酶的作用機制和酶的調(diào)節(jié)

主要內(nèi)容：

一、酶的活性部位二、酶催化反應(yīng)的獨特性質(zhì)三、影響酶催化效率的有關(guān)因素四、酶催化反應(yīng)機制的實例五、酶活性的調(diào)節(jié)機制六、同工酶一、酶的活性部位與底物結(jié)合，并與催化作用直接有關(guān)，這個部位稱酶的活性部位(actviesite)或活性中心(actviecenter)。組成酶活性中心的氨基酸側(cè)鏈基團主要有Glu和Asp的-COOH，Lys的ε-NH2，His的咪唑基，Ser的-OH，Cys的-SH，Tyr的側(cè)鏈基團。

結(jié)合部位（bindinggroup）

負責(zé)與底物的結(jié)合,決定酶的專一性酶活性中心

催化部位（catalyticgroup

）負責(zé)催化底物轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物，決定酶的催化能力。

一、酶的活性部位(一)酶活性部位的特點(1)活性部位在酶分子的總體中只占相當小的部分(1%～2%)(2)酶的活性部位是一個三維實體核糖核酸酶(124aa）：His12、His119、Lys41溶菌酶（129aa）：

Asp52、Glu35一、酶的活性部位(一)酶活性部位的特點(1)活性部位在酶分子的總體中只占相當小的部分(1%～2%)(2)酶的活性部位是一個三維實體(3)酶的活性部位與底物的識別的機制為誘導(dǎo)契合(inducedfit)機制(4)酶的活性部位是位于酶分子表面的一個裂縫內(nèi)(5)底物通過次級鍵以較弱的力結(jié)合到酶上Ribonuclease:cleavesRNAEnzyme-substrate:hydrogenbonds一、酶的活性部位(一)酶活性部位的特點(1)活性部位在酶分子的總體中只占相當小的部分(1%～2%)(2)酶的活性部位是一個三維實體(3)酶的活性部位與底物的識別的機制為誘導(dǎo)契合(inducedfit)機制(4)酶的活性部位是位于酶分子表面的一個裂縫內(nèi)(5)底物通過次級鍵以較弱的力結(jié)合到酶上(6)酶活性部位比整個酶分子更具有柔性或可運動性一、酶的活性部位(二)研究酶活性部位的方法1.酶分子側(cè)鏈基團的化學(xué)修飾法(1)非特異性共價修飾某些化學(xué)試劑能和酶分子中的氨基酸側(cè)鏈基團反應(yīng)而引起共價結(jié)合、氧化或還原的修飾反應(yīng)，使氨基酸側(cè)鏈基團的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)發(fā)生改變。如果酶活力降低或喪失，則表明此基團可能是酶的必需基團，反之，酶活力不發(fā)生變化，說明該基團與酶的活性中心無關(guān)。(2)特異性共價修飾某一種化學(xué)試劑專一地修飾酶活性部位的某一氨基酸殘基,使酶失活。通過水解分離標記的肽段，即可判斷出被修飾的酶活性部位的氨基酸殘基。DFP或DIFP（二異丙基氟磷酸）胰凝膠蛋白酶Structureofchymotrypsin(white)inacomplexwitheglinC(blueribbonstructure),atargetprotein.Theresiduesofthecatalytictriad(His57,Asp102,andSer195)arehighlighted.His57(blue)isflankedabovebyAsp102(red)andontherightbySer195(yellow).Thecatalyticsiteisfilledbyapeptidesegmentofeglin.NotehowcloseSer195istothepeptidethatwouldbecleavedinachymotrypsinreaction.一、酶的活性部位(3)親和標記為了提高化學(xué)修飾劑對酶活性部位的專一性修飾作用，合成了一些與底物結(jié)構(gòu)相似的共價修飾劑。共價修飾劑有兩個特點：①可以較專一地引入酶的活性部位，接近底物結(jié)合位點。②具有活潑的化學(xué)基團可以與活性部位的某一基團結(jié)合形成穩(wěn)定的共價鍵。TPCK（對甲苯磺酰-L-苯丙氨酰氯甲基酮）

