RNA甲基化研究現狀與實驗可行性課件

RNA甲基化與MeRIP-Seq測序技術

——甲基化DNA免疫共沉淀技術（MeDIP）、RNA結合蛋白免疫共沉淀技術（RIP）和RNA測序技術（RNA-seq）1RNA甲基化研究現狀與實驗可行性目錄一、探究與技術—研究歷程

（方法：使用關鍵詞“MeRIP”在NCBI上檢索到21篇相關文獻，形成綜述）3~8頁二、探究與技術—服務歷程

（方法：找到并查看提供此類服務的三家公司，發(fā)布服務的思路與消息）9~9頁三、研究與技術服務意義

（方法：綜合學術界發(fā)展勢態(tài)與技術服務發(fā)展勢態(tài)）10~10頁四、實驗原理與本質—Peak峰出現的原理

（方法：綜合NCBI上檢索到21篇文獻中的相關技術言論，著重解釋了實驗原理與Peak峰出現的原理）11~12頁五、MeRIP-Seq測序實驗簡易流程

（方法：深入淺出，用簡單的流程描述本技術）13~13頁六、北京基因組研究所流程與上海晶能生物流程（方法：找出關鍵技術文獻兩篇，詳細對比實驗方法和技術路線）14~14頁提示，晶能生物在NCBI上有署名文獻七、MeRIP-Seq可行性報告與方案

15~17頁（方法：綜合MeDIP-Seq技術、RNA-Seq技術、m6A成熟抗體技術、mRNA成熟片段化技術提出“定量化”的執(zhí)行方案）八、采購試劑方案（方法：找出必要的2~4類試劑的采購供應情況，均有代理商?。?8~18頁九、目前我國甲基化診斷產品注冊情況20~21頁（方法：在CFNA官方網站上已經可以檢索到一例甲基化診斷試劑盒（PCR熒光探針法））2RNA甲基化研究現狀與實驗可行性

探究與技術MeRIP-Seq測序技術甲基化轉錄組RNA免疫共沉淀—高通量測序技術（MethylatedRNAImmunoprecipitationSequencing）

研究歷程分析方法：以關鍵詞“MeRIP”在NCBI上檢索文獻，共檢索到21篇文獻，按照時間順序查看文獻研究流程。1、2012年，康奈爾大學威爾醫(yī)學院提出MeRIP-Seq測序技術，就是指全轉錄組m6A定位的方法，即結合m6A特異性甲基化RNA免疫沉淀技術與新一代測序技術的結合（MeRIPSeq）。一、抗體的制備方法：anti-m6A抗體（來自文獻1987/2011/1977）二、建庫樣本類型：m6A在RNA定位于成熟的mRNA中，而不在PolyA尾部。三、數據統(tǒng)計分析類型：Peak檢測峰的分布、Peak（檢測峰）統(tǒng)計分析與可視化、檢測峰中motif基序統(tǒng)計分析與可視化等。

提示：大量的m6A存在于細胞0.1–0.4%的總RNA腺苷殘基中，這表明這種修飾在轉錄組可能普遍存在。雖然m6A發(fā)現于許多年前，但是在基于m6A修飾mRNA引發(fā)的病患研究進展緩慢。這在很大程度上是因為缺乏可用的檢測m6A的方法。因為甲基腺苷不會改變其與胸腺嘧啶或尿嘧啶堿基結合的能力，m6A也不適用于標準的雜交或測序的檢測技術。

Cell.2012Jun22;149(7):1635-46.

