抗體工程要點課件

抗體工程抗體工程要點抗原的來源生物組織純化

蛋白的純化方法：1.離子交換2.凝膠過濾3.親和層析4.輸水作用層析

等?？贵w工程要點抗原的來源人工合成（化學方法）1.半抗原的合成2.抗原多肽的合成：多肽合成儀抗體工程要點抗原的來源蛋白的重組表達1.原核細胞的表達方法：大腸桿菌，枯草桿菌。2.酵母細胞的真核表達方法：甲醇畢赤酵母的重組表達。3.昆蟲細胞的表達：桿狀病毒表達載體。4.哺乳動物細胞的表達：CHO，HEK293。5.抗原的單獨表達和融合表達。6.表達標簽（TAG）：Fc標簽，HIS標簽，F(xiàn)LAG標簽（DYKDDDDK），C-MYC標簽，GST標簽等?？贵w工程要點原核表達系統(tǒng)質粒：1.多克隆位點（MCS）2.抗性基因

3.啟動子（P）4.復制起始位點（Ori）抗體工程要點原核細胞的表達操縱子表達模型與啟動子：抗體工程要點酵母真核細胞表達系統(tǒng)酵母表達系統(tǒng)的優(yōu)缺點：操作簡便。表達量高。培養(yǎng)條件簡單。易于純化。N-端可能會有氨基酸缺失。存在過量糖基化的可能?？贵w工程要點昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)抗體工程要點哺乳動物細胞表達系統(tǒng)穩(wěn)定表達細胞系：CHO細胞瞬時表達細胞系：293細胞載體：原核載體骨架真核啟動子增強子多克隆位點PolyA信號真核細胞篩選標志加壓篩選基因抗體工程要點哺乳動物細胞表達系統(tǒng)的特點可以分泌表達，活性高。純化步驟可能比較復雜。糖基化比較正常。成本較高，表達量偏低。周期較長?？梢越o血清培養(yǎng)的方法?？贵w工程要點第三章抗體分子的結構和分類CDR區(qū)：互補決定區(qū)FR區(qū)：框架區(qū)重鏈分子量：450-550個氨基酸殘基構成，45-70kd輕鏈分子量：大約214個氨基酸殘基構成，22-24kd抗體工程要點抗體分子片段抗體工程要點抗體分子的分類IgA和IgM的J鏈，IgA的分泌片IgG：1,2,3,4.抗體工程要點bacteriaAb+antigenaggregatesareingestedbyphagocyticcellsvirusesTheycanrecognize:CancercellsProteins,carbohydrates,smallmolecules,etc,etc.Antibodiestendtoaggregatetheirtargets(viruses,cells)(proteins)Whatcanantibodiesdo?Xenotransplantation,Autoimmunodiseases抗體工程要點特殊的抗體分子卵黃抗體IgY：由兩條重鏈（H）和輕鏈（L）組成，重鏈（υ）由一個可變區(qū)（V）和4個恒定區(qū)（C）組成，沒有鉸鏈結構。完整分子量為180KDa（7.8S），重鏈為67－70KDa，輕鏈為25KDa，但還存在一個小體積副本，120KDa（5.7S），發(fā)現(xiàn)于野鴨和某些龜類中。克隆IgYH鏈表明，較小的IgYH鏈缺乏C3、C4區(qū)，稱為IgY（△Fc）抗體工程要點單域抗體特點：1.見于駝類動物，軟骨魚類

