低血磷抗維生素d箍病即x連鎖低磷酸鹽血癥患者phex基因多態(tài)性檢測及致病性預(yù)測分析

低血磷抗維生素d箍病即x連鎖低磷酸鹽血癥患者phex基因多態(tài)性檢測及致病性預(yù)測分析

低血磷抗維生素dc，也稱為x-ligh-omim-som-som。這是一種常見的x-ligh-om遺傳改良，發(fā)病率約為1.20萬，女性患者多。本病臨床癥狀多樣,主要表現(xiàn)為身材矮小,骨骼疼痛,雙下肢彎曲畸形,骨軟化癥,骨質(zhì)疏松,四肢無力,牙釉質(zhì)發(fā)育不良。磷酸鹽調(diào)節(jié)基因(phosphateregulatinggenewithhomologiestoendopeptidasesontheXchromosome,PHEX;MIM#300550)定位于Xp22.1~22.2,其發(fā)生突變是引起該病的根本內(nèi)因,它可導(dǎo)致腎小管和腸道對磷的轉(zhuǎn)運異常和重吸收障礙,導(dǎo)致大量磷浪費,出現(xiàn)低磷酸鹽血癥,維生素D代謝異常,腸道對磷、鈣的吸收不良而影響骨質(zhì)鈣化,形成佝僂病。目前國內(nèi)對該病的研究多為病例報道,而基因診斷和新突變的鑒定等方面鮮見報道,我們近期對1例來自南方地區(qū)的XLH患者進(jìn)行了突變檢測及新突變的多方面鑒定,證實c.2197-2198insAACT插入突變不是一般的多態(tài)性變異,而極可能是一種新的致病性突變。同時,針對所檢突變類型建立了變性高效液相色譜(denaturinghigh-performanceliquidchromatography,DHPLC)快速檢測法,為今后開展快速產(chǎn)前診斷乃至植入前基因診斷都打下較好的基礎(chǔ)。對象和方法一、膝關(guān)節(jié)畸形骨折先證者:女,漢族,10歲,體重25kg,身高113.3cm。患者雙下肢無力伴骨骼畸形7年余,雙腿呈X型,左側(cè)股骨反復(fù)骨折已有兩年,雙下肢肌力下降、無力,需攙扶,雙脛骨呈弓狀畸形,雙手可見手鐲征。雙膝關(guān)節(jié)、右腕關(guān)節(jié)骨質(zhì)顯著疏松,左膝關(guān)節(jié)間隙寬,干骺端膨大,骨干纖細(xì),股骨、脛腓骨屈曲。正常對照:選擇108名無親緣關(guān)系且表型正常者為正常對照。二、實驗方法1.外周血靜脈血樣的制備取先證者及其家系成員和隨機采集的108名無親緣關(guān)系且表型正常的對照(其中男48名,女60名)的外周靜脈血各2~3ml,EDTA-K2抗凝,按我室常規(guī)方法制備DNA模板。2.引物的設(shè)計及條件PHEX基因共22個外顯子(exons),其中exons4、10、12、17、18、21、22七對引物,以NG_007563.1作為參考序列,利用PrimerPremier5.0軟件自行設(shè)計,7對引物的名稱、序列、擴(kuò)增產(chǎn)物長度、復(fù)性條件如表1所示。其余15個外顯子的引物序列參照文獻(xiàn),引物都交由北京華大基因公司(BGI)合成。3.phoc基因外顯子pcr擴(kuò)增反應(yīng)體系為30μl,含DNA模板1.5μl(約300ng),10×Taq緩沖液3μl,2mmol/LdNTPs3μl,上、下游引物(10μmol/L)各1μl,TaqDNA聚合酶2.5U(MBI公司),加ddH2O至30μl。在DNAThermalCycler儀(PE公司,美國)上完成PHEX基因22個外顯子的PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性90s,94℃變性40s,49~53℃退火40s,72℃延伸40s,循環(huán)35次,72℃繼續(xù)延伸5min,4℃保溫。取2.0μlPCR產(chǎn)物,用2%瓊脂糖微型凝膠檢測擴(kuò)增效果。然后將正常對照、先證者及其家系成員的PCR產(chǎn)物送北京華大基因公司(BGI)或上海英駿公司(InvitrogenCo.),用ABIPRISM3730型DNA序列自動分析儀完成測序。利用Chromas2.33和ClustalXV2.0軟件對測序結(jié)果進(jìn)行序列分析和比對。三、新突變的評估1.突變篩檢法phoc針對存在于exon22的c.2197-2198insAACT新突變,采用DHPLC快速篩檢法,以患女為陽性對照,108名正常人為陰性對照,對其PHEX基因同個外顯子進(jìn)行PCR擴(kuò)增,然后將待測PCR產(chǎn)物,95℃變性5min,自然降到室溫后上樣,用WAVE核酸片段分析系統(tǒng)D7000HPLC分析儀(TRANSGENOMIC公司)進(jìn)行突變篩檢。2.phex蛋白突變部位氨基酸半胱氨酸的結(jié)構(gòu)比對和保守性分析為了檢驗突變位點的氨基酸是否具有進(jìn)化上的保守性,我們用ClustalX(1.83)軟件對谷蛀蟲、鴨嘴獸、雞、斑胸草雀、小鼠、褐鼠、中國倉鼠、牛、野豬、大熊貓、家犬、馬、普通狨、猩猩和人15個具有代表性的物種的PHEX蛋白突變部位氨基酸(半胱氨酸)的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行序列相似性比對和保守性分析,以期揭示該部位是否高度保守還是一般保守或不保守。