3RNA甲基化研究現狀與實驗可行性2、2013年，中國科學院北京基因組研究所提出MeRIP-Seq改進測序數據分析方法，就是指有效識別m6A修飾區(qū)域，并且統(tǒng)計分析和可視化測序數據。一、m6A峰在RNA不同區(qū)域分布的餅狀圖。二、m6A峰在RNA三類區(qū)域分布的百分率。三、m6A位點在特定轉錄本序列中的位置。

提示：文章中的分析方法MeRIP—PF可以實現了m6A信號或檢測峰的基因注釋，結果可以Excel和圖形格式輸出，有利于研究的進一步開展。MeRIP—PF在Perl上完成，并且可從的免費獲得。GenomicsProteomicsBioinformatics.2013Feb;11(1):72-5.4RNA甲基化研究現狀與實驗可行性3、2014年，西安交大利物浦大學生物科學系和西北工業(yè)大學開發(fā)RNA甲基化差異分析軟件包，就是指MeRIP-Seq測序數據分析軟件、原序列比對、RNA甲基化位點檢測、模體序列發(fā)現、RNA差異甲基化分析和功能分析。

2015年，西安交大利物浦大學生物科學系和西北工業(yè)大學在中國《生物化學與生物物理進展》上發(fā)表名為《高通量RNA甲基化測序數據處理與分析研究進展》的綜述文章。

提示：MeRIP-Seq測序技術還處于非常早期發(fā)展階段。文章討論了每個處理步驟背后的基本原理，以及具體實踐方法和可能的替代策略，并且exomepeakR/Bioconductor包是免費提供，參見。Methods.2014Oct1;69(3):274-81.4、2014年，中國科學院北京基因組研究所研究了模式植物水稻全轉錄組RNA甲基化（愈傷組織Vs葉片）特點，就是指甲基化位點的分布特點、甲基化與表達量的關系、組織表達差異統(tǒng)計分析、甲基化富集GO功能差異分析。一、m6A峰在RNA三類區(qū)域分布的百分率。二、m6A位點在特定轉錄本序列中的位置。三、甲基化富集GO功能差異分析。RNABiol.2014Sep;11(9):1180–1188.5RNA甲基化研究現狀與實驗可行性(B)GOanalysisofcommonlymethylatedgenes(CM)andselectivelymethylatedgenesincallus(CS)andleaf(LS).

GO功能分析常見甲基化基因（CM）與選擇性甲基化基因在愈傷組織（CS）和葉片（LS）中的表達可視化圖。RNABiol.2014;11(9):1180-8.提示：可以說自此（2015年初）后，MeRIP-Seq測序技術發(fā)展模式基本確定，就是采用MeRIP-Seq測序技術研究模式物種，然后在整體水平上做mRNA中m6A位點的分布和特定位點做表達量、甲基化位點的確定，還有組織差異和條件差異的GO功能分析等。6RNA甲基化研究現狀與實驗可行性

5、2015年，西北工業(yè)大學繼續(xù)討論和研究RNA甲基化和去甲基化酶，收集數據進行薈萃分析，從系統(tǒng)水平尋找共同的甲基化調節(jié)方式。MolBiosyst.2015Jan;11(1):262-74.6、2015年，西安交通大學利物浦和中國礦業(yè)大學繼續(xù)討論和研究開展RNA甲基化數據庫的建設，提示RNA甲基化領域的發(fā)展?jié)摿?。NucleicAcidsRes.2015Jan;43(Databaseissue):D197-203.7、2015、2017年，芝加哥大學化學系、生物化學與分子生物學系從RNA交聯和免疫共沉淀和MeRIP技術出發(fā)開展研究m6A的分子開關作用，提示作者繪制了大量相關性和對比類的圖形；2017研究識別m6A位點的蛋白。Nature.2015Feb26;518(7540):560-4.Methods.2017Aug15;126:105-111.8、2015年，西安交大利物浦大學生物科學系繼續(xù)討論和研究開發(fā)了基于HMM隱馬爾可夫模型的峰識別尋峰算法，意在尋找更好的尋峰算法。BMCGenomics.2015;16Suppl4:S2.9、2015、2016、2016、2017.8年，西北工業(yè)大學、西安交大利物浦大學、麻省理工學院、揚州大學繼續(xù)討論和研究基于HMM隱馬爾可夫模型的差異甲基化區(qū)域分辨、病例-對照差異甲基化問題、基因注釋問題、精確預測mRNA甲基化位置；差異甲基化分析。BiomedResInt.2015;2015:852070.AnalBiochem.2016Apr15;499:15-23.BiomedResInt.2016;2016:8367534.Bioinformatics.2016Jun15;32(12):i378-i385.BMCGenomics.2016Aug22;17Suppl7:520.BMCBioinformatics.2017Aug31;18(1):387.

10、2017年，奧地利因斯布魯克醫(yī)科大學從另一個甲基化位點m5C角度研究RNA甲基化并且對比和m6A的關系。技術路線：按照重亞硫酸鹽測序（BS-Seq）的思路進行，可以實現C到U的轉變，進而實現全轉錄組測序分析。GenomeBiol.2017Jan5;18(1):1.11、2017年，四川農業(yè)大學和晶能生物采用公司服務的方式研究了豬肌肉和脂肪組織m6A甲基化譜，完成了多種數據分析統(tǒng)計：整體水平上做mRNA中m6A位點的分布和特定位點做表達量、甲基化位點的確定，還有組織差異和條件差異的GO功能分析等。BMCGenomics.2017;18:336.Publishedonline2017Apr28.7RNA甲基化研究現狀與實驗可行性

12、2017年8月，賓夕法尼亞大學細胞和分子生物學研究生院發(fā)表綜述論文《鑒賞表觀轉錄組epitranscriptome：新技術和新觀點》。Enzymes.2017;41:269-298.Epub2017Apr14.

13、2017年9月，中國科學院動物研究所研究了斑馬魚造血干細胞和祖細胞m6A甲基化譜，又一次完成MeRIP-Seq技術的應用。Nature.2017Sep14;549(7671):273-276.Epub2017Sep6.14、2018年1月，中山大學腫瘤防治中心、中國南方地區(qū)腫瘤學國家重點實驗室和國防科技大學提出研究m6A甲基化RNA位點變異的重要意義。提出：最近，N6-甲基腺嘌呤（m6A）已成為研究的熱點，在許多基出生物學過程和各類疾病中起到關鍵作用。NucleicAcidsRes.2018Jan4;46(D1):D139-D145.

15、2017年12月，香港大學醫(yī)學院肝臟研究和病理區(qū)國家重點實驗室使用轉錄組測序技術，m6A-Seq（MeRIP-Seq）和MeRIPqRT-PCR的方法共同檢測目標基因的m6A修飾；提出：近年來，RNA的多樣性和可逆性化學修飾成為一種新的表觀遺傳調控。Hepatology.2017Nov24.拿到的兩篇文獻——

1、2014年，芝加哥大學化學系和生物物理學研究所發(fā)表綜述文章《由可逆m6A甲基化RNA介導基因表達調控機制》，文中這種“RNA的化學標記”調劑機制中的相關蛋白被描述為“橡皮擦”、“閱讀者”和“書寫者”，以及mRNA的動態(tài)特征；提示：m6A甲基化RNA研究的重要意義。NatRevGenet.2014May;15(5):293-306.

2、2016年，耶魯大學醫(yī)學院遺傳學系和耶魯干細胞中心研究了哺乳動物小鼠胚胎干細胞中m6A的DNA甲基化譜。提示：研究組研究的主題是m6A的DNA甲基化譜，對m6A的RNA甲基化的研究思路有指導作用。Nature.2016Apr21;532(7599):329-33.8RNA甲基化研究現狀與實驗可行性

服務歷程三家企業(yè)2016~2017年相繼推出RNA甲基化服務（MeRIP-Seq服務）—廣州表觀生物（成立于2016年11月）、廣州銳博生物（成立于2004年“千人計劃”專家張必良博士）和武漢生命之美（成立于2010年7月）。上海晶能生物合作過相關服務2017年4月。1、廣州表觀生物

