微生物指標(biāo)及微生物檢驗(yàn)課件

生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GB5749-2006生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法GB5750-2006微生物指標(biāo)及微生物檢驗(yàn)的介紹廣東省CDC微生物檢驗(yàn)所嚴(yán)紀(jì)文我國舊的飲用水水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)是1985年頒布實(shí)施的GB5749-85，標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法為GB5750-85。該標(biāo)準(zhǔn)與國外的飲用水標(biāo)準(zhǔn)相比，主要差別在于微生物指標(biāo)項(xiàng)目少，缺少有機(jī)物和消毒副產(chǎn)物指標(biāo)。微生物指標(biāo)只有細(xì)菌總數(shù)和總大腸菌群2項(xiàng)，不能確切的評(píng)價(jià)水質(zhì)的衛(wèi)生狀況。修訂后的標(biāo)準(zhǔn)，微生物學(xué)指標(biāo)增加為6項(xiàng)：菌落總數(shù)、總大腸菌群、耐熱大腸菌群、大腸埃希氏菌、賈第鞭毛蟲和隱孢子蟲。同時(shí)在資料性附件中增加了腸球菌和產(chǎn)氣莢膜梭狀芽胞桿菌。水質(zhì)常規(guī)指標(biāo)及限值修訂前修訂后微生物指標(biāo)限值微生物指標(biāo)限值細(xì)菌總數(shù)100CFU/mL菌落總數(shù)/（CFU/mL）100總大腸菌群每100mL水樣中不得檢出總大腸菌/（MPN/100mL或CFU/100mL）不得檢出糞大腸菌群每100mL水樣中不得檢出耐熱大腸菌/（MPN/100mL或CFU/100mL）不得檢出游離余氯在與水接觸30min后應(yīng)不低于0.3mg/L,管梢末水不應(yīng)低于0.5mg/L大腸埃希氏菌/（MPN/100mL或CFU/100mL）不得檢出水質(zhì)非常規(guī)指標(biāo)及限值修訂前修訂后微生物指標(biāo)限值微生物指標(biāo)限值-菌落總數(shù)/（CFU/100mL）500小型集中式供水和分散式供水部分水質(zhì)指標(biāo)及限值修訂前修訂后微生物指標(biāo)限值微生物指標(biāo)限值-賈第鞭毛蟲/（個(gè)/10L）<1-隱孢子蟲/（個(gè)/10L）<1生活飲用水水質(zhì)參考指標(biāo)及限值修訂前修訂后微生物指標(biāo)限值微生物指標(biāo)限值-腸球菌/（CFU/100mL）0-產(chǎn)氣莢膜梭狀芽胞桿/（CFU/100mL）0一、菌落總數(shù)修訂前修訂后細(xì)菌總數(shù)原理：細(xì)菌總數(shù)是指水樣在一定條件下培養(yǎng)后（培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)溫度和時(shí)間、pH、需氧性質(zhì)等）所得1ml水樣所含菌落的總數(shù)。按本規(guī)范規(guī)定所得結(jié)果只包括一群能在營養(yǎng)瓊脂上發(fā)育的嗜中溫的需氧的細(xì)菌菌落總數(shù)培養(yǎng)條件：36±1℃24h

菌落總數(shù)定義：水樣在營養(yǎng)瓊脂上有氧條件下37℃培養(yǎng)48h后，所得1ml水樣所含菌落的總數(shù)。36±1℃48h酶底物法酶底物法定義：總大腸菌群酶底物法是指在選擇性培養(yǎng)基上能產(chǎn)生β-半乳糖苷酶的細(xì)菌群組，該細(xì)菌群組能分解色原底物釋放出色原體使培養(yǎng)基呈現(xiàn)顏色變化，以此技術(shù)來檢測(cè)水中總大腸菌群的方法。培養(yǎng)基：MMO-MUG培養(yǎng)基（MinimalMediumONPG-MUG）。本方法可分為定性和定量。定量法：10管法、51孔定量法

