微生物的遺傳變異

第六章微生物的遺傳變異與菌種選育第一節(jié)微生物遺傳變異的物質(zhì)根底第二節(jié)微生物的基因突變第三節(jié)微生物的基因重組質(zhì)第四節(jié)微生物的菌種選育第五節(jié)微生物菌種的保藏和復(fù)壯第一節(jié)微生物遺傳變異的物質(zhì)根底種質(zhì)延續(xù)實(shí)際：1883~1889年間Weissmann提出。以為遺傳物質(zhì)是一種具有特定分子構(gòu)造的化合物?；?qū)W說(shuō)：二十世紀(jì)初發(fā)現(xiàn)了染色體并提出基因?qū)W說(shuō)，使得遺傳物質(zhì)根底的范圍減少到染色體上。染色體由核酸和蛋白質(zhì)兩種長(zhǎng)鏈高分子組成。20多種氨基酸經(jīng)過(guò)不同陳列組合，可以演化出的蛋白質(zhì)數(shù)目幾乎可以到達(dá)一個(gè)天文數(shù)字，而核酸的組成卻簡(jiǎn)單得多，普通僅由4種不同的核苷酸組成，它們經(jīng)過(guò)陳列組合只能產(chǎn)生較少種類的核酸，因此當(dāng)時(shí)以為決議生物遺傳型的染色體和基因，起活性成分是蛋白質(zhì)。DNA是遺傳變異的物質(zhì)根底的證明：1944年以后，利用微生物為實(shí)驗(yàn)對(duì)象進(jìn)展的三個(gè)著名實(shí)驗(yàn)〔肺炎球菌的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)、噬菌體感染實(shí)驗(yàn)、病毒的拆開與重建實(shí)驗(yàn)〕1928年，Griffith進(jìn)展了以下幾組實(shí)驗(yàn)：〔1〕動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

對(duì)小鼠注射活R菌或死S菌————小鼠存活

對(duì)小鼠注射活S菌————————小鼠死亡

對(duì)小鼠注射活R菌和熱死S菌———小鼠死亡抽取心血分別活的S菌

一、證明核酸是遺傳變異物質(zhì)根底的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)〔一〕肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)〔transformation〕：F.Griffith，研討對(duì)象：Streptococcuspneumoniae〔肺炎雙球菌〕S型菌株：有致病性，菌落外表光滑，有莢膜R型菌株：無(wú)致病性，菌落外表粗糙，無(wú)莢膜〔2〕細(xì)菌培育實(shí)驗(yàn)

熱死S菌—————不生長(zhǎng)

活R菌—————長(zhǎng)出R菌

熱死S菌+活R菌—————長(zhǎng)出大量R菌和10-6S菌〔3〕S型菌的無(wú)細(xì)胞抽提液實(shí)驗(yàn)

活R菌+S菌無(wú)細(xì)胞抽提液————長(zhǎng)出大量R菌和少量S菌以上實(shí)驗(yàn)闡明：加熱殺死的S型細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)能夠存在一種轉(zhuǎn)化物質(zhì)，它能經(jīng)過(guò)某種方式進(jìn)入R型細(xì)胞并使R型細(xì)胞獲得穩(wěn)定的遺傳性狀①加S菌DNA②加S菌DNA及DNA酶以外的酶③加S菌的DNA和DNA酶④加S菌的RNA⑤加S菌的蛋白質(zhì)⑥加S菌的莢膜多糖活R菌長(zhǎng)出S菌只需R菌1944年O.T.Avery、C.M.MacLeod和M。McCarty從熱死S型S.pneumoniae中提純了能夠作為轉(zhuǎn)化因子的各種成分，在離體條件下進(jìn)展了轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)：只需S型細(xì)菌的DNA才干將S.Pneumoniae的R型轉(zhuǎn)化為S型。且DNA純度越高，轉(zhuǎn)化效率也越高。闡明S型菌株轉(zhuǎn)移給R型菌株的，是遺傳因子?！捕呈删w的感染實(shí)驗(yàn)A.D.Hershey和M.Chase，1952年〔1〕含32P-DNA的一組：放射性85%在沉淀中〔2〕含35S-蛋白質(zhì)的一組：放射性75%在上清液中所以，進(jìn)入細(xì)胞的是噬菌體的核酸而不是蛋白質(zhì)?！踩碂煵莼ㄈ~病毒的拆開與重組實(shí)驗(yàn)為了證明核酸是遺傳物質(zhì)，H.Fraenkel-Conrat〔1956〕用含RNA的煙草花葉病毒〔TMV〕進(jìn)展了著名的植物病毒重建實(shí)驗(yàn)。將TMV在一定濃度的苯酚溶液中振蕩，就能將其蛋白質(zhì)外殼與RNA中心相分別。分別后的RNA在沒(méi)有蛋白質(zhì)包裹的情況下，也能感染煙草并使其患典型病癥，而且在病斑中還能分別出正常病毒粒子。選用TMV和霍氏車前花葉病毒〔HRV〕，分別拆分獲得各自的RNA和蛋白質(zhì)，將兩種RNA分別與對(duì)方的蛋白質(zhì)外殼重建構(gòu)成兩種雜合病毒：〔1〕RNA〔TMV〕-蛋白質(zhì)〔HRV〕〔2〕RNA〔HRV〕-蛋白質(zhì)〔TMV〕用兩種雜合病毒感染寄主：〔1〕表現(xiàn)TMV的典型病癥病分別到正常TMV粒子〔2〕表現(xiàn)HRV的典型病癥病分別到正常HRV粒子。上述結(jié)果闡明，在RNA病毒中，遺傳的物質(zhì)根底也是核酸。二、遺傳物質(zhì)在細(xì)胞中的存在方式