2.沒有輕鏈多肽。

3.CDR3區(qū)較長。

4.駝類單域抗體沒有CH1.5.去除Fc片段后稱為納米抗體?？贵w工程要點抗體的生物學功能特異性的結合抗原激活補體結合Fc受體1）調理吞噬作用：巨噬細胞。2）介導過敏反應：肥大細胞。3）ADCC作用：NK細胞、單核細胞。4）穿過胎盤和粘膜5）免疫調節(jié)?？贵w工程要點抗體的來源抗體的定義抗體的發(fā)現(xiàn)：1888年EmileRoux和AlexanderYersin發(fā)現(xiàn)了白喉毒素，1890年VonBehring發(fā)現(xiàn)，白喉毒素或者破傷風毒素免疫動物后，血液中可以產(chǎn)生阻止毒素誘發(fā)疾病的物質，稱為抗毒素（antitoxin)。電泳分析gamma球蛋白（并不全是抗體）1972年世界衛(wèi)生組織和國際免疫學聯(lián)合會把具有抗體活性及化學結構與抗體類似的一類球蛋白，統(tǒng)一命名為免疫球蛋白（immunoglobulin)?？贵w工程要點人血清球蛋白的電泳圖譜白蛋白a1a2bg白蛋白a1a2bg抗體工程要點抗體生成的理論1897年，PaulEhrlich提出了側鏈學說，他認為細胞表面有特異性受體分子，可以釋放的血液里面，就是抗毒素（抗體）。1930年，Breinl和Haurowitz提出模板學說，認為抗原是抗體合成的模板。1955年，Jerne提出天然抗體選擇學說，抗原抗體的復合物刺激細胞產(chǎn)生更多針對該抗原的抗體。1958年，Macfarlane，Burnet，DavidTalmadge和Joshua提出了克隆選擇學說，每一個產(chǎn)生抗體的細胞克隆（B細胞）只能產(chǎn)生一種抗體，抗原與B細胞表面的膜型抗體分子結合，刺激B細胞的增殖分化，漿細胞，生產(chǎn)更多的抗體?？贵w工程要點Clonalselectiontheory細胞凋亡（apoptosis：Caspase）細胞自噬（autophagy：溶酶體）抗體工程要點人體內可以產(chǎn)生10E12以上不同的抗體分子，為什么？抗體工程要點第四章抗體的基因及其表達抗體重鏈基因簇（IgH):14號染色體，1.5Mb抗體輕鏈Kappa基因簇（IgK）：2號染色體，800kb?？贵w輕鏈Lamda基因簇（IgL）：22號染色體，700kb)?？贵w工程要點抗體重鏈的基因及其表達V基因：51個J基因：6個D基因：27個C基因：10個RNAalternativesplicing抗體工程要點輕鏈的基因與重排V基因：30個J基因：4個C基因：4個V基因：40個J基因：5個C基因：1個抗體工程要點抗體基因重排的機制RSS：rearrangementsignalsequence重排信號序列12/23規(guī)則RAG:recombinationactivatinggeneRAG1和RAG2異源二聚體TdT：terminaldeoxynucleotidyltransferase末端脫氧核苷酸轉移酶抗體工程要點抗體類別的轉換S區(qū)介導的二次重排：switchingregion，除了Cd外，其它C基因前都有S區(qū)序列?？贵w工程要點抗體多樣性的原因多種不同的基因片段。不同重鏈和輕鏈的隨機取用和組合。VDJ基因片段重組時連接的多樣性，連接區(qū)的核苷酸插入。體細胞的高突變頻率?？贵w工程要點抗原與抗體的相互作用6個CDR區(qū)，非共價結合抗原，空間可變結構的結合。作用特點：特異性可逆性有量效關系。抗體工程要點抗體的制備多克隆抗體：抗血清血清與血漿抗體的滴度單克隆抗體：由單一細胞克隆分泌的，識別同一個抗原決定簇，結構與功能都完全相同的抗體?；蚬こ炭贵w：通過基因工程方法生產(chǎn)或者改造過的抗體分子，一般采用工程細胞進行表達?？贵w工程要點免疫血清的制備方法免疫血清的要求：效價高，特異性強?？乖募兌让庖咦魟┛乖姆诸悾侯w粒型，可溶膠體?？乖桶肟乖?0kd,半抗原6000以下?？乖募兓椒ǎ簩游?，電泳。抗體工程要點半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)常用的載體蛋白：BSA，OVA，KLH偶聯(lián)機制：1）形成酰胺鍵2）氨基間形成連接橋（NH-R-NH）3）形成偶氮鍵（-N=N-）：如酪氨酰、組氨酰、賴氨酰殘基間。4）對于沒有羰基和氨基的半抗原，引入連接基（spacer），再與蛋白偶聯(lián)，甲醛等?？贵w工程要點佐劑的使用氫氧化鋁佐劑（適合人用疫苗）明礬佐劑石蠟油、羊毛脂等?？乖娜榛椒ǎ?）研磨法2）注射器乳化法3）超聲乳化4）復合乳劑：增加2%的Tween-20生理鹽水，機械或者超聲乳化。抗體工程要點動物的免疫需要考慮動物種系、抗原劑量、免疫途徑、加強免疫的時間、免疫次數(shù)和佐劑的使用。用于免疫的動物：兔、大鼠、小鼠、豚鼠、綿羊、山羊、雞、山羊、馬、驢、猴等。1）抗原與動物種屬的關系2）動物的生理狀態(tài)3）血清的用量抗原的用量：兔0.5-1mg/kg體重。小鼠：10-100ug。免疫途徑：靜脈=脾臟=淋巴結>腹腔>肌肉>皮下>皮內。加強免疫（boost）：每隔2-3周免疫1次，2-3次后，1周后檢測血清中的抗體滴度，然后可以放血，制備抗體。免疫方案：皮下多點注射。第1次福氏完全佐劑，后面福氏不完全佐劑?？贵w工程要點福氏完全佐劑和福氏不完全佐劑的成分成分

完全佐劑

不完全佐劑石蠟油

6份

+

+無水羊毛脂

4份

+

+殺死的分枝桿菌

3-5mg

+

-磷酸緩沖溶液

10份

+

+

（福氏完全佐劑的制備：使用前在福氏不完全佐劑中加入適量殺死的分枝桿菌）

抗體工程要點抗體在動物血清中的表達水平抗體工程要點多克隆抗體的制備和保存動物的放血：心臟取血，耳緣靜脈采血（兔），尾尖取血，眼底取血（小鼠，大鼠），頸靜脈取血（大型動物，羊，羊駝）。處死動物取血的方法：頸動脈取血，摘眼球取血。血清的分離：冰箱放置過夜，3000rpm,30min,吸取血清，加入疊氮鈉或者硫柳汞防腐劑，-20或者-80度長期保存。抗體工程要點多克隆抗體的粗提：辛酸飽和硫酸銨沉淀法將待提取樣品用60mmol/L，pH4.0醋酸緩沖液稀釋3～4倍，調pH至4.5，對含脂質較高的標本可采用二氧化硅粉或玻璃纖維吸附法除去脂質。在室溫下邊攪拌邊緩慢加入正辛酸，按每ml樣品中加25μl，若樣品體積小于5ml，則每ml樣品內加入30μl正辛酸，攪拌30min。10000×g離心30min，取上清液通過定性濾紙過濾，裝人透析袋，用20倍體積的PBS，4℃透析過液，中間換液3～4次。然后每毫升混合液加0.27g硫酸銨，攪拌30min。以5000g離心15min，收集沉淀物，溶于少量PBS中，再以15000×g離心20min。上清液即為提取的Ig，其中大部分為IgG，約占90％，少量為IgA及IgM，回收率>80％。整個操作可在24h內完成。抗體工程要點DEAE纖維素精制多克隆抗體蛋白標本對0.005mol/L，pH8.6Tris-PO4

透析。DE52裝柱，并以0.005mol/L，pH8.6Tris-PO4

平衡。加樣，以0.005mol/L，pH8.6Tris-PO4

洗脫，紫外監(jiān)測直至洗脫液280nmOD回到基線。這一步驟可除去血清中其他蛋白。以350ml，0.055mol/L，pH6.0Tris-PO4

洗脫，這一步驟可用于純化血清IgG和IgM。以125ml，0.055mol/L，pH6.0Tris-PO4

和125ml0.5mol/L，pH5.1Tris-PO4梯度洗脫，總量收集250ml；重復步驟（5）。根據(jù)280nm峰值合并蛋白峰，對PBS透析，PEG濃縮，-20度保存?？贵w工程要點蛋白質純化系統(tǒng)抗體工程要點

單克隆抗體的制備單克隆抗體的定義：序列、結構、功能、抗原結合性質都完全相同的抗體。來源：雜交瘤細胞

表面展示抗體文庫

單一B細胞抗體工程要點單克隆抗體來源的圖示抗體工程要點抗體工程要點骨髓瘤細胞SP2/01.HGPRT基因缺陷2.TK基因缺陷3.不分泌抗體抗體工程要點細胞融合的方法病毒介導的細胞融合PEG介導的細胞融合電融合抗體工程要點HAT培養(yǎng)基在雜交瘤細胞篩選中的作用HAT選擇培養(yǎng)基的作用是篩選出（雜交瘤細胞）。HAT選擇培養(yǎng)基含有次黃嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶，其中氨基喋呤可阻斷DNA合成的主要途徑。主要途徑阻斷后，依靠應急途徑即在HGPRT（次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶）和TK（胸苷激酶）作用下，利用胸腺嘧啶和次黃嘌呤合成DNA，缺少其中一種，DNA合成不能發(fā)生。用于雜交的骨髓瘤細胞系均由經(jīng)有毒藥物誘導而成選擇產(chǎn)生的代謝缺陷型細胞，細胞內均無TK或HGPRT，所以單個或融合骨髓瘤細胞在HAT培養(yǎng)液中將死亡。B細胞雖然有HGPRT和TK，但在體外通常培養(yǎng)條件下，尤其是在單個細胞環(huán)境下難于長期存活和增殖傳代。因此只有雜交瘤細胞才能在HAT培養(yǎng)液中生長繁殖?？贵w工程要點單克隆的篩選液體有限稀釋法（細胞計數(shù)）半固體培養(yǎng)基法抗體工程要點單克隆抗體的鑒定ELISA方法的原理：包被抗原加入培養(yǎng)基酶標二抗抗體工程要點小鼠單克隆抗體的制備雜交瘤細胞的體外培養(yǎng)：RPMI1640培養(yǎng)基

產(chǎn)量較低，條件要求比較嚴格，可以放大。小鼠腹水的生產(chǎn)方法：1）腹腔接種降植烷或液體石蠟，每只小鼠0.3-0.5ml。2）7-10天后腹腔接種用PBS或無血清培養(yǎng)基稀釋的雜交瘤細胞，每只小鼠5×105/0.2ml。3）

間隔5天后，每天觀察小鼠腹水產(chǎn)生情況，如腹部明顯膨大，以手觸摸時，皮膚有緊張感，即可用16號針頭采集腹水，一般可連續(xù)采2-3次，通常每只小鼠可采5-10ml腹水；4）將腹水離心（2000r/min5分鐘），除去細胞成分和其他的沉淀物，收集上清，測定抗體效價，分裝，-70℃凍存?zhèn)溆?，或凍干保存?？贵w工程要點噬菌體抗體庫

Surfacedisplayantibodylibrary抗體工程要點噬菌體展示庫

Phagedisplaylibrary抗體工程要點M13噬菌體的組裝抗體工程要點M13噬菌體抗體展示載體重鏈和輕鏈在大腸桿菌膜周質組裝成Fab抗體工程要點酵母展示技術

Yeastdisplaylibrary篩選方法：FACS抗體工程要點核糖體展示文庫

Ribosomedisplaylibrary抗體工程要點抗體文庫篩選的優(yōu)缺點優(yōu)點：

周期短，成本低缺點：

抗體庫的容量有限，親和力低，需要體外突變以提高抗體的親和力（invitromaturation)

可能引入新的免疫原性。抗體工程要點單一B細胞篩選的方法抗體工程要點B細胞篩選的優(yōu)缺點優(yōu)點：

來源于人體，免疫原性最低。缺點：

來源有限，可能只適用于一些傳染性疾病抗體的篩選，對于自身免疫病和腫瘤相關的抗原篩選比較困難?？贵w工程要點

轉基因小鼠篩選全人單克隆抗體抗體工程要點小鼠內源基因的敲除（knockout）EScellChimericmouseEScellsinmediumHomologousrecombinationBlastcystmicroinjection抗體工程要點抗體的標記技術同位素標記酶標記：堿性磷酸酶（AP）、辣根過氧化物酶（HRP）。熒光素標記：FITC、羅丹明、quantumdot(量子點）、AlexaFlor488-650nm。生物素標記：biotin-avidin,strepavidin(鏈親和素）膠體金標記技術：氯金酸+檸檬酸還原?？贵w工程要點抗體的應用：檢測RIAEIAELISA免疫熒光免疫組化抗體工程要點EIA和ELISA：抗原或抗體的檢測競爭性EIA抗體工程要點膠體金試紙條：定性檢測抗體工程要點電化學發(fā)光檢測（ECILA）ＥＣＬＩＡ是利用電化學發(fā)光劑標記的抗原或抗體與待測物經(jīng)過一系列的免疫反應和洗滌等理化步驟，最后用光學儀器測量免疫反應前后電化學發(fā)光信號強度的改變，從而對抗原或抗體物質進行定量分析的一種方法。當反應體系中加入電子供體三丙胺后，在電場作用下，釕分子和三丙胺在電極表面分別被氧化成三價釕和帶陽離子的自由基三丙胺。后者很不穩(wěn)定，迅速失去一個質子形成強還原劑自由基三丙胺，將三價釕分子還原成激發(fā)態(tài)的二價釕，其自身則被氧化成二丙胺和丙醛。接著激發(fā)態(tài)的釕分子衰減成基態(tài)釕分子，同時放出一個波長為６２０ｎｍ的光子。這一過程在電極表面以每毫秒幾十萬次的速度循環(huán)進行，產(chǎn)生的光子經(jīng)光電倍增管檢測光強度，從而測出待檢抗體或抗原的含量?？贵w工程要點免疫-PCR抗體工程要點PCR免疫檢測方法抗體工程要點噬菌體免疫PCR抗體工程要點組織切片與免疫組化（熒光）冷凍切片石蠟切片1.取材2.固定3.水洗4.脫水包埋5.切片6.展片7.撈片8.鋪片9.染色10.封片11.觀察抗體工程要點FACS：florescenceactivatedcellsorting抗體工程要點MACS:magneticactivatedcellsorting抗體工程要點蛋白質芯片的原理與檢測1.二抗檢測：顯色、熒光或發(fā)光。2.質譜檢測抗體工程要點不同水平的基因表達調控microRNAAlternativesplicingHistoneacetylationandmethylationDNAmethylation1.Phosphorylation2.Glycolysation3.ubiquitination抗體工程要點免疫共沉淀：Co-IP抗體工程要點Ch-IP：染色體免疫共沉淀抗體工程要點Westernblot抗體工程要點抗體藥物：治療領域傳染性疾?。喊２├《咀陨砻庖咝约膊。侯愶L濕性關節(jié)炎腫瘤：乳腺癌、胃癌、結腸癌