培養(yǎng)條件：36±1℃24h

能產(chǎn)生β-半乳糖苷酶的細(xì)菌群組分解ONPG使培養(yǎng)基呈黃色酶底物法的主要特點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：可同時(shí)判斷水樣中大腸菌群和大腸埃希氏菌檢測(cè)時(shí)間較短，只需18-24h，最長(zhǎng)需要28h無需確證試驗(yàn)操作簡(jiǎn)單，對(duì)試驗(yàn)條件和人員要求低缺點(diǎn)：檢測(cè)成本高總大腸菌群三種方法的比較多管發(fā)酵法濾膜法酶底物法時(shí)間24-72h24-48h24-28h驗(yàn)證試驗(yàn)需要需要不需要步驟較繁較簡(jiǎn)便簡(jiǎn)便特殊設(shè)備顯微鏡顯微鏡、過濾設(shè)備壓膜機(jī)價(jià)格低低較高三、耐熱大腸菌群（埃希氏菌屬、耐熱克雷伯氏菌）檢測(cè)方法：多管發(fā)酵法、濾膜法修訂前修訂后原理：用提高培養(yǎng)溫度的方法將自然環(huán)境中的大腸菌群與糞便中大腸菌群區(qū)分開，在44.5℃仍能生長(zhǎng)的大腸菌群,稱為糞大腸菌群。

定義：用提高培養(yǎng)溫度的方法將自然環(huán)境中的大腸菌群與糞便中大腸菌群區(qū)分開，在44.5℃仍能生長(zhǎng)的大腸菌群,稱為耐熱大腸菌群。

四、大腸埃希氏菌檢測(cè)方法：多管發(fā)酵法、濾膜法、酶底物法大腸埃希氏菌多管發(fā)酵法定義：大腸埃希氏菌是指多管發(fā)酵法總大腸菌群陽性，在含有熒光底物的培養(yǎng)基上44.5℃培養(yǎng)24h產(chǎn)生β-葡萄糖酫酸酶，分解熒光底物釋放出熒光產(chǎn)物，使培養(yǎng)基在紫外光下產(chǎn)生特征性熒光的細(xì)菌，以此來檢測(cè)水中大腸埃希氏菌的方法。培養(yǎng)基：EC-MUG（4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖酫酸苷）。培養(yǎng)條件：44.5±0.5℃培養(yǎng)24±2h。紫外燈：波長(zhǎng)366nm，功率6W大腸桿菌能產(chǎn)生β-葡萄糖酫酸酶分解MUG，菌落在366nm紫外光下產(chǎn)生藍(lán)色熒光濾膜法定義：用濾膜法檢測(cè)水樣后，將總大腸菌群陽性的濾膜在含有熒光底物的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，能產(chǎn)生β-葡萄糖酫酸酶分解熒光底物釋放出熒光產(chǎn)物，使菌落能夠在紫外光下產(chǎn)生特征性熒光，以此來檢測(cè)水中大腸埃希氏菌的方法。培養(yǎng)基：NA-MUG培養(yǎng)條件：36±1℃培養(yǎng)4h紫外燈：波長(zhǎng)366nm，功率6W酶底物法定義：在選擇培養(yǎng)基上能產(chǎn)生β-半乳糖苷酶分解色原底物釋放出色原體使培養(yǎng)基呈現(xiàn)顏色變化，并能產(chǎn)生β-葡萄糖酫酸酶分解熒光底物釋放出熒光產(chǎn)物，使菌落能夠在紫外光下產(chǎn)生特征性熒光，以此技術(shù)來檢測(cè)大腸埃希氏菌的方法為大腸埃希氏菌酶底物法。培養(yǎng)基：ONPG-MUG結(jié)果判定：水樣變黃色同時(shí)在366nm的紫外光下產(chǎn)生藍(lán)色熒光為陽性。水樣未變黃色而有藍(lán)色熒光產(chǎn)生不能判定為陽性。五、賈第鞭毛蟲子和隱孢子蟲賈第鞭毛蟲和隱孢子蟲是一類寄生于人和動(dòng)物體內(nèi)的腸道原蟲，可致人獸共患病。患此病的人和動(dòng)物從糞便中排出大量的卵(孢)囊污染環(huán)境，在地面水和防護(hù)差的地下水及處理不良的自來水中都可檢出卵(孢)囊。隨著社會(huì)發(fā)展，優(yōu)質(zhì)供水勢(shì)在必行。對(duì)一些潛在的危險(xiǎn)因素加以限制很有必要。在此基礎(chǔ)上，新標(biāo)準(zhǔn)中增加了賈第鞭毛蟲和隱孢子蟲的檢測(cè)方法。Cryptosporidium隱孢子蟲特點(diǎn):單一細(xì)胞原生動(dòng)物，約3-7m。有微小隱孢子蟲、鼠隱孢子蟲和貝氏隱孢子蟲三種，寄生于人、牛等體內(nèi)的主要為微小隱孢子蟲（C．parvum）。宿主：人類、鳥類、鼠類、爬行類、魚類感染源:隱孢子蟲主要寄生在被感染的動(dòng)物體腸道內(nèi)，卵囊通過糞便排出體外污染環(huán)境。易感人群：免疫缺陷者（如愛滋患者）、兒童、老人、醫(yī)務(wù)人員等傳播方式:以糞-口，手-口途徑為主，污染的水源和空氣均可傳播。Cryptosporidium隱孢子蟲生活周期子孢子滋養(yǎng)體Ⅰ型裂殖體裂殖子Ⅱ型裂殖體雌、雄配子體合子成熟卵囊裂殖子Cryptosporidium隱孢子蟲(染色后熒光顯微鏡下)特點(diǎn):單一細(xì)胞原生動(dòng)物，大小約10-15m，含4對(duì)鞭毛和雙核。人、動(dòng)物共染。寄生人體內(nèi)為藍(lán)氏賈第鞭毛蟲Giardia