1.細(xì)胞程度

2.亞細(xì)胞核程度3.分子程度一、基因突變基因突變〔genemutation〕簡(jiǎn)稱突變，是變異的一種，指生物體內(nèi)遺傳物質(zhì)的分子構(gòu)造或數(shù)量忽然發(fā)生的可遺傳的變化。突變率常在10-8~10-9范圍內(nèi)。第二節(jié)微生物的基因突變

突變株的表型 成因 檢出方法營(yíng)養(yǎng)缺陷型因突變而喪失合成一 補(bǔ)充培育基〔auxotroph〕種或幾種生長(zhǎng)因子的 才干不能在根本培育 基上生長(zhǎng)突變株抗性突變型因突變而產(chǎn)生了對(duì)某 藥物培育基〔resistantmutant〕種化學(xué)藥物或致死 物理因子的抗性條件致死型突變后在某種條件下培育條件改動(dòng)〔conditional可正常生長(zhǎng)、繁衍并lethalmutant〕實(shí)現(xiàn)其表型，而在另 一條件下卻無(wú)法生長(zhǎng) 繁衍的突變型一、基因突變的類型突變株的表型 成因檢出方法形狀突變型因突變而產(chǎn)生的個(gè)體形狀Morphologycal或菌落形狀的非選擇〔常用顏色變化〕mutant 性變異 抗原突變型因突變而引起的抗原借助于抗原antigenic構(gòu)造發(fā)生改動(dòng)抗體反響mutant 其它突變型：毒力、糖發(fā)酵才干、代謝產(chǎn)物等 二、突變的特點(diǎn)