作用機理：1.ADCC作用殺死腫瘤細胞2.CDC作用3.阻斷腫瘤細胞內的血管新生4.阻斷腫瘤生長的信號通路5.解除腫瘤細胞對免疫系統(tǒng)的抑制作用代謝性疾病：骨質疏松、糖尿病。抗體工程要點抗病毒作用抗體工程要點自身免疫性疾病抗體工程要點腫瘤的治療：ADCC作用抗體工程要點腫瘤治療：CDC效應抗體工程要點腫瘤的血管新生抗體工程要點腫瘤自分泌生長因子抗體工程要點腫瘤的免疫檢查點抗體工程要點代謝性疾病的治療抗體工程要點抗體藥物的研發(fā)選擇疾病類型選擇相關的抗原選擇研發(fā)的方向：仿制藥？創(chuàng)新藥？選擇抗體的來源：鼠源、人源。選擇抗體的表達方式：酵母？CHO？轉基因植物？藻類細胞？人源細胞？選擇生產(chǎn)的工藝：不銹鋼？一次性袋子？選擇細胞培養(yǎng)的工藝：灌流？流加？抗體工程要點發(fā)酵罐WAVE抗體工程要點細胞培養(yǎng)的方式灌流流加抗體工程要點抗體的純化抗體工程要點抗體仿制藥的研發(fā)文獻的調研：化合物專利、純化專利、制劑專利、組合物專利等。原研藥的鑒定：氨基酸序列，原研藥的采購。抗體工程要點蛋白質的N-端測序Edman化學降解，其基本原理是包括通過異硫氰酸苯脂與蛋白質和多肽的N-端殘基的偶聯(lián)，苯氨基硫甲酰酞（PTC-肽）環(huán)化裂解，和噻唑呤酮苯氨（ATZ）轉化為苯異硫尿氨基酸（PTH-氨基酸）三個主要的化學步驟，每個循環(huán)從蛋白質與多肽裂解一個氨基酸殘基，同時暴露出新的游離的氨基酸進行下一個Edman降解，最后通過轉移的PTH-氨基酸鑒定實現(xiàn)蛋白質序列的測定?？贵w工程要點抗體工程要點高表達細胞株的構建：cellpool抗體工程要點高表達細胞株的構建：單克隆的篩選抗體工程要點抗體編碼DNA序列的優(yōu)化原則GC含量密碼子使用偏性隨機性RNA的二級結構終止密碼子的選擇（雙終止密碼子）DNA的人工合成與序列分析抗體工程要點人基因組DNA的GC含量：40%抗體工程要點抗體分子DNA序列的優(yōu)化：密碼子偏性抗體工程要點抗體DNA序列的優(yōu)化：RNA二級結構抗體工程要點表達載體的構建GCCACCATGGKozaktranslationinitiationsequence抗體工程要點信號肽的選擇抗體工程要點抗體的分泌步驟抗體工程要點CHO細胞的DNA轉染1.陽離子脂質體轉染方法2.電轉法抗體工程要點CHO細胞培養(yǎng)抗體工程要點CD培養(yǎng)基的主要成分Theconstituentsofachemicallydefinedmediainclude:abasalmedia(suchasDMEM,F12,orRPMI1640,containingaminoacids,vitamins,inorganicsalts,buffers,antioxidantsandenergysources),whichissupplementedwithrecombinantalbumin,chemicallydefinedlipids,recombinantinsulinand/orzinc,recombinanttransferrinoriron,seleniumandanantioxidantthiolsuchas2-mercaptoethanolor1-thioglycerol.抗體工程要點氨基酸氨基酸氨基酸是組成蛋白質的基本單位。不同種類的細胞對氨基酸的要求各異，但有幾種氨基酸細胞自身不能合成，必須依靠培養(yǎng)液提供，這幾種氨

基酸稱為必需氨基酸。其中谷氨酰胺是細胞合成核酸和蛋白質必需的氨基酸，在缺少谷氨酰胺時，細胞生長不良而死亡。因此，各種培養(yǎng)液中都有

較大量的谷氨酰胺。但是，由于谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定，應置于-20℃冰箱中保存，在使用前加入培養(yǎng)液內。已含谷氨酰胺的培養(yǎng)液在