lamblia。在不同溫度和緯度地區(qū)均能發(fā)現(xiàn)該??；發(fā)達(dá)國家感染率為2-5%；發(fā)展中國家感染率可高達(dá)到20-30%?？梢鸺甭愿篂a、腸吸收紊亂及延緩兒童的生長(zhǎng)發(fā)育。傳染源：被孢囊污染的水和食物；往往一人帶孢囊全家感染；傳播:通過被污染的水和食物經(jīng)口傳播；接觸（往往一人帶孢囊全家感染）；娛樂用水；旅游。易感人群：3歲以內(nèi)嬰兒；免疫功能受損害者；旅游者。Giardia賈第鞭毛蟲重要的動(dòng)物宿主賈第鞭毛蟲在自然界廣泛存在，包括兩棲動(dòng)物；鳥類；哺乳動(dòng)物在內(nèi)的40多種動(dòng)物均可成為賈第鞭毛蟲的宿主。調(diào)查表明，人排出孢囊可使狗、海貍、麝鼠、沙土鼠及大鼠等動(dòng)物感染。一些生活在水中的動(dòng)物可被來源于人的賈第鞭毛蟲孢囊感染，因此這些動(dòng)物即使不是主要宿主也可能作為賈第鞭蟲的傳播媒介。Giardia賈第鞭毛蟲兩蟲感染的特點(diǎn)賈第氏鞭毛蟲(Giardia)/隱孢子蟲(Cryptosporidium)/感染后無特殊臨床癥狀,無預(yù)防疫苗，絕大多數(shù)抗生素?zé)o效，治療依賴于自身抵抗力大部份作為源水的江河及水庫水等地表水是高危的,大部分地下水都有被地表水污染的潛在危險(xiǎn)可以通過被污染的源水而進(jìn)入供水系統(tǒng),水源性感染已成為最大的感染源，但孢/卵囊對(duì)傳統(tǒng)的水處理法中氯化消毒有抗性,氯不能滲透過卵囊，沙濾及膜過濾法也不能完全去除

飲用水高溫煮沸也并非有效對(duì)氯消毒耐受、對(duì)熱敏感、感染劑量低、感染率高隱孢子蟲感染案例

1993年在美國威斯康星州的東南部港口城市密爾沃基暴發(fā)400,000人被Cryptosporidium感染，4,000人到醫(yī)院就醫(yī)，60人死亡。調(diào)查顯示致病源為處理不慎的飲用水。

1996年美國CDC將Cryptosporidium感染列入國家必須申報(bào)的傳染病名單，2002年將Giardia感染列入國家必須申報(bào)的傳染病名單—U.S.EPA兩蟲的檢測(cè)方法（免疫磁分離熒光抗體法）檢測(cè)程序：水樣過濾洗滌離心免疫磁珠捕獲卵囊磁珠與卵囊復(fù)合物的分離熒光標(biāo)記和DAPI染色顯微鏡檢查記述結(jié)果報(bào)告檢測(cè)問題：方法操作復(fù)雜檢出率低無法進(jìn)行生物活性判定不能進(jìn)行屬、種鑒定價(jià)格高IDEXXFilta-Max?

