酸提取〕〔如血紅素及其前體或降解產(chǎn)物或核酸提取過(guò)程中確．留的有機(jī)溶劑〔如酚、氯份等從而影響靶核酸的擴(kuò)增測(cè)定。如在HBVDNAPCR測(cè)定中。承受對(duì)血清杯水煮沸裂解以釋放DNA的方法時(shí)，肉眼觀看不明顯的溶血也會(huì)對(duì)擴(kuò)增測(cè)定有很強(qiáng)的抑制作用，應(yīng)使用正規(guī)的核酸提取方法〔如經(jīng)典的酚一氯份提取方法、硅吸附法等。當(dāng)標(biāo)本為疾時(shí)，則必需先進(jìn)行液化處理。再提取核酸。需留意的是；液化時(shí)不能加熱，液化時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)。此外，當(dāng)靶核酸為RNART－PCR測(cè)定失敗的常見(jiàn)緣由是標(biāo)本在運(yùn)送前來(lái)經(jīng)充分的穩(wěn)定化處理．及核酸提取試劑的RNase的污染。對(duì)于前者，要核查測(cè)定分析前的步驟，假設(shè)沒(méi)．現(xiàn)RNA降解的證據(jù)。試驗(yàn)室則應(yīng)拒絕承受標(biāo)本，要求重實(shí)行標(biāo)本，并對(duì)運(yùn)送者給以具體的指導(dǎo)。對(duì)于后者，建議常規(guī)使用高質(zhì)量的商品核酸提取試劑。靶核酸的逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增2．6.lRNA的逆轉(zhuǎn)錄cDNA合成為RT-PCR中的第一個(gè)酶反響步驟，所產(chǎn)生的cDNA為靶RNA的反向互補(bǔ)鏈。為后面擴(kuò)增的模板。下述因素通常影響cDNA合成的效率：l〕RT活性的降低或完全缺乏。必需排解由于酶質(zhì)量不高、試劑降解或加樣錯(cuò)誤而引起的cDNA合成不充分。RT或熱穩(wěn)定聚合酶的抑制物〔如酚、血紅素RNA明顯為完整而沒(méi)有擴(kuò)增時(shí)，應(yīng)疑心有此類抑制物。RNA的降解。2．6．2影響擴(kuò)增的因素有多種因素可引起PCR〔見(jiàn)上、遲大溫環(huán)儀的溫度把握和加熱塊中熱傳導(dǎo)的全都性必需有常規(guī)的檢查以避開(kāi)假陰性結(jié)果。污染在實(shí)際工作中，常見(jiàn)有以下幾種污染類型：PCR片段的污染〔產(chǎn)物污染〕三自然基因組DNA的污染；試劑污染〔貯存液或工作液：以及交及污染〔如氣溶膠從一個(gè)陽(yáng)性標(biāo)本集中到原本陰性的標(biāo)本。對(duì)于全部的擴(kuò)增技術(shù)，由于圍繞試驗(yàn)室來(lái)查找污染源不僅耗時(shí)而PCR片段污染。2．7．l．測(cè)定分析前的污染源。測(cè)定分析前試驗(yàn)材料的污染主要來(lái)自非病人標(biāo)原來(lái)源的核酸。測(cè)定分析階段的污染源。的制備和反響建立階段所涉及到的試驗(yàn)設(shè)備的任何部位都是可能的污染源〔例如今血清白蛋白，明腋成礦物油；商品酶制劑；消耗品〔如反響管，吸頭〕和試驗(yàn)設(shè)備〔如加樣器、離心機(jī)。污染的來(lái)源之一是很多樣本在同時(shí)制備時(shí)的交及污染，但最主要的污染來(lái)源為以前擴(kuò)增產(chǎn)生的特異產(chǎn)物DNA片段。在前面三個(gè)工作區(qū)中，不當(dāng)?shù)脑囼?yàn)操作會(huì)引起所使用的試劑、消耗品或試驗(yàn)設(shè)備的污染。而在產(chǎn)物分析區(qū)，當(dāng)吸取PCR產(chǎn)物用于檢測(cè)時(shí)，格外簡(jiǎn)潔引起污染，因此必需制定并嚴(yán)格執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)操作程序。污染的避開(kāi)。應(yīng)中用dUTP取代局部dTTP：從而產(chǎn)生的特異擴(kuò)增片段含有尿嘧啶，這樣擴(kuò)增前在反響混合液中參與尿嘧啶糖激酶UNGDNA加合物，由于DNA加合物對(duì)擴(kuò)增沒(méi)有反響但又不阻礙PCR后雜交過(guò)程，所以這些DNA的污染。去除污染的措施。染措施包括但不僅限下面幾種：用100ml／L次氨酸鈉清潔外表；試驗(yàn)了后長(zhǎng)時(shí)間的紫外照耀試驗(yàn)操作臺(tái)和其他外表；試驗(yàn)設(shè)備如加樣器的高壓消毒。擴(kuò)增產(chǎn)物的分析擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)定有各種方法。如電泳、限制性酶切、斑點(diǎn)印跡、雜交、測(cè)序、分光光度法定量等。但臨床PCR測(cè)定工程根本上都使用探針雜交方法。2．8．l．與雜交檢測(cè)有關(guān)的干擾。交或洗滌方法不適宜。最常使用的基因探針有：DNA片段、合成的尊核普酸和體外的轉(zhuǎn)錄本〔反義RNA探針。探針的標(biāo)記物常用的有生物素、地高辛、熒光景和同位素等。在擴(kuò)性結(jié)果的先決條件，要留意的是，溫度和離子強(qiáng)度不能同時(shí)轉(zhuǎn)變。