4℃冰

箱中儲存

2

周以上時，還應重新加入原來量的谷氨酰胺。抗體工程要點碳水化合物和無機鹽碳水化合物碳水化合物是細胞生長主要能量來源，其中有的是合成蛋白質和核酸的成分。主要有葡萄糖、核糖、脫氧核糖、丙酮酸鈉和醋酸等。無機鹽培養(yǎng)液中無機鹽的主要功能是幫助細胞維持滲透壓平衡。此外，通過提供鈉，鉀和鈣離子，幫助細胞調節(jié)細胞膜功能。培養(yǎng)液的滲透壓是一個

非常重要的因素,

細胞通常可耐受

260

mOsm/kg~320

mOsm/kg。標準培養(yǎng)液的滲透壓在此范圍內波動。特別注意：向培養(yǎng)液中加入其它物質

有可能會明顯改變培養(yǎng)液的滲透壓，特別是溶于強酸或強堿中的物質。向培養(yǎng)液中添加

HEPES

時需調節(jié)鈉離子濃度。抗體工程要點緩沖系統(tǒng)和維生素緩沖系統(tǒng)大多數(shù)細胞所需pH在

7.2-7.4。但是，細胞培養(yǎng)最適pH值隨培養(yǎng)的細胞種類不同而不同。成纖維細胞喜歡較高pH

（7.4-7.7），而傳代轉化細胞

系則需要偏酸pH（7.0-7.4）。由于多數(shù)培養(yǎng)液靠碳酸氫鈉（NaHCO3）與CO2體系進行緩沖，因此，氣相中的CO2濃度應與培養(yǎng)液中碳酸氫鈉濃度相

平衡。如果氣相或培養(yǎng)箱空氣中CO2濃度設定在

5％，培養(yǎng)液中NaHCO3的加入量為

1.97

g/L；如果CO2濃度維持在

10％，培養(yǎng)液中NaHCO3的

加入量為

3.95

g/L。細胞培養(yǎng)瓶蓋不應擰得太緊，以保證氣體交換。

HEPES

是一種非離子緩沖液，在

pH

7.2-7.4

范圍內具有較好的緩沖能力，但是非常昂貴，在高濃度時對一些細胞可能有毒。HEPES

緩沖液

可與低水平的碳酸鈉（0.34

g/L）共用，以抵消因額外加入

HEPES

引起的滲透壓增加。在這種培養(yǎng)條件下，細胞培養(yǎng)瓶的蓋子應擰緊，以防止培

養(yǎng)液中所需的少量碳酸鹽散入空氣中。大多數(shù)培養(yǎng)液中含有酚紅作為

pH

指示劑，酸性培養(yǎng)液呈橙黃色，堿性培養(yǎng)液呈深紅色。維生素在細胞培養(yǎng)中，盡管血清是維生素重要來源，

但是許多培養(yǎng)基中添加了各種維生素以適合更多的細胞系生長?？贵w工程要點CHO細胞的培養(yǎng)工藝優(yōu)化抗體工程要點培養(yǎng)工藝的放大溫度、攪拌轉速、PH、溶氧、泡沫和液面水平?？贵w工程要點培養(yǎng)工藝優(yōu)化和放大的DOE軟件抗體工程要點培養(yǎng)基成分的優(yōu)化氨基酸成分分析全自動生化分析儀抗體工程要點培養(yǎng)基的澄清過濾抗體工程要點碟片式離心機(1)進料，(2)排出口（輕相），(3)向心泵，(4)碟片，(5)儲渣空間，(6)排渣口，(7)排渣活塞閥，(8)離心捕集器，(9)排出口（重相），(10)噴嘴，(11)計量注水/開啟水，(12)定時器在離心工藝開發(fā)過程中，有很多參數(shù)需要優(yōu)化，如補料的速度、離心機轉速、濾餅層的去除頻率等，這些參數(shù)會影響到細胞的穩(wěn)定性、處理的時間以及抗體收率等?？捎猛ㄟ^優(yōu)化這些參數(shù)合理地使各種訴求達到平衡?？贵w工程要點切向流過濾切向流過濾是指液體流動方向與過濾方向呈垂直方向的過濾形式。傳統(tǒng)的液體死端過濾(deadend)是大部分微孔過濾(MF，微濾)，包括除菌過濾所采用的過濾形式，其液體的流動方向與過濾方向一致，隨著過濾的進行，過濾膜表面形成的濾餅層或凝膠層厚度逐漸增大，流速逐漸降低。只能處理小體積的料液。對于較大規(guī)模的料液過濾時，就需要采用切向流過濾方式，液體流動在過濾介質表面產(chǎn)生剪切力，減小了濾餅層或凝膠層的堆積，保證了穩(wěn)定的過濾速度。切向流微濾系統(tǒng)主要應用于生物工程領域下游處理，如取代離心機從發(fā)酵液中收集細胞及去除細胞碎片等，特別是賽多利斯的切向流MF系統(tǒng)因其能夠整體在位蒸汽滅菌，還可以應用于動物細胞連續(xù)培養(yǎng)的無菌換液以及提高菌體分泌物表達收率，在培養(yǎng)過程中無菌條件下的連續(xù)換液。抗體工程要點抗體的純化蛋白A親和層析陰離子交換樹脂陽離子交換樹脂除菌過濾去病毒：低pH值，納濾?？贵w原液抗體工程要點抗體的質量分析ProteinConcentration----------------------70.9mg/mL[63.0-77.0]