手動(dòng)/自動(dòng)系統(tǒng)－濾器及濾芯FiltaMaxXpress快速系統(tǒng)-濾器及濾芯過濾器濾芯Filta-Max:濾芯結(jié)構(gòu)（手動(dòng)/自動(dòng)法）

60層環(huán)狀海綿:55mmx10mm

(18mm中孔)從60cm壓縮成3cm螺栓固定Filta-Maxxpress:快速法濾芯結(jié)構(gòu)40層海綿:55mmx10mm(18mm中孔)39層海綿:40mmx10mm(18mm中孔)交互疊放從79cm壓縮到3cm螺栓固定水樣流向1.水樣過濾水樣從兩側(cè)流經(jīng)壓縮的海綿膜匯集至中孔“兩蟲”在濾芯表面被捕獲濾器連接套件濾器濾芯（過濾模塊）

洗滌管濾芯置于洗滌管,并將濾芯下部的壓縮固定鑼栓解除周律性地壓縮/擴(kuò)展海綿濾芯2.洗滌(淘洗)濾芯洗滌(淘洗)裝置Filta-Max?手動(dòng)淘洗裝置Filta-Max?自動(dòng)淘洗裝置FiltaMaxXpress快速淘洗裝置過濾器500ml錐形離心瓶Filta-Maxxpress快速法淘洗流程

濾器（帶濾芯）放入淘洗裝置淘洗裝置連接緩沖液及空氣壓縮機(jī)加4.0巴(58psi)壓縮空氣按動(dòng)F1鈕2分鐘后收集400ml淘洗液快速全自動(dòng)壓縮空氣濾器＋濾芯淘洗液收集1.將裝有淘洗液樣本的500mL離心管置2000g離心力下，離心15min。慢慢地減速，（不能使用制動(dòng)裝置?。┮悦鈹嚻鸪恋砦?。

2.用吸氣裝置將沉淀物上層8-10mL處的懸浮物小心吸出

（吸氣裝置的真空應(yīng)小于3.3kPa）。3.離心濃縮4.免疫磁珠捕獲捕獲原理:

標(biāo)記A抗體的磁珠具有A抗原的C/G

DYNALMIX1混合器MPC-1磁極MPC-S磁極5.免疫磁珠與孢（卵）囊復(fù)合物的分離60min5min10min染色鏡檢6.染色及鏡檢單克隆免疫熒光染色（FA-異硫氰酸熒光素）或DAPI(4,6-二氨基-2-苯基吲哚)染色熒光顯微鏡（DifferentialInterferenceContrast,DIC）

隱孢子蟲賈第鞭毛蟲兩蟲的單抗染色結(jié)果隱孢子蟲的單克隆抗體染色結(jié)果隱孢子蟲DAPI染色結(jié)果賈第鞭毛蟲的單克隆抗體染色結(jié)果賈第鞭毛蟲DAPI染色結(jié)果賈第鞭毛蟲孢囊和隱孢子蟲卵囊在熒光鏡下的特征1.在鏡下可見蘋果綠色的孢（卵）囊。2.孢（卵）囊的形狀、大小符合描述。3.膜與胞質(zhì)的對(duì)照，膜的熒光要強(qiáng)一些。4.孢（卵）壁的完整性（孢囊可能會(huì)失去?。?.結(jié)果的計(jì)算、報(bào)告和檢測(cè)限每升水中的孢（卵）囊數(shù)計(jì)算公式：Y=（X×V）/（V1×V2）Y:每升水中的孢囊或卵囊的數(shù)目X：計(jì)數(shù)樣本的體積中孢囊或卵囊的數(shù)目V：離心后再懸浮的體積，單位為mLV1：計(jì)數(shù)樣本的體積，單位為mLV2：過濾后水的體積，單位為L(zhǎng)計(jì)算分析的檢出限: