膜片鉗與ltp課件

膜片鉗與LTP天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院王凱2021.5來源和機(jī)理細(xì)胞膜由脂質(zhì)雙分子層和蛋白質(zhì)組成，蛋白質(zhì)又包括整合蛋白和表面蛋白。離子通道是一種特殊的膜蛋白，它橫跨整個(gè)膜結(jié)構(gòu)。帶電離子在膜內(nèi)外的不同分布態(tài)勢(shì)和在不同狀態(tài)下的動(dòng)態(tài)變化是可興奮細(xì)胞靜息電位和動(dòng)作電位的基礎(chǔ)。這些無機(jī)離子通過離子通道的進(jìn)出所產(chǎn)生的電活動(dòng)是生命活動(dòng)的基礎(chǔ)。細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和離子通道如何研究離子通道美國(guó)的兩位科學(xué)家彼得·阿格雷羅德里克·麥金農(nóng)利用X光繞射方法得到了K離子通道的三維結(jié)構(gòu)，二位因此獲得2003年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。結(jié)構(gòu)研究離子通道功能觀察20世紀(jì)初由Cole創(chuàng)造，Hodgkin和Huxley完善，目的是為了證明動(dòng)作電位的峰電位是由于膜對(duì)鈉的通透性發(fā)生了一過性的增大過程。但當(dāng)時(shí)沒有直接測(cè)定膜通透性的方法，于是就用膜對(duì)某種離子的電導(dǎo)來代表該種離子的通透性。coleK+電流Na+電流電壓鉗的缺點(diǎn)(Neher)(Sakmann)膜片鉗〔PatchClamp)根本原理利用尖端直徑0.5-1um的玻璃電極吸附到細(xì)胞膜表面，通過負(fù)壓吸引使電極尖端和細(xì)胞膜形成緊密封接，使與電極尖開口處相接的細(xì)胞膜小片區(qū)域（patch）與其周圍在電學(xué)上絕緣，在此基礎(chǔ)上固定膜電位(clamp)，然后對(duì)電極尖端下面積僅為幾平方微米的細(xì)胞膜片上一個(gè)或幾個(gè)離子通道的電流進(jìn)行記錄。核心部分是一場(chǎng)效應(yīng)管運(yùn)算放大器構(gòu)成的I-V轉(zhuǎn)換器，它的正負(fù)輸入端子為等電位。向正輸入端子施加指令電位（Vc）時(shí)，經(jīng)過短路負(fù)端子可使膜片等電位，從而達(dá)到電位鉗制的目的。離子通道電流可作為I-V轉(zhuǎn)換器內(nèi)的高阻抗反饋電阻的電壓降而被檢測(cè)出。電子學(xué)部件:放大器；計(jì)算機(jī)接口，數(shù)據(jù)采集、分析系統(tǒng)。光學(xué)部件和光電接口：顯微鏡；監(jiān)視器等。機(jī)械系統(tǒng):防震臺(tái)等。輔助系統(tǒng)：電極拉制器；切片機(jī)；孵育槽；灌流系統(tǒng)等膜片鉗實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)組成膜片鉗的幾種記錄模式膜電位或膜電流單通道電流1.液體配制：主要根據(jù)研究通道的不同，配制相應(yīng)的液體，根本原那么是保持兩個(gè)平衡：滲透壓平衡和酸堿平衡。所有液體在使用前必須過濾。2.標(biāo)本制備3.記錄4.資料分析：〔1〕一般電學(xué)性質(zhì)：通過I-V關(guān)系計(jì)算單通道電導(dǎo)，觀察通道有無整流。通過離子選擇性、翻轉(zhuǎn)電位或其它通道激活條件初步確定通道類型?！?〕動(dòng)力學(xué)：開放時(shí)間、開放概率、關(guān)閉時(shí)間、通道的時(shí)間依賴性失活、開放與關(guān)閉類型〔簇狀猝發(fā)樣開放與閃動(dòng)樣短暫關(guān)閉〕，化學(xué)門控性通道的開、關(guān)速率常數(shù)等。〔3〕通過對(duì)全細(xì)胞激活曲線或失活曲線的分析，可得到半數(shù)激活或失活電壓Vh及斜率因子K?！?〕藥理學(xué)：阻斷劑、沖動(dòng)劑或其它調(diào)制因素對(duì)通道活動(dòng)的影響?！?〕綜合分析得到最后結(jié)論。膜片鉗實(shí)驗(yàn)的根本過程250ms400pAmEPSCsEPSC、mEPSC突觸電流膜片鉗實(shí)驗(yàn)的難點(diǎn)細(xì)胞特性的研究離子通道的鑒別電壓門控性離子通道的動(dòng)力學(xué)特性研究突觸聯(lián)系、突觸傳遞的研究疾病機(jī)制研究藥物篩選其他

突觸可塑、學(xué)習(xí)記憶及其機(jī)制的研究學(xué)習(xí)記憶的主要研究手段LTPLTP—學(xué)習(xí)記憶的細(xì)胞學(xué)根底在突觸前給予高頻電刺激后，隨后的單個(gè)刺激引起的突觸后誘發(fā)電位的幅度將顯著增大，誘發(fā)電位的潛伏期縮短，這種現(xiàn)象可持續(xù)很長(zhǎng)時(shí)間，在活體動(dòng)物可持續(xù)幾天到幾個(gè)星期，在離體標(biāo)本可持續(xù)幾個(gè)小時(shí)，這就是LTP現(xiàn)象。LTP誘導(dǎo)機(jī)制已經(jīng)肯定有突觸前谷氨酸遞質(zhì)和突觸后谷氨酸受體〔尤其是NMDA受體〕、細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子的參與。LTP突觸可塑性是學(xué)習(xí)記憶研究方面近年來進(jìn)展最快、成果最大的研究領(lǐng)域。很多腦區(qū)都發(fā)現(xiàn)了突觸可塑性現(xiàn)象，如小腦、海馬、皮層以及伏隔核等。海馬區(qū)主要有三個(gè)突觸回路，包括：〔1〕前穿質(zhì)纖維--齒狀回通路，即PP-DGpathway〔2〕苔狀纖維--海馬CA3通路，即MF-CA3pathway〔3〕Schaffer纖維--CA1通路，即SCCP-CA1pathwayLTP高頻刺激突觸前纖維引起突觸前神經(jīng)元去極化，引發(fā)谷氨酸類神經(jīng)遞質(zhì)大量釋放；谷氨酸類神經(jīng)遞質(zhì)作用于突觸后的AMPA受體，引起細(xì)胞膜的去極化，解除鎂離子對(duì)NMDA受體的阻滯使該受體激活并進(jìn)一步引起大量的鈣離子內(nèi)流；電生理記錄上反映為EPSP或EPSC幅度的增加，即LTP。鈣內(nèi)流引發(fā)一系列胞內(nèi)信號(hào)通路激活和生化反應(yīng)發(fā)生，使突觸后反應(yīng)能力增加；LTP原理海馬腦片LTP~記錄電極海馬腦片上電極的放置在體LTP刺激電極:采用針灸針，多為雙極電極定位坐標(biāo)(mm)：AP8，LM4，記錄電極：采用針灸針，為單極電極定位坐標(biāo)(mm)：AP4，LM2，APanteroposterior前囟前后LMlambda人字縫尖DVdorsoventral顱骨〔硬腦膜〕平面向下大鼠體重：180-240g在體LTP和膜片鉗腦片LTP的區(qū)別

在體海馬LTP的優(yōu)勢(shì)在于能較真實(shí)的反映生理狀態(tài)下神經(jīng)突觸活動(dòng)的情況，