Potency----------------------100%[80-125%]

ID(immunoassay)----------------------Pass

SE-HLC-----------------------MP:99.8%,HMW:0.2%,LMW:0.0%[MP≥99%]

CE-SDS,reduced----------------------HC+LC:98.9%,HC:66.8%LC:32.1%[LC+HC≥98%]

CEX-HPLC-----------------------MP:89.6%,Acidic:2.7%,Basic:7.7%[≥80%]

CEX-HPLCID-----------------------Pass

Osmolality-----------------------314mOsm/kg[300±50]

pH----------------------5.2at24.6°C[5.0–5.4]

Appearance-----------------------Report

Volume-----------------------1.2mL(average1.1525mL,n=5)[≥1mL]

Sub-visibleParticulate----------------------29particles/container≥10μm[nomorethan6000]

particles/container≥25μm[nomorethan600]

Sterility--------------------------------------Pass

BacterialEndotoxin-----------------------<0.2EU/mL[≤5.0]

CHOPELISA-----------------------4.4ppm

Protein-AELISA-----------------------<0.5ppm抗體工程要點抗體的糖基化檢測利用毛細管電泳和質譜(CEMS)對重組單克隆抗體(mAb)糖基化進行分析。此方法包括利用N-糖苷酶F(PNGaseF)酶解mAb得到多糖，對多糖進行熒光標記（8-氨基吡-1,3,6-三磺酸三鈉鹽，ATPS），并利用CE串聯(lián)精確質量Q-TOFLC/MS進行分析?？贵w工程要點抗體糖基化的MS檢測結果抗體工程要點抗體質量分析相關的指導原則1-cde《人用單克隆抗體質量控制技術指導原則2003》

2-EP7《monoclonalantibodyforhumanuse》

3-ICHQ6B《測試方法和接受標準：生物技術和生物

藥品》

4-FDA《AssayDevelopmentforImmunogenicityTestingofTherapeuticProteins》

5-FDA《PointstoConsiderintheManufactureandTestingofMonoclonalAntibodyProductsforHumanUse》抗體工程要點抗體的生物學活性檢測分子水平的活性鑒定細胞水平的活性鑒定動物水平的活性鑒定：誘導、移植、基因修飾。阻斷活性殺傷腫瘤細胞活性：自發(fā)瘤、腫瘤細胞株、移植瘤。激活免疫細胞活性：原代培養(yǎng)的免疫細胞、白血病細胞株（THP-1、Jurkat細胞等）抗體工程要點實驗動物疾病模型抗體工程要點抗體的制劑研究凍干制劑液體制劑高濃度液體制劑抗體工程要點抗體制劑的輔料藥用輔料是指在制劑處方設計時，為解決制劑的成型性、有效性、穩(wěn)定性、安全性加入處方中除主藥以外的一切藥用物料的統(tǒng)稱。藥物制劑處方設計過程實質是依據(jù)藥物特性與劑型要求，篩選與應用藥用輔料的過程。藥用輔料是藥物制劑的基礎材料和重要組成部分，是保證藥物制劑生產(chǎn)和發(fā)展的物質基礎，在制劑劑型和生產(chǎn)中起著關鍵的作用。它不僅賦予藥物一定劑型。而且與提高藥物的療效、降低不良反應有很大的關系，其質量可靠性和多樣性是保證劑型和制劑先進性的基礎。輔料在制劑中作用分類有66種?？贵w工程要點抗體制劑的輔料海藻糖或蔗糖（凍干保護）磷酸鹽或者檸檬酸鹽緩沖系統(tǒng)Tween-20（助溶）組氨酸（保護劑）冷鏈運輸?shù)膯栴}抗體工程要點抗體制劑的穩(wěn)定性分析ProteinConcentration----------------------70.9mg/mL[63.0-77.0]