質(zhì)量把握如上所述，應(yīng)當(dāng)開(kāi)展各種質(zhì)控來(lái)評(píng)價(jià)測(cè)定分析當(dāng)中各步驟的質(zhì)量，如RNA的完整性、對(duì)擴(kuò)增是否適宜和敏感。室內(nèi)質(zhì)量把握DNA和RNA分析的各步進(jìn)展質(zhì)量把握，以避開(kāi)假陽(yáng)性和假陰性，保證測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。由于PCR測(cè)定的高敏感性，所以試劑的生產(chǎn)、試驗(yàn)材料的預(yù)備、PCR本身和上稍有不同。與試驗(yàn)材料的預(yù)備有關(guān)的質(zhì)控。對(duì)DNA提取試劑的效果最常用球脂糖凝膠電冰來(lái)檢測(cè)。可知所提取的DNA是否發(fā)生DNA的平均長(zhǎng)度一般為～100kbPCR的DNADNA30�40kb。然而；明顯消滅降解的DNA〔在1和10kb的低分子量范圍內(nèi)〕在經(jīng)瓊脂糖凝膠電冰分別和用溴化乙錠染色后也可見(jiàn)有強(qiáng)的熒光信號(hào)。用對(duì)甲基化不敏感的限制性內(nèi)切酶〔如EcoRI〕消化DNA，然后電泳分別，能夠?qū)γ富钚缘囊种苿┻M(jìn)展質(zhì)控〔在抑制劑存在的狀況下，高分子量的片段不被酶切。潛在的抑制劑的存在通常用260nm和280nm的分光光度測(cè)定來(lái)估量，好的DNA提取物，A260/A280比值應(yīng)當(dāng)在1．75--2．0之間；否則，污染〔殘留的蛋白或酚〕可能會(huì)很高。僅用光度計(jì)比色方法不能對(duì)DNA的完整性下結(jié)論。最快的對(duì)總RNA提取質(zhì)量把握的方法是在非變性條件下作瓊脂糖凝膠電冰，這一點(diǎn)跟DNA分別一樣，然而，假設(shè)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生疑心，就應(yīng)當(dāng)在變性的條件下作瓊脂糖凝膠電泳以檢測(cè)RNARNA(28S、18s和5S〕在凝膠上消滅的帶相對(duì)較窄。如發(fā)生RNA的降解。則帶被拖向低分子量或消滅帶的缺失。測(cè)定核糖體RNARNA制備的質(zhì)量評(píng)價(jià)的試驗(yàn)室內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)；對(duì)向低分子量拖尾的、不對(duì)稱性的峰的評(píng)估也是RNA完整性的適宜的指標(biāo)。另外，瓊脂糖凝膠電泳能顯示出在RNA的制備中被DNARNA的完整性下結(jié)論。對(duì)cDNA合成和擴(kuò)增的質(zhì)控。本局部包括陽(yáng)性質(zhì)控和陰性質(zhì)控。2．9．l．2．l．cDNA的合成。對(duì)CDNA合成的效率進(jìn)展監(jiān)控的關(guān)鍵性的質(zhì)控是使用一個(gè)內(nèi)反響質(zhì)控。cDNA的合成RNAcRNA轉(zhuǎn)錄本開(kāi)頭(mRNA，如核糖體蛋白轉(zhuǎn)錄本這一類的所謂的管家基因，也可從在制備時(shí)參與樣本中的作為內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)的RNA開(kāi)頭。cDNA合成的內(nèi)質(zhì)控是能夠產(chǎn)生確定產(chǎn)物的陽(yáng)性質(zhì)控；假設(shè)擴(kuò)增不成功，質(zhì)控就顯示出有RNA的降解、cDNA合成的過(guò)程中錯(cuò)誤啟動(dòng)或酶活性喪失。參與確定量的擴(kuò)增質(zhì)控物可以檢測(cè)RT�PCRRT－PCR方法所必需的污染質(zhì)控為無(wú)逆轉(zhuǎn)錄靶RNA的陰性質(zhì)控。2．9．1．2．2．PCR反響。豐臺(tái)子狀態(tài)存在，由于假設(shè)基因組缺失這些基因，將使有機(jī)體致死〔所謂的致死因子，一個(gè)比較好的例子就是維生素D血漿結(jié)合蛋白的基因；在世界范圍內(nèi)的很多種族已覺(jué)察其廣泛的多態(tài)性，并且還沒(méi)有覺(jué)察基因活性的同源性喪失，因此，通過(guò)PCR共同擴(kuò)增這種基因的一個(gè)片段，在全部患者中均可獲得成功，并且也會(huì)證明擴(kuò)增反響是成功的。在測(cè)定血清／血漿病原體核酸如HBVDNA、HCVRNA等時(shí)，應(yīng)使用的弱陽(yáng)性血性。使用這些外加弱陽(yáng)性質(zhì)控不但可檢測(cè)擴(kuò)增反響液的質(zhì)量，還可獲得有關(guān)PCR檢測(cè)下限和〔即患者的標(biāo)本所使用的一樣的主反響混合液。假設(shè)疑心方法的檢測(cè)下限缺乏以檢測(cè)出產(chǎn)物時(shí)，則每一個(gè)反響管都必需加擴(kuò)增質(zhì)控。外加陰性質(zhì)控〔污染質(zhì)控〕在每一個(gè)PCR試驗(yàn)中都必需設(shè)有，應(yīng)當(dāng)包括幾種陰性質(zhì)控。PCR過(guò)程中污染消滅的階段。包括在樣品制備的整個(gè)過(guò)程中所〔所謂的模擬制備〕的反響管等。模擬質(zhì)援可以評(píng)估PCR試驗(yàn)的綜合質(zhì)量。它不能覺(jué)察樣本處理過(guò)程中的污染源