TPCK修飾His，使His烷基化

底物為TPE(對甲苯氨酸-L-苯丙氨酸乙酯胰凝乳蛋白酶原、變性的胰凝乳蛋白酶都不與TPCK反應(yīng)。一、酶的活性部位2.動力學(xué)參數(shù)測定法測定不同pH下的動力學(xué)參數(shù)，確定參與反應(yīng)時酶分子側(cè)鏈基團的解離狀態(tài)，從而判斷解離的氨基酸殘基。采用此法，確定了RNase中的His12和His19參與催化反應(yīng)。3.X射線晶體結(jié)構(gòu)分析法4.定點誘變法二、酶催化反應(yīng)的獨特性質(zhì)1.酶反應(yīng)可分成兩類第一類僅涉及電子的轉(zhuǎn)移反應(yīng)的速率為108s-1數(shù)量級第二類涉及到電子和質(zhì)子兩者或者其他基團的轉(zhuǎn)移，反應(yīng)的速率在103s-1數(shù)量級。大部分反應(yīng)屬第二類2.酶的催化作用是由氨基酸側(cè)鏈上的功能基團和輔酶為媒介3.酶催化反應(yīng)的最適pH范圍通常是陜小的4.與底物相比，酶分子通常很大，而活性部位通常只比底物稍大一些5.除了具有進行催化反應(yīng)所必需的活性基團外，還有其他特性基團三、影響酶催化效率的有關(guān)因素(一)底物和酶的鄰近效應(yīng)(approximation,proximity)與定向效應(yīng)(orientation)鄰近效應(yīng)指酶與底物結(jié)合形成中間復(fù)合物以后，使底物和底物(如雙分子反應(yīng))之間，酶的催化基團與底物之間結(jié)合于同一分子而使有效濃度得以極大的提高，從而使反應(yīng)速率大大增加的一種效應(yīng)。定向效應(yīng)指反應(yīng)物的反應(yīng)基團之間和酶的催化基團與底物的反應(yīng)基團之間的正確取位產(chǎn)生的效應(yīng)。意義Page和Jencks認為，鄰位效應(yīng)與定向效應(yīng)在雙分子反應(yīng)中起的促進作用至少可分別達104倍，兩者共同作用則可使反應(yīng)速率升高108倍。羧基和酯之間,自由度愈小,愈能使它們鄰近,并有一定的取向,反應(yīng)速率就愈大.對一個雙分子反應(yīng)來說,要使其中一個底物濃度達到103～108mol/L時,才能和分子內(nèi)的反應(yīng)速率相同,這樣大的濃度實際上是辦不到的.即使是純水,水的濃度也不過是55mol/L。三、影響酶催化效率的有關(guān)因素(二)底物的形變(distortion)和誘導(dǎo)契合(inducedfit)(三)酸堿催化（acid-basecatalysis）

酸堿催化是通過瞬時的向反應(yīng)物提供質(zhì)子或從反應(yīng)物接受質(zhì)子以穩(wěn)定過渡態(tài)，加速反應(yīng)的一類催化機制。在水溶液中通過高反應(yīng)性的質(zhì)子和氫氧離子進行的催化稱為專一的酸堿催化(specificacid-basecatalysis)或狹義的酸堿催化。而通過H+和OH-以及能提供H+及OH-的供體進行的催化稱為總酸堿催化(generalacid-basecatalysis)或廣義的酸堿催化。(三)酸堿催化（acid-basecatalysis）

(三)酸堿催化（acid-basecatalysis）

酸堿催化效率取決于總酸堿的解離常數(shù)(pK)。Brφnsted催化作用定律總酸催化作用logKa=CA－α(pKa)總堿催化作用logKb=CB－β(pKb)影響酸堿催化反應(yīng)速率的因素有兩個，即酸或堿的強度（pK值）及質(zhì)子傳遞的速率。生理pH條件下His咪唑基可作為質(zhì)子供體和受體，發(fā)揮重要作用。(四)共價催化（covalentcatalysis）

什么是共價催化？

在催化時,親核催化劑或親電子催化劑能分別放出電子或汲取電子并作用于底物的缺電子中心或負電中心,迅速形成不穩(wěn)定的共價中間復(fù)合物,降低反應(yīng)活化能,使反應(yīng)加速。親核催化共價催化