一、2017年9月，RNA甲基化（m6A）免疫共沉淀高通量測序（MeRIP-seq）服務方案。含基本分析內容：原始數據處理及統(tǒng)計、過濾后數據質量QC圖、測序序列與參考基因組比對、基因組覆蓋度分布。PeakCalling分析、Peak可視化、Peak統(tǒng)計分析、m6A的基本特征（peak在基因元件的分布、reads在基因元件的分布、Peak關聯基因的特征）、差異peak分析、motif分析。沒有GO功能分析。二、樣本要求—物種信息（僅限人、大小鼠物種，其他物種需評估）；實驗樣本：細胞、組織、提取后的總RNA（限定有參基因組物種）三、方案思路：實驗分組設置：細胞模型實驗組VS對照組，建議3:3；組織模型正常組VS疾病組，建議5:5；組內對照：IP組VSinput組（input組主要用于比較鑒定IP組的抗體特異性結合，是必備的組分）。測序模式：PE100/150，測序數據：3-6G。2、武漢生命之美

一、方案思路：meRIP建庫流程—meRIP分析流程（質量分析、peak分析、motif分析、GO功能分析、KEGG通路分析）3、廣州銳博生物

一、服務特點:1.甲基化篩選范圍廣，全轉錄組范圍篩查，通量高；2.豐富的項目經驗，已與多家單位合作；3.項目周期快：30工作日完成；4.分析內容全面，更有定制化與其他組學數據的關聯分析。二、推薦測序模式：HiSeq2500、SE5020Mcleanreads三、方案思路：meRIP建庫流程—meRIP分析流程（質量分析、peak分析、motif分析、GO功能分析、KEGG通路分析）

提示：MeRIP-seq基本可行，實驗流程問題不大，服務的關鍵在于后期分析所能提供的統(tǒng)計數據和分析方法。值得一提的是，這三家公司沒有學術上的產出，只是在網頁上掛出相關的技術原理和服務流程（坐待時機）。然而，上海晶能生物沒有掛出RNA甲基化服務，卻幫助完成高校發(fā)表高水平學術論著。9RNA甲基化研究現狀與實驗可行性研究與服務意義1、表達水平甲基化與測序檢測技術的一次結合。2、但凡相關文章的發(fā)表，都是有高水平期刊雜志收錄和承當；樣本處理與數據分析合理，發(fā)在Nature和Cell上都不困難，2018年仍然會延續(xù)這種情況。3、投入本領域和技術研究與服務的知名高校和單位，逐步緩慢增加，他們的評價也是積極的。4、在我國的期刊雜志上，尚未出現相關技術的文獻；提示技術有觀望者，但能夠執(zhí)行的機構和單位尚未涌現。5、在上海尚無一家機構公開提供RNA甲基化相關服務，學術研究也處于無從展開的階段。5、預測未來五年，甲基化研究可能迎來充足的研究動力和廣闊應用潛力；學者們的相關文獻也會從國內逐步轉向國內。近兩年，會有大量相關學術研究成果發(fā)表在外文高水平期刊上。10RNA甲基化研究現狀與實驗可行性實驗原理與本質（intrinsicquality）MeRIP-Seq測序文庫的制備差異點——一、去除rRNA首先從樣本細胞或組織中分離出RNA，考慮到總RNA中含有大量的rRNA序列，需要結合不同的方法除去其中的rRNA。含有PolyA尾的可以利用這一特點分離mRNA。不含的可以用相應試劑盒提取。二、平行測序內對照Control樣本提取的mRNA隨機打斷后，需要分成兩組。一組對甲基化修飾片段（IP片段，免疫沉淀片段）進行測序，一組對轉錄本片段（Control片段/背景片段，表達量片段）進行測序。不同與免疫芯片方法的原因是，任何樣本的mRNA表達量和表達譜都存在差異（差異表達）?？傊?，RNA甲基化不僅可以引起甲基化的發(fā)生，也可以引起RNA總表達量的改變。西交利物浦，高通量RNA甲基化測序數據處理與分析研究進展[J].生物化學與生物物理進展,2015(10):891-899.侯建永.MeDIP-seq檢測游離SiO2所致肺成纖維細胞轉分化的DNA甲基化[D].鄭州大學,2016.11RNA甲基化研究現狀與實驗可行性Peak峰出現的原理與本質（intrinsicquality）Cell.2012Jun22;149(7):1635-46.一、檢測的差異性IP片段樣本——實現了對甲基化reads和甲基化位點（打斷的隨機性和廣泛性）的富集與測序。Control片段樣本——實現了對正常當前表達的所有reads和位點的一般性檢測與測序（非富集狀態(tài)）。二、歸一化比較與峰產生1、歸一化由于手動上樣不可能實現，IP樣本和Control樣本各自所上樣本量一致，但是通過內部內參基因的歸一化處理，所有數據變得可以比較?；蛘哒f，可以化作單個細胞某基因的表達數量（Control歸一化數據）和單個細胞某基因的甲基化數量（IP歸一化數據）。2、富集峰總之，用圖示的方法，可以看到該基因的此位點出現Peak峰（本質上一種“歸一化后的”甲基化位點“富集峰”）12RNA甲基化研究現狀與實驗可行性