1.不對(duì)應(yīng)性：突變的性狀與突變緣由之間無(wú)直接的對(duì)應(yīng)關(guān)系。

〔變量實(shí)驗(yàn)、涂布實(shí)驗(yàn)、平板影印培育實(shí)驗(yàn)〕

2.自發(fā)性：突變可以在沒(méi)有人為誘變要素處置下自發(fā)地產(chǎn)生。

3.稀有性：突變率低且穩(wěn)定。

4.獨(dú)立性：各種突變獨(dú)立發(fā)生，不會(huì)相互影響。

5.可誘發(fā)性：誘變劑可提高突變率。

6.穩(wěn)定性：變異性狀穩(wěn)定可遺傳。

7.可逆性：原始的野生基因到變異株的突變稱為正向突變〔forwardmutation〕，相反的過(guò)程那么稱為回復(fù)突變或回變〔backmutation或reversemutation〕。.誘發(fā)突變的機(jī)制 誘變劑〔mutagen〕：凡能提高突變率的任何理化因子，誘變劑的種類很多，作用方式多樣。即使是同一種誘變劑，也常有不同的作用方式。三、基因突變的機(jī)制堿基置換〔substitution〕定義：對(duì)DNA來(lái)說(shuō)，堿基的置換屬于一種染色體的微小損傷〔microlesion〕，普通也稱點(diǎn)突變〔pointmutation〕。它只涉及一對(duì)堿基被另一對(duì)堿基所置換。分類：轉(zhuǎn)換〔transition〕，即DNA鏈中的一個(gè)嘌呤被另一個(gè)嘌呤或是一個(gè)嘧啶被另一個(gè)嘧啶所置換；顛換〔transversion〕，即一個(gè)嘌呤被另一個(gè)嘧啶或是一個(gè)嘧啶被另一個(gè)嘌呤所置換。對(duì)某一詳細(xì)誘變劑來(lái)說(shuō)，可同時(shí)引起轉(zhuǎn)換與顛換，也可只具其中的一種功能。根據(jù)化學(xué)誘變劑是直接還是間接地引起置換，可把置換的機(jī)制分成以下兩類來(lái)討論。直接引起置換的誘變劑一類可直接與核酸的堿基發(fā)生化學(xué)反響的誘變劑，例如亞硝酸、羥胺和各種烷化劑〔硫酸二乙酯，甲基磺酸乙酯，N-甲基-N’硝基-N-亞硝基胍，N-甲基-N-亞硝基脲，乙烯亞胺，環(huán)氧乙酸，氮芥等〕。它們可與一個(gè)或幾個(gè)核苷酸發(fā)生化學(xué)反響，從而引起DNA復(fù)制時(shí)堿基配對(duì)的轉(zhuǎn)換，并進(jìn)一步使微生物發(fā)生變異。在這些誘變劑中，除羥胺只引起G┇C→A：T外，其他都是可使G┇CA：T發(fā)生互變的。能引起顛換的誘變劑很少，只是部分烷化劑才有。

移碼突變移碼突變〔frame-shiftmutation〕指誘變劑使DNA分子中的一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)核苷酸的增添〔插入〕或缺失，從而使該部位后面的全部遺傳密碼發(fā)生轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯錯(cuò)誤的一類突變。由移碼突變所產(chǎn)生的突變株，稱為移碼突變株〔frameshiftmutant〕。與染色體畸變相比，移碼突變也只能算是DNA分子的微小損傷。

丫啶類染料，如丫啶黃、丫啶橙和α-氨基丫啶等，都是移碼突變的有效誘變劑。丫啶類化合物的誘變機(jī)制至今還不很清楚。有人以為，由于它們是一種平面型三環(huán)分子，構(gòu)造與一個(gè)嘌呤–嘧啶對(duì)非常類似，故能嵌入兩個(gè)相鄰DNA堿基對(duì)之間，呵斥雙螺旋的部分解開〔兩個(gè)堿基對(duì)原來(lái)相距0.34nm，當(dāng)嵌入一個(gè)丫啶分子時(shí)，就變成0.68nm〕，從而在DNA復(fù)制過(guò)程中，會(huì)使鏈上增添或缺失一個(gè)堿基，結(jié)果就引起了移碼突變。染色體畸變〔chromosomalaberration〕某些理化因子，如X射線等的輻射及烷化劑、亞硝酸等，除了能引起點(diǎn)突變外，還會(huì)引起DNA的大損傷〔macrolesion〕——染色體畸變，包括以下兩個(gè)方面：染色體構(gòu)造上的缺失〔deletion〕、反復(fù)〔duplication〕、易位〔translocation〕和倒位〔inversion〕染色體數(shù)目的變化。染色體構(gòu)造上的變化染色體內(nèi)畸變只涉及一條染色體上的變化，如發(fā)生染色體的部分缺失或反復(fù)時(shí)，其結(jié)果可呵斥基因的減少或添加；又如發(fā)生倒位或易位時(shí)，那么可呵斥基因陳列順序的改動(dòng)，但數(shù)目卻不改動(dòng)。倒位是指斷裂下來(lái)的DNA片段旋轉(zhuǎn)180°后，重新插入到原來(lái)染色體的位置上；易位那么指斷裂下來(lái)的一小段染色體再順向或逆向地插入到同一條染色體的其它部位上。染色體間畸變，那么指非同源染色體間的易位。紫外線〔U.V.，ultravioletray〕對(duì)DNA的損傷嘧啶對(duì)紫外線的敏感性要比嘌呤強(qiáng)得多。嘧啶的光化產(chǎn)物主要是二聚體和水合物，其中了解較清楚的是胸腺嘧啶二聚體的構(gòu)成和消除。

紫外線的主要作用是使同鏈DNA的相鄰胸腺嘧啶間構(gòu)成共價(jià)結(jié)合的胸腺嘧啶二聚體，它的出現(xiàn)會(huì)減弱雙鏈間氫鍵的作用，并引起雙鏈構(gòu)造扭曲變形，妨礙堿基間的正常配對(duì)，從而引起突變或死亡。在互補(bǔ)雙鏈間構(gòu)成嘧啶二聚體的時(shí)機(jī)較少，但一旦構(gòu)成，就會(huì)妨礙雙鏈的解開，因此影響DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，并使細(xì)胞死亡。.本身突變的機(jī)制 背景輻射和環(huán)境中多要素低劑量的誘變效應(yīng)微生物本身代謝產(chǎn)物的誘變效應(yīng)互變異構(gòu)效應(yīng)環(huán)狀突出效應(yīng)第三節(jié)微生物的基因重組基因組：細(xì)胞中基因以及非基因的DNA序列的總稱，包括構(gòu)造基因、調(diào)控序列以及目前功能未知的DNA序列。

一、原核生物的基因重組嚴(yán)密纏繞的環(huán)狀雙鏈DNA分子遺傳信息的延續(xù)性功能相關(guān)的構(gòu)造基因組成支配子構(gòu)造構(gòu)造基因的單拷貝及rRNA基因的多拷貝基因組的反復(fù)序列少而短二、真核生物的基因重組DNA與組蛋白構(gòu)成染色體有間隔子或內(nèi)含子序列沒(méi)有明顯的支配子構(gòu)造含有一定數(shù)量的反復(fù)序列〔低度、中度和高度反復(fù)〕遺傳豐余：較高同源性的DNA反復(fù)序列第四節(jié)微生物的菌種選育在微生物工業(yè)運(yùn)用中，微生物菌種任務(wù)主要包括以下四方面：①菌種的分別挑選：挑選符合消費(fèi)要求的菌種，這是選種任務(wù)的義務(wù)。②菌種培育：改良已有菌種的消費(fèi)性能，使產(chǎn)品的質(zhì)和量不斷提高，或使它更順應(yīng)于工藝的要求，這是育種任務(wù)的義務(wù)。③菌種的保藏：一切消費(fèi)菌種都要使它防止死亡和消費(fèi)性能的下降，這是菌種保藏任務(wù)的義務(wù)。④退化菌種的復(fù)壯：假設(shè)發(fā)現(xiàn)菌種的消費(fèi)性能下降，就要設(shè)法使它恢復(fù)，這便是菌種復(fù)壯任務(wù)的義務(wù)。一、從自然界中分別挑選菌種的方法步驟采樣增殖培育純種分別純培育消費(fèi)性能測(cè)定方法、地點(diǎn)、時(shí)間和周圍環(huán)境記錄純種分別的原那么就是使培育物獲得單個(gè)菌落：1．稀釋分別法2．平板劃線分別法⑴涂菌：⑵劃線分別：①分步劃線法；②一次劃線法：3．組織分別法測(cè)定代謝產(chǎn)物或其它目的性狀〔一〕誘變育種的普通步驟和方法

出發(fā)菌株

同步培育

使菌細(xì)胞處于一樣或接近的生理形狀

單細(xì)胞〔或單孢子〕菌懸液的制備

單細(xì)胞或單孢子的意義

酵母或霉菌孢子106/ml、細(xì)菌108/ml

誘變劑的選擇及其劑量確實(shí)定

以致死率為90％～99％為宜

誘變處置

①物理誘變劑

②化學(xué)誘變劑

確定出發(fā)菌株↓菌種的純化選優(yōu)↓←出發(fā)菌株的性能鑒定同步培育↓制備單細(xì)胞〔或單孢子〕懸液↓←活菌濃度測(cè)定誘變劑的選擇與確定誘變劑量的預(yù)實(shí)驗(yàn)↓誘變處置↓平板分別↓計(jì)形狀變異的菌落數(shù)，計(jì)算突變率挑取疑似突變菌落純培育↓突變體的初步挑選↓←用簡(jiǎn)單快捷的方法反復(fù)挑選↓←搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)選出突變體〔根據(jù)情況進(jìn)展消費(fèi)實(shí)驗(yàn)或反復(fù)誘變處置〕二、微生物的誘變育種二、微生物的誘變育種〔二〕變異菌株的初步挑選紙片培育顯色法透明圈法瓊脂塊培育法1挑選用培育基⑴根本培育基：凡是能滿足某種野生型菌株?duì)I養(yǎng)要求的最低成分的合成培育基，稱為根本培育基；常以‘[-]’表示；⑵在根本培育基中參與一些富含氨基酸、維生素及含氮堿基之類的天然有機(jī)物質(zhì)如蛋白胨、酵母膏等，以滿足該微生物的各種營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株都能生長(zhǎng)繁衍的培育基，稱為完全培育基，常用‘[+]’表示；⑶在根本培育基中只是有針對(duì)性地參與某一種或某幾種營(yíng)養(yǎng)缺陷成分，以滿足相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)缺陷型生長(zhǎng)的培育基，稱為補(bǔ)充培育基，補(bǔ)充培育基可按所參與營(yíng)養(yǎng)成分相應(yīng)地用‘[A]’、‘[B]’等來(lái)表示?！踩碃I(yíng)養(yǎng)缺陷型突變體的挑選及其運(yùn)用二、微生物的誘變育種2．營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株挑選的普通方法〔1〕誘變劑處置〔2〕淘汰野生型菌株①抗生素法②菌絲過(guò)濾法〔3〕檢出營(yíng)養(yǎng)缺陷型〔4〕鑒定營(yíng)養(yǎng)缺陷型檢出營(yíng)養(yǎng)缺陷型①夾層培育法②限量補(bǔ)充培育法③影印接種法④逐個(gè)檢出法鑒定營(yíng)養(yǎng)缺陷型①含營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的根本培育基平板的制備。②營(yíng)養(yǎng)缺陷型營(yíng)養(yǎng)類別的鑒定。③缺陷型菌株單一營(yíng)養(yǎng)要素的鑒定。

第一組第二組第三組第四組第五組第六組第七組第八組第九組丙氨酸谷氨酸亮氨酸絲氨酸精氨酸谷氨酰氨賴氨酸蘇氨酸天冬酰氨甘氨酸蛋氨酸色氨酸天冬氨酸組氨酸苯丙氨酸酪氨酸半胱氨酸異亮氨酸脯氨酸

纈氨酸原生質(zhì)體交融育種細(xì)胞〔A+B—〕細(xì)胞〔A—B+〕脫壁處置脫壁處置原生質(zhì)體〔A+B—〕原生質(zhì)體〔A—B+〕混合

加交融劑原生質(zhì)體交融涂平板〔原生質(zhì)體再生〕構(gòu)成菌落

檢出重組子菌落〔A+B+〕轉(zhuǎn)基因工程菌株的構(gòu)建1．提取目的基因用密度梯度離心方法分別從供體細(xì)胞中提取所需求的DNA即目的基因和作為載體的細(xì)菌質(zhì)?；蚴删w核酸，目的基因也可經(jīng)過(guò)化學(xué)方法人工合成。2．處置目的基因根據(jù)基因工程的“設(shè)計(jì)藍(lán)圖〞的要求，在從供體細(xì)胞中提取出的目的基因中參與專注性很強(qiáng)的限制性核酸內(nèi)切酶進(jìn)展處置，從而獲得帶有特定基因并暴顯露粘性末端的DNA單鏈部分。必要時(shí)這種粘性末端也可用人工方法合成。對(duì)作為載體的細(xì)菌質(zhì)?；蚴删wDNA可采用與處置目的基因同一種類的限制性核酸內(nèi)切酶進(jìn)展處置，使其構(gòu)成并暴顯露與目的基因相應(yīng)的粘性末端。3．體外重組將上述分別處置過(guò)的目的基因和細(xì)菌質(zhì)粒DNA片段〔或噬菌體核酸〕放在試管中，在較低溫度〔5～6℃〕下混合“退火〞。由于這兩種DNA是用同一種限制性核酸內(nèi)切酶進(jìn)展處置，具有一樣的粘性末端，因此相互之間可以構(gòu)成氫鍵，這就是所謂“退火〞。而相鄰的核苷酸，在DNA銜接酶的作用下也能構(gòu)成磷酸二酯鍵，這樣就完成了目的基因與質(zhì)粒DNA〔或噬菌體DNA〕的重組，得到的是一個(gè)完好的具有復(fù)制才干的環(huán)狀DNA重組體，即“雜種質(zhì)粒〞〔或雜種噬菌體〕。4．載體傳送即經(jīng)過(guò)載體將供體生物中的遺傳基因?qū)氲绞荏w細(xì)胞內(nèi)。載體必需具