親電子催化

絲氨酸羥基、半胱氨酸巰基和組氨酸咪唑基這些基團容易攻擊底物的親電中心，形成酶-底物共價結(jié)合的中間物。三、影響酶催化效率的有關(guān)因素(五)金屬離子催化1.需要金屬的酶分類(1)金屬酶(metalloenzymes)含緊密結(jié)合的金屬離子，多屬于過渡金屬離子如Fe2+、Fe3+、Cu2+、Zn2+、Mn2+或Co3+。(2)金屬-激活酶(metal-activatedenzyme)含松散結(jié)合的金屬離子，通常為堿和堿土金屬離子。如Na+、K+、Mg2+和Ca2+。2.金屬離子以3種途徑參加催化過程(1)通過結(jié)合底物為反應(yīng)定向(2)通過可逆地改變金屬離子的氧化態(tài)調(diào)節(jié)氧化還原反應(yīng)(3)通過靜電穩(wěn)定或屏蔽負電荷三、影響酶催化效率的有關(guān)因素(六)多元催化協(xié)同效應(yīng)在酶催化反應(yīng)中，常常是幾個基元催化反應(yīng)配合在一起共同起作用。例如胰凝乳蛋白酶是通過Asp102、His57、Ser195形成的“電荷中繼網(wǎng)”催化肽鍵水解，包括親核催化和堿催化共同作用。多元催化協(xié)同作用的結(jié)果，是使酶反應(yīng)加速的一個因素。(七)活性部位微環(huán)境的影響

胰凝乳蛋白酶催化芳香族氨基酸羧基構(gòu)成的肽鍵疏水小袋疏水口袋肽鏈底物羧肽酶A裂解模式底物苯甲酰甘氨酰苯丙氨酸時形成疏水口袋四、酶催化反應(yīng)機制的實例

(一)溶菌酶（Lysozyme）

1922年Fleming發(fā)現(xiàn)能溶解細胞的物質(zhì)命名為lysozyme。眼淚是溶菌酶的一個豐富來源。但臨床作用效果不佳。7年以后，F(xiàn)leming發(fā)現(xiàn)高效抗生素-青霉素。溶菌酶存在于雞蛋清及動物的眼淚中，生物學(xué)功能是催化細菌細胞壁多糖的水解。溶菌酶相對分子質(zhì)量為14600，由129個氨基酸殘基組成的單肽鏈蛋白質(zhì)，含有4對二硫鍵。(一級結(jié)構(gòu)見P395,圖10-9）

亞歷山大·弗萊明(AlexanderFleming)，因發(fā)現(xiàn)了青霉素以及它對多種傳染性疾病的治療作用，榮獲1945年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎。四、酶催化反應(yīng)機制的實例

(一)溶菌酶（Lysozyme）

NAG：N-乙酰氨基葡糖NAM：N-乙酰氨基葡糖乳酸連鍵：β-1，4糖苷鍵四、酶催化反應(yīng)機制的實例

(一)溶菌酶（Lysozyme）

溶菌酶分子近橢圓形，大小為4.5nmX3.0nmX3.0nm。它的構(gòu)象比較復(fù)雜，α螺旋僅占25%，在分子的一些區(qū)域有伸展著的β片層構(gòu)象。溶菌酶的分子內(nèi)部幾乎全部是非極性的.在溶菌酶分子的表面,有一個較深的裂縫,其大小恰好能容納多糖底物的6個單糖,是溶菌酶的活性部位.

四、酶催化反應(yīng)機制的實例

(一)溶菌酶（Lysozyme）

用大小不同的NAG寡聚體作底物測定被溶菌酶水解的相對速率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，少于4個糖的寡聚體水解速率甚小，當由四聚體增加到五聚體時，水解速率猛增500倍，五聚體增加到六聚體，速率增加近8倍，六聚體增加到八聚體，速率不再變化。這種情況與X射線晶體結(jié)構(gòu)分析結(jié)果一致，活性部位所在的裂縫(cleft)正好被6個糖殘基所裝滿。Glu35溶菌酶水解Ｄ-E之間的鍵Phillips提出溶菌酶的催化作用機制：（1）Glu35的—COOH提供一個H+到D環(huán)和E環(huán)間的糖苷鍵O原子上。H+的轉(zhuǎn)移使D環(huán)的C1鍵與糖苷鍵O原子間的鍵斷開，并形成正C離子過渡態(tài)中間產(chǎn)物。（2）有E及F殘基的NAG二聚體離開酶分子。（3)正碳離子中間產(chǎn)物進一步與來自溶劑的OH-發(fā)生反應(yīng)。Glu35質(zhì)子化，由A、B、C和D殘基組成的NAG四聚體通過擴散離開酶分子。(二)胰核糖核酸酶A（pancreaticribonucleaseA,RNaseA）

核糖核酸酶A是一種水解RNA的磷酸二酯酶,能專一性地切開嘧啶核苷酸3’P-O鍵,生成3’-嘧啶核苷酸或以3’-嘧啶核苷酸的寡聚核苷酸.(二)胰核糖核酸酶A（pancreaticribonucleaseA,RNaseA）

RNaseA的一級結(jié)構(gòu)

