基因分析技術簡介課件

基因分析技術簡介基因分析技術簡介在生物、醫(yī)學、農(nóng)牧業(yè)領域的應用基因分析技術簡介測序的應用基因組DNA測序cDNA測序未知序列測序已知序列再測序基因分析技術簡介雙脫氧鏈終止法的原理Sanger雙脫氧鏈終止法的最大特點是引入了雙脫氧核苷三磷酸（2ˊ,3ˊ-ddNTP）作為鏈終止劑。ddNTP可以在DNA聚合酶的作用下和多核苷酸鏈的3ˊ羥基形成磷酸二酯鍵，但卻不能再與下一個核苷酸縮合，結果使得多核苷酸鏈的延伸終止?；蚍治黾夹g簡介雙脫氧鏈終止法測序的主要步驟擴增待測DNA片段，使其變性，獲得單鏈DNA模板。選擇一條與DNA單鏈互補的短鏈引物，將引物用放射性同位素標記。引物先同單鏈模板復性。在四個反應管中分別加入待測DNA單鏈模板、互補引物分子、四種的dNTP、DNA聚合酶(Klenow酶)以及不同的ddNTP進行聚合反應?；蚍治黾夹g簡介基因分析技術簡介雙脫氧鏈終止法測序與PCR的區(qū)別?測序只用一條引物，PCR需要兩條引物?測序產(chǎn)物線性增長，PCR產(chǎn)物指數(shù)增長?測序需要dNTP和ddNTP，PCR只用dNTP?測序產(chǎn)物是一系列長度相差一個堿基的片段，PCR產(chǎn)物只有一條帶基因分析技術簡介

1、商品化測序試劑盒-熒光染料標記

ABIPRISMBigDyev3.1和v1.1試劑盒2、自動化測序儀

ABIPRISM

310、3100和3730全自動遺傳分析儀

雙脫氧鏈終止法的發(fā)展基因分析技術簡介BigDyev3.1試劑盒的反應體系及條件反應體系：

單鏈DNA模板引物DNA聚合酶Mg2+4種dNTP(dATP,dGTP,dCTP和dTTP)

4種不同的熒光標記的ddNTP(ddATP,ddGTP,ddCTP和ddTTP)循環(huán)條件：

96℃1min→(96℃10s→50℃5s→60℃4min)×25個循環(huán)→4℃保溫基因分析技術簡介基因分析技術簡介ABIPrism310GeneticAnalyzercapillarySyringewithpolymersolutionAutosamplertrayOutletbuffer+Injectionelectrode-Inletbuffer基因分析技術簡介AutosamplerTraySampleVialsElectrodeCapillarySeeTechnologysectionformoreinformationonCE電進樣及電泳基因分析技術簡介熒光激發(fā)和檢測基因分析技術簡介影響測序質(zhì)量的因素測序成功的前提：PCR本身是成功的PCR產(chǎn)物一定要經(jīng)過純化后再測序測序引物比PCR引物靠后一些(Nestedprimers)在測序反應過程中反應體積不要有波動（蒸發(fā)）選擇合適的測序產(chǎn)物純化方法基因分析技術簡介SNP篩查單核苷酸多態(tài)(SNP)是基因組中最為豐富的遺傳多態(tài)，是決定個體差異的最主要的遺傳基礎。多態(tài)形式主要包括單堿基替代、插入或缺失，一般也包括微小片斷插入/缺失。由于很多SNP位點本身就是功能多態(tài)位點，使得SNP在疾病易感基因的相關性研究中有著廣泛的應用?；蚍治黾夹g簡介SNaPshot?MultiplexSystem基因分析技術簡介基因分析技術簡介SNaPshot試劑盒的反應體系及條件反應體系：

單鏈DNA模板引物DNA聚合酶Mg2+

4種不同的熒光標記的ddNTP

循環(huán)條件：

(96℃10sec→50℃5sec→60℃30sec)×25循環(huán)→4℃保溫基因分析技術簡介方法特點

分型準確：該技術也稱小測序技術，其準確度僅亞于直接測序。多位點同時檢測：可以同時檢測達12個位點，而Taqman一次僅能檢測一個。不受樣本量的限制:而Taqman對少量樣本不適合。

基因分析技術簡介注意事項

1．同一反應管中，不同位點的引物長度必須不同，最好能相差4-6個堿基。2．引物與模板互補部分（有效引物）的Tm值至少要50℃。3．為了改變引物的長度，區(qū)分不同的位點，可以在引物的5’端加poly(dT)、poly(dA)、poly(dC)或者poly(dGACT)尾巴。這四種尾巴理論上不容易形成二級結構，并且都經(jīng)過實驗驗證。小心：poly(dT)有可能與真核基因3’端的poly(dA)尾巴互補。4．在引物設計的時候，如果+鏈DNA的序列不理想，難以設計出最佳引物，請使用-鏈DNA設計引物?；蚍治黾夹g簡介微衛(wèi)星多態(tài)(STR)分析微衛(wèi)衛(wèi)星多態(tài)位點是一種短核苷酸串連重復多態(tài)（shorttandomrepeat,STR）,重復單元通常為2-5bp,由于這種重復序列在DNA復制過程中不穩(wěn)定，所以突變很高，從而導致這種標記位點的多態(tài)性很強，雜合度很高，正因為這種特點，微衛(wèi)星多態(tài)在遺傳分析中有著廣泛的應用.

基因分析技術簡介熒光——引物熒光——PCR產(chǎn)物熒光激發(fā)與檢測識別記錄結果PCR電泳數(shù)據(jù)處理STR分析