MeRIP-Seq測序實驗簡易流程：1、差異處理的樣本一對或一組2、RNA提取3、mRNA純化4、mRNA片段化與純化5、mRNA-IP（RNA免疫共沉淀）6、mRNA-IP和mRNA-Control共同做mRNA-seq測序。注：mRNA-seq技術原理：首先從細胞或組織樣本中提取總RNA，其次將mRNA反轉錄成cDNA雙鏈文庫：

1）先用poly(T)寡聚核苷酸結合帶有poly（A）尾巴的mRNA分子，將其從樣品總RNA中分離出來；

2）將mRNA分子隨機打斷成更小長度的RNA片段，用逆轉錄酶和隨機引物合成得到cDNA片段；

3）對cDNA片段進行末端修復，在將其兩端分別接上測序接頭，構成用于測序的cDNA。再將cDNA測序文庫加入測序儀的各通道中，對cDNA進行橋式PCR擴增。mRNA-seq樣本要求，RNA：濃度大于等于400ng/ul，總量大于等于20ug；OD260/280在1.8~2.2,28S/18S大于1.8，RIN大于7。13RNA甲基化研究現狀與實驗可行性北京基因組研究所流程與上海晶能生物流程1、組織收集與制備

水稻愈傷組織Vs葉片（2014.9）、豬背部肌肉Vs皮下脂肪（2017.4）2、RNA的制備（RNA分離和片段化）

步驟一：樣品保存—切取兩類組織，保存收集和存儲在?80°C以下或液氮中，用于RNA提取。

步驟二：提取核酸—采用Trizol（Invitrogen）提取總RNA。使用核酸濃度檢測和凝膠電泳檢測總RNA質量。

步驟三：富集多聚腺苷酸mRNA—采用試劑盒Sigma、Invitrogen或者其他可用的mRNA純化試劑盒。

步驟四：化學片段化—富集的mRNA采用化學片段化方法，處理成約100nt大小。使用裂解緩沖體系FragmentationBuffer(Ambion,USA)，94℃孵育5分鐘，完成后使用，0.05MEDTA終止反應，同時使用標準的乙醇沉淀法沉淀核酸。片段化的核酸懸浮成約1ug/ul的水中，以備免疫沉淀和m6A測序。3、RNA免疫沉淀（IP）

步驟一：抗體結合—片段化的RNA（大約是2.5μg總RNA）和5mg純化的anti-m6A多克隆抗體(SynapticSystems,Germany)置于IPP緩沖液（150mMNaCl,0.1%NP-40,10mMTris-HCl,pH7.4）中，4℃孵育2h。同時使用標準的乙醇沉淀法沉淀核酸-抗體。

步驟二：免疫結合—將免疫沉淀混合物與蛋白-A磁珠protein-Abeads(Repligen，USA)混合，4℃孵育2h。

步驟三：核酸洗脫—使用置于IPP緩沖液（150mMNaCl,0.1%NP-40,10mMTris-HCl,pH7.4）中的0.5mg/ml?N6-A(Sigma-Aldrich,USA)洗脫抗體結合的RNA。同時使用標準的乙醇沉淀法沉淀核酸-抗體。4、IP-RNA和輸入RNA高通量測序（RNA-seq）

質量檢測—RNA完整性使用（RIN）估計使用Nanodrop2000紫外可見（賽默飛，美國），質量控制（QC）測試由安捷倫科技（美國）完成的。輸入方式—純化得到的IP樣本和實驗前保留的2.5μg片段化總RNA，做為輸入RNA進行RNA-Seq測序。上機方式—測序儀：HiSeq3000測序儀，測序試劑盒：基因組測序試劑盒V2（Illumina，美國）。RNABiol.2014Sep;11(9):1180–1188.BMCGenomics.2017;18:336.Publishedonline2017Apr28.14RNA甲基化研究現狀與實驗可行性第一步：差異樣本設計與獲得1、樣本要求—物種信息（僅限人、大小鼠、水稻等模式動植物，其他物種需評估）；實驗樣本：細胞、組織或提取后的總RNA。原則：限定有參基因組物種。2、樣本處理—梯度處理的樣本、組織特異性差異樣本。3、保存方式—液氮或-80℃低溫保存樣本，保證RNA完整性。4、樣本質量—組織量≥100mg,植物組織≥200mg，血液量≥5ml，總RNA量≥300ug；總之，保證提取mRNA總量≥5ug。（按照每100ug總RNA中可以提取mRNA的量在2ug以上計算，每10mg動植物組織可以提取總RNA的量在20ug計算，每1ml人全血可以提取總RNA的量3－5μg計算）于桉.磁性復合微粒在mRNA純化中的應用[D].西北大學,2007.第二步：總RNA提取1、實驗原理：Trizol提取法，提取動物組織、血液與植物幼嫩組織總RNA。CTAB法，提取植物組織。2、實驗步驟：取適量組織（如上要求，保證mRNA總量≥5ug）進行液氮研磨或組織勻漿的方法，按照“Trizol—異丙醇沉底法”提取總RNA。以30~50ulRNase-freeWater洗脫。孫博文.基于全轉錄組深度測序...mRNA..表達譜分析[D].北京協(xié)和醫(yī)學院中國醫(yī)學科學院..2016.3、質量檢驗：1）總RNA量≥300ug（按照每100ug總RNA中可以提取mRNA的量在2ug以上計算）。2）Nanodrop2000檢驗核酸濃度和純度，OD260/280應在1.8~2.1之間。2）凝膠電泳檢測核酸完整性，取1ulRNA樣品加入2ul5XLoadingBuffer，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，完整的RNA其28S與18S的亮度比例約為2:1。并形成RNA質量報告。第三步：總mRNA的分離純化1、實驗原理：oligo(dT)通過共價作用或鏈親和素—生物素的相互作用固定在磁性復合微粒材料上，并以此為載體開展從動植物組織中純化mRNA。吸附下來的mRNA可以重新被洗脫下來（消除多聚A與多聚T的結合作用）。純化效率極高，有報道稱，磁珠法是纖維法的30~50倍。于桉.磁性復合微粒在mRNA純化中的應用[D].西北大學,2007.2、實驗步驟：取計算好的總RNA適量（如上要求，保證mRNA總量≥5ug），按照市售mRNA純化試劑盒方法進行實驗，如Sigma、Invitrogen兩家的試劑盒。最終，得到總mRNA，以適當體積RNase-freeWater洗脫。（試劑盒內部包含有純化步驟，不用額外純化）。3、質量檢測：不做檢測，直接進入下一步。可行性報告與方案一15RNA甲基化研究現狀與實驗可行性第四步：總mRNA的化學片段化1、實驗原理：采用化學片段化的方式，具體就是指，采用正、反向橋式探針，通過一步反轉錄及連接反應即可實現對mRNA樣本的打斷，且在反轉錄時同時引入兩端接頭，得到兩端帶有接頭的cDNA文庫。