124aa,含4對二硫鍵.只含一條多肽鏈.是被測定順序的第二個蛋白質(zhì)(第一個酶),Moore&Stein因此獲1972年諾貝爾化學(xué)獎.RNaseA易分離純化,可制成結(jié)晶.催化機制研究方法化學(xué)修飾法和動力學(xué)方法推測,X射線晶體結(jié)構(gòu)證實.枯草桿菌蛋白酶水解為S20肽及S104蛋白.化學(xué)修飾法研究了RNaseA活性的必需氨基酸殘基-碘乙酸處理RNaseA,推測His119和His12為酶活性中心的必需基團.(二)胰核糖核酸酶A（pancreaticribonucleaseA,RNaseA）

動力學(xué)分析得到證據(jù)證實His參與晶體結(jié)構(gòu)證實了RNaseA的活性基團位置.Afoldin+proteinribonucleaseAPDB:7RSATheredballsrepresentwatersthatare‘bound’totheproteinbasedonpolarcontacts(三)羧肽酶A（carboxypeptidaseA，CpA）

羧肽酶A外肽酶,催化肽鏈C末端的肽鍵水解,對羧基末端芳香族或大的脂肪族側(cè)鏈較為敏感,容易水解.

酶單獨存在時:

藍色:Tyr248黃色:Arg145綠色:Glu270酶底物復(fù)合物:

(1)二肽的Tyr側(cè)鏈進入酶的疏水口袋,該口袋適合于芳香側(cè)鍵和大的脂肪族側(cè)鏈.(2)活性部位的Zn直接同斷裂肽鍵羰基氧配位,該底物有效的置換預(yù)先占據(jù)此位置的水分子.酶底物復(fù)合物:

(3)Arg145(黃色)的胍基移動大約0.2nm,同底物末端羧基形成一個靜電鍵,Glu270(綠色)與底物結(jié)合也經(jīng)歷了同樣的位移.酶底物復(fù)合物:

(4)當?shù)孜锏腡yr側(cè)鏈與活性口袋結(jié)合時,至少有另外4個水分子從其中被置換出來.最大的構(gòu)象變化是羧肽酶Tyr248(藍色)的酚羥基移動了1.2nm,大約相當于這個蛋白分子直徑1/4的距離.Tyr248的羥基從分子表面移到底物肽鍵附近,同底物敏感鍵N端側(cè)鏈殘基的氨基形成氫鍵.結(jié)果把活性部位的空腔關(guān)閉,并完成空腔由水充填的區(qū)域成為疏水區(qū)域的轉(zhuǎn)化.(四)絲氨酸蛋白酶絲氨酸蛋白酶是一類酶家族消化酶:胰蛋白酶(trypsin)、胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)、彈性蛋白酶(elastase)非消化酶：凝血酶(thrombin)、枯草桿菌蛋白酶(subtilisin）、纖溶酶(plasmin)、組織纖溶酶原激活劑(tissueplasminogenactivator,tPA）等。消化酶先形成酶原。乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase)不是蛋白酶，是一種絲氨酸酯酶，但具有絲氨酶蛋白酶的相關(guān)機制，功能是降解神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿。(四)絲氨酸蛋白酶消化作用的絲氨酸蛋白酶水解專一性差異:胰蛋白酶(堿性氨基酸Arg或Lys羰基側(cè)鏈肽)、胰凝乳蛋白酶(芳香氨基酸Phe和Tyr羰基側(cè)鏈肽)、彈性蛋白酶(水解小的中性氨基酸殘基羰基側(cè)鏈肽)大?。?5000（MW）結(jié)構(gòu)：一級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)相似胰凝乳蛋白酶結(jié)構(gòu)：緊密的橢球體，大小為5.1nm×4.0nm×4.0nm,C端含一個α螺旋(殘基235-245)和幾個β折疊域。多數(shù)芳香和疏水殘基包埋在蛋白質(zhì)內(nèi)部，多數(shù)帶電的或者親水的殘基分布在分子表面。(四)絲氨酸蛋白酶-胰凝乳蛋白酶（chymotrypsin）

His57、Asp102

、Ser195、在活性部位形成催化三聯(lián)體(catalytgictriad）在沒有底物時，His57是未質(zhì)子化的，然而當Ser195羥基氧原子對底物進行親核攻擊時，它從Ser195接受一個質(zhì)子，Asp102的COO-作用是穩(wěn)定過渡態(tài)中His57的正電荷形式。Asp102定向His57并保證從Ser195接受一個質(zhì)子處于適當?shù)幕プ儺悩?gòu)形式。形成?；虚g物