3.正常蛋白質(zhì)與突變蛋白的二級和三級結(jié)構(gòu)的比較方法方法和原理參照文獻(xiàn)。結(jié)果一、結(jié)果測量二、綜合dhsc檢驗結(jié)果將患女和1名正常對照的exon22的PCR產(chǎn)物行DHPLC檢測,結(jié)果見圖2,單峰表示正常,雙峰表示突變。三、新突變的評估1.多態(tài)性突變的排除108名無親緣關(guān)系的正常對照經(jīng)DHPLC篩檢后,均為單峰,與正常陰性對照的峰形一樣,說明沒有此突變,同時也說明此突變不是多態(tài)性。2.般氨基酸突變從圖3可見PHEX基因的第733位的氨基酸C(半胱氨酸)及其后的多數(shù)氨基酸在15個不同的物種中都是高度保守的,說明這些氨基酸都具有重要的生物化學(xué)功能,因此,一旦發(fā)生突變就有可能導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)和功能的異常,從而導(dǎo)致XLH的發(fā)生。由此可以推斷,這個新突變很可能就是致病性突變。3.級、三級結(jié)構(gòu)變化二級結(jié)構(gòu)比對見圖4,三級結(jié)構(gòu)比對見圖5。從圖4,圖5中可以看到突變多肽的二級、三級結(jié)構(gòu)都有明顯的改變,圖5中的紅色箭頭示正常多肽中突變部位所在17個氨基酸的結(jié)構(gòu),說明c.2197-2198insAACT突變極可能是一種新的致病性突變。phoc基因突變XLH的遺傳方式多為X連鎖顯性遺傳,女性患者多為雜合子,由于正常等位基因可進(jìn)行功能性補償,所以病情較男性輕。但據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)報道,有些部分突變的攜帶者并不發(fā)病或遲發(fā)病,提示對該病的全部家庭成員進(jìn)行基因篩查是十分必要的。PHEXcDNA全長已經(jīng)被克隆,其編碼區(qū)為2247bp,含22個外顯子,編碼一條749個氨基酸的蛋白質(zhì),該蛋白與鋅金屬內(nèi)肽酶的M13家族高度同源。此家族包括中性內(nèi)肽酶、Kell抗原及內(nèi)皮素轉(zhuǎn)換酶1等,它的結(jié)構(gòu)特點是由一個較短的N-末端細(xì)胞質(zhì)區(qū)域、單個的跨膜疏水區(qū)域和較大的細(xì)胞外區(qū)域構(gòu)成,此細(xì)胞外區(qū)域包含10個高度保守的半胱氨酸殘基和一個鋅結(jié)合基序。PHEX蛋白主要在成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和成牙本質(zhì)細(xì)胞中表達(dá),在腎臟中并不表達(dá)。。PHEX基因突變主要集中在該基因的3′端一側(cè)(從exon14到exon22),表明這一區(qū)域是編碼PHEX蛋白質(zhì)的關(guān)鍵區(qū)域。其中第22外顯子為突變熱區(qū),該區(qū)域中已報道的突變類型超過18種(V717D、G719C、A720T、F731Y、C733S、C733R、C733X、C746X、C746W、R747X、W749R、W749S、c.2162insCCCT、c.2160-2175del、c.2171-2172delTT、c.2171-2172insAACT、c.2168dupA、c.2164-2197del/ins等),以錯義突變?yōu)橹?突變R747X為第22外顯子上的突變熱點,在西班牙、波蘭、德國、韓國、阿拉伯等人群中都有報道,但在中國人群中至今未見報道;數(shù)據(jù)庫中中國人群在PHEX基因第22外顯子上的突變僅報道一種突變C733Y。本研究發(fā)現(xiàn)的插入突變c.2197-2198insAACT為國際首報的新突變,為中國人群在PHEX基因22外顯子上發(fā)現(xiàn)的第二個致病性突變,本突變的報道進(jìn)一步豐富了人類PHEX基因突變數(shù)據(jù)庫的種類。經(jīng)分析,該突變導(dǎo)致第733密碼子TGT變成終止密碼TAA,使多肽鏈合成提前終止,表達(dá)出無功能或功能異常的、截短的PHEX蛋白。先證者病情較嚴(yán)重,提示移碼突變產(chǎn)生的截短蛋白會導(dǎo)致嚴(yán)重的表型。通過DNA序列分析發(fā)現(xiàn)在插入突變位點前端存在AACT與插入的AACT正好相同,產(chǎn)生了4個堿基的重復(fù)。我們推測可能是因為重復(fù)序列導(dǎo)致減數(shù)分裂的偏差或復(fù)制錯配而導(dǎo)致該病的發(fā)生,具體機制還有待進(jìn)一步研究。DHPLC技術(shù)具有靈敏度高,特異性強,自動化程度高,成本低廉,可快速、大量篩檢未知樣品等優(yōu)點,因此應(yīng)用