特點：取3～5ug總RNA樣品，使用探針法去除總RNA中的rRNA以富集mRNA。用正反橋式探針隨機雜交到mRNA上，并與溶液I混勻反應，得到帶有兩端接頭、片段大小合適的cDNA，文庫插入片段的大小取決于相鄰兩個正反橋式探針的距離，即可以通過調整兩端接頭的比例及接頭和模板的比例，得到不同大小的cDNA文庫。申請人:深圳華大基因研究院申請?zhí)?CN2.3mRNA片段化方法...2、實驗步驟：取上一步獲得的全部總mRNA，使用商品化試劑盒，裂解緩沖體系FragmentationBuffer(Ambion,USA)，94℃孵育5分鐘，完成后用0.05MEDTA終止打斷的酶反應。然后，按照標準的乙醇沉淀法沉淀純化核酸。以適當體積的（可以大體積洗脫）RNase-freeWater洗脫，濃縮至約1ug/ul（1000ng/ul），可以真空濃縮或者有適當的加水關系（約5~10ul）。3、質量檢測：Nanodrop2000檢驗核酸濃度和純度，OD260/280應在1.8~2.1之間，核酸的質量應當在mRNA總量≥5ug的范圍內。此時將片段化的總mRNA一分為二，一半2.5ug做RNA免疫沉淀（IP）；另一半2.5ug作為內標（Control）樣本保留下來。BMCGenomics.2017;18:336.Publishedonline2017Apr28.第五步：m6A位點的免疫共沉淀與富集（IP）1、實驗原理：5mg純化的anti-m6A多克隆抗體可以有效的從2.5ug總mRNA中，富集含有m6A甲基化位點的片段化序列，這項技術在長期研究RNA甲基化的學術領域里，是成熟與耳熟能詳的。然后，蛋白-A磁珠與抗體的結合，可以通過磁珠吸附的方式去除抗體和洗脫核酸。（也可以理解為，析出核酸與解除抗體結合）。2、實驗步驟：取一半約重2.5ug總mRNA，按照商品化anti-m6A多克隆抗體試劑盒的要求，與5mg純化的anti-m6A多克隆抗體進行結合反應。再按照商品化蛋白-A磁珠protein-Abeads(Repligen，USA)試劑盒的要求，與蛋白-A磁珠進行結合反應。最后，使用商品化的0.5mg/ml?N6-A(Sigma-Aldrich,USA)解除抗體結合作用，洗脫m6A甲基化位點片段化序列（IP樣本）。第六步：IP樣本與Control樣本輸入RNA-seq流程1、樣本輸入方式：將差異處理的A-B樣本，按照A-IP樣、A-Control樣；B-IP樣、B-Control樣共四個樣的方式進行RNA-seq建庫測序流程。從逆轉錄酶和隨機引物合成得到cDNA片段；對cDNA片段進行末端修復，在將其兩端分別接上測序接頭，構成用于測序的cDNA。再將cDNA測序文庫加入測序儀的各通道中，對cDNA進行橋式PCR擴增。2、實驗原理與步驟：RNA-seq建庫與測序。王鵬飛...轉錄組測序...關鍵酶基因的克隆與表達分析[D].山西農業(yè)大學,2015.可行性報告與方案二16RNA甲基化研究現狀與實驗可行性第七步：數據分析、Peaks峰分析、Motif基序分析、差異基因分析、GO功能分析1、實驗原理：生信分析2、實驗步驟：1）Reads統(tǒng)計與數據過濾、數據映射到參考基因組、尋找唯一映射；2）Peaks差異峰識別、Peaks差異峰統(tǒng)計；3）組織差異甲基化基因分析、m6A甲基化位點富集區(qū)Motif基序的偏搜索與可視化4）m6A甲基化位點全轉錄組分布、組織間分布差異5）甲基化基因GO功能分析、單獨分析轉錄相關基因6）組織特異基因的GO功能分析、特異基因與信號通路的甲基化Peaks峰分析BMCGenomics.2017;18:336.Publishedonline2017Apr28.17RNA甲基化研究現狀與實驗可行性采購試劑方案1、總mRNA的分離純化——試劑盒如，試劑盒GenElutemRNAminiprepkit(Sigma-Aldrich,StLouis,MO,USA)，Sigma-Aldrich在全國有多家代理，比如：安諾倫（北京）生物科技有限公司。2、總mRNA的化學片段化——試劑盒如，FragmentationBuffer(Ambion,Austin,TX,USA)，Ambionz在上海有多家代理，比如：上海拜力生物科技有限公司。3、anti-m6A多克隆抗體、蛋白-A磁珠、N6-A(Sigma-Aldrich,USA)——原料如，抗體：Purifiedanti-m6Apolyclonalantibody(SynapticSystems,G?ttingen,Germany)

，SynapticSystems在上海有多家代理，比如：上海起福生物科技有限公司。又如，蛋白-A磁珠：Protein-Abeads(Repligen,Waltham,MA,USA)，Repligen在上海有多家代理，比如：上海聚仕隆生物科技有限公司。4、mRNA建庫流程成熟如，mRNAsequencingkit(IlluminaInc.,SanDiego,CA,USA)，Illumina試劑在上海有多家代理，Illumina技術支持可提供mRNA建庫具體方案。18RNA甲基化研究現狀與實驗可行性主要引用與技術路線參考文獻參考文獻：1、技術路線：中國科學院北京基因組研究所研究了模式植物水稻全轉錄組RNA甲基化（愈傷組織Vs葉片）RNABiol.2014Sep;11(9):1180–1188.2、技術路線：四川農業(yè)大學和晶能生物采用公司服務的方式研究了豬（肌肉和脂肪組織）m6A甲基化譜RNABMCGenomics.2017;18:336.Publishedonline2017Apr28.3、綜述文章：西安交大利物浦大學生物科學系和西北工業(yè)大學在中國《生物化學與生物物理進展》上發(fā)表名為《高通量RNA甲基化測序數據處理與分析研究進展》的綜述文章4、綜述文章：芝加哥大學化學系和生物物理學研究所發(fā)表綜述文章《由可逆m6A甲基化RNA介導基因表達調控機制》NatRevGenet.2014May;15(5):293-306.5、MeDIP-seq技術路線：碩士論文—鄭州大學/中南大學；博士論文—復旦大學。6、轉錄組測序流程：碩士論文—北京協(xié)和醫(yī)學院中國醫(yī)學科學院，山西農業(yè)大學等。王鵬飛...轉錄組測序...關鍵酶基因的克隆與表達分析[D].山西農業(yè)大學,2015.孫博文.基于全轉錄組深度測序...mRNA..表達譜分析[D].北京協(xié)和醫(yī)學院中國醫(yī)學科學院..2016.7、mRNA片段化方法：參看華大基因專利文獻申請?zhí)?CN2.3申請人:深圳華大基因研究院mRNA片段化方法...8、總mRNA的分離純化方法于桉.磁性復合微粒在mRNA純化中的應用[D].西北大學,2007.