底物裝進疏水口袋中。(四)絲氨酸蛋白酶絲氨酸蛋白酶同源分析趨異進化（divergentevolution）:基因突變，從同一個祖先取得不同的專一性。胰蛋白酶(堿性氨基酸Arg或Lys羰基側(cè)鏈肽)、胰凝乳蛋白酶(芳香氨基酸Phe和Tyr羰基側(cè)鏈肽)、彈性蛋白酶(水解小的中性氨基酸殘基羰基側(cè)鏈肽)趨同進化(convergentevolution):枯草桿菌蛋白酶與胰凝乳蛋白酶一樣，催化三聯(lián)體也由Asp、His、Ser殘基組成。雖然來源不同，形成相似的催化機制，這種情況稱為絲氨酸蛋白酶異源的趨同進化。(五)天冬氨酸蛋白酶(asparticproteases)

天冬氨酸蛋白酶是一類蛋白水解酶家族，產(chǎn)生于哺乳動物、霉菌和高等植物特性：酸性pH（有時中性)呈現(xiàn)活性,活性部位有兩個Asp.消化酶:胃蛋白酶(pepsin)、凝乳酶(chymosin)溶酶體蛋白酶：組織蛋白酶D和E(cathepsinD&E）調(diào)節(jié)血壓:腎素(renin):產(chǎn)生血管緊張肽，刺激平滑肌收縮和降低鹽及體液分泌底物專一性：多種，通常斷裂兩個疏水氨基酸之間的肽鍵。大?。?23-340aa，MW35000(五)天冬氨酸蛋白酶(asparticproteases)

結(jié)構(gòu)：含兩個相同的結(jié)構(gòu)域。每個結(jié)構(gòu)域由2個β折疊片和2個短的α螺旋構(gòu)成。2個結(jié)構(gòu)域通過6股反平行的β折疊片橋聯(lián)起來?；钚圆课唬菏且粋€深寬的裂縫，是由2個并列的結(jié)構(gòu)域形成的，大的足以容納大約7個氨基酸殘基。作用機制：廣義酸-廣義堿催化模式。與底物結(jié)合時，一個天冬氨酸羧基質(zhì)子化，另一個脫質(zhì)子。五、酶活性的調(diào)節(jié)機制

（一）別構(gòu)調(diào)節(jié)（二）酶原的激活（三）可逆的共價修飾

（一）別構(gòu)調(diào)控

別構(gòu)調(diào)控概念1.別構(gòu)調(diào)節(jié)酶分子的非催化部位與某些化合物可逆地非共價結(jié)合后發(fā)生構(gòu)象的改變，進而改變酶活性狀態(tài)。2.別構(gòu)酶3.效應(yīng)物4.正效應(yīng)物5.負效應(yīng)物

別構(gòu)酶的作用動力學(xué)

1、正協(xié)同效應(yīng)（positivecooperativeeffect）

2、負協(xié)同效應(yīng)（negativecooperativeeffect）

3、正協(xié)同效應(yīng)別構(gòu)酶與米氏酶動力學(xué)比較

4、負協(xié)同效應(yīng)別構(gòu)酶與米氏酶動力學(xué)比較

怎么區(qū)分米氏酶與別構(gòu)酶？koshland建議用飽和比值（saturationratio,Rs）典型的米氏酶RS=81具有正協(xié)同效應(yīng)的別構(gòu)酶RS<81具有負協(xié)同效應(yīng)的別構(gòu)酶RS>81

目前常使用Hill系數(shù)區(qū)分米氏酶與別構(gòu)酶

Hill方程:

將Hill方程中的有關(guān)參數(shù)換成別構(gòu)酶中的有關(guān)參數(shù)

n為Hill系數(shù)，米氏酶Hill系數(shù)n=1

正協(xié)同效應(yīng)的別構(gòu)酶n>1

負協(xié)同效應(yīng)的別構(gòu)酶n<1別構(gòu)酶舉例

1、大腸桿菌天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶（E-Coli

aspartatetranscarbamylase,ATCase）（1）ATCase催化的化學(xué)反應(yīng)和ATCase的動力學(xué)曲線

（2）ATCase活性調(diào)節(jié)的機理

有催化活性的構(gòu)象無催化活性的構(gòu)象2、甘油醛-3-磷酸脫氫酶

（1）甘油醛-3-磷酸脫氫酶催化的反應(yīng)

（2）甘油醛-3-磷酸脫氫酶的調(diào)節(jié)機理

別構(gòu)酶調(diào)節(jié)酶活性的機理

1、對稱或協(xié)同模型（symmetryorconcertedmodel,也稱齊變模型、MWC模型）1965年由Monod、Wym