Potency----------------------100%[80-125%]:molecularandcelllevels

SE-HLC-----------------------MP:99.8%,HMW:0.2%,LMW:0.0%[MP≥99%]

CE-SDS,reduced----------------------HC+LC:98.9%,HC:66.8%LC:32.1%[LC+HC≥98%]

CEX-HPLC-----------------------MP:89.6%,Acidic:2.7%,Basic:7.7%[≥80%]

Osmolality-----------------------314mOsm/kg[300±50]

pH----------------------GlycolyzationAppearance-----------------------Report

Volume-----------------------1.2mL(average1.1525mL,n=5)[≥1mL]

Sub-visibleParticulate----------------------29particles/container≥10μm[nomorethan6000]

particles/container≥25μm[nomorethan600]

Sterility--------------------------------------Pass

BacterialEndotoxin-----------------------<0.2EU/mL[≤5.0]

aggregationContainerandstopperAccelerativestabilitytestLongtermstabilitytestImpuritytest抗體工程要點抗體的免疫治療方法概覽免疫脂質體抗體工程要點雙功能抗體和多功能抗體抗體工程要點Antibodydrugconjugation(ADC)第一代ADC：隨機偶聯(lián)第二代ADC：定位整合Ambrx公司：稀有氨基酸摻入RedwoodBiosciences:延長多肽鏈，偶聯(lián)藥物半胱氨酸偶聯(lián)抗體工程要點腫瘤的轉移和浸潤抗體工程要點Probody技術抗體工程要點抗EGFR抗體治療的副作用抗體工程要點CAR-T治療急性淋巴細胞白血病抗體工程要點CAR-T的定義ArtificialTcellreceptors(alsoknownaschimericTcellreceptors,chimericimmunoreceptors,chimericantigenreceptors(CARs))areengineeredreceptors,whichgraftanarbitraryspecificityontoanimmuneeffectorcell.Typically,thesereceptorsareusedtograftthespecificityofamonoclonalantibodyontoaTcell;withtransferoftheircodingsequencefacilitatedbyretroviralvectorsorlentivirusvectors.Thereceptorsarecalledchimericbecausetheyarecomposedofpartsfromdifferentsources.抗體工程要點CAR-T的技術原理抗體工程要點CAR-T治療技術的發(fā)展抗體工程要點CAR-T治療的臨床研究ALL（treatedwithalfaCD19-CD3zetaCARs-modifiedTcells)Bcelllymphoma(treatedwithalfaCD20-CD3zetaCARs-modifiedTcell)neuroblastomapatients(treatedwithScFv-CD3zetaCARs-modifiedTcell)抗體工程要點CAR-T治療的優(yōu)缺點HLA-independentrecognitionofantigen,broadapplicabilityformanypatientsandtherapiddeliveryofCAR-modifiedTcells.SuccessfulapplicationofthesemodifiedTcellswillrequiretheidentificationofthetumor-associatedantigen,thatareexpressedonlyontumorcells,therebyminimizingtheriskoftoxicity。significantreleaseofpro-inflammatorycytokines,pulmonarytoxicity,multi-organfailureandeventualdeathofthepatient.Socalled“cytokinestorm”。unlikeantibodiesagainsttumor-associatedantigens,thesecellsarenotclearedfromthebodyquickly抗體工程要點抗體藥物的臨床申報：臨床前研究i.臨床前研究。

1.藥物靶點的確認。

這個是所有工作的開始。只有確定了靶點，后續(xù)所有的工作才有展開的依據(jù)。

2.化合物的合成。

這個階段的工作主要負責新化合物的合成，現(xiàn)有化合物的結構改造和優(yōu)化，或者抗體的篩選。

3.活性化合物的篩選

不是所有合成出來的化合物或者抗體都能有理想的活性，在這個階段需要通過生物實驗手段篩選出初步有活性的化合物用作備選。這些化合物叫先導化合物（lead）。得到的活性數(shù)據(jù)可以結合化合物結構得到初步的構效關系分析。構效關系可以有效的指導后續(xù)的化合物結構優(yōu)化。這一步工作主要在細胞實驗層面展開。

4.評估藥物的藥理作用，安全性與毒性，藥物的吸收、分布、代謝和排泄情況（ADME）。

這部分的實驗需要在動物層面展開。細胞實驗的結果和活體動物實驗的結果有時候會有很

大的差異。這一步的目的是確定藥物的有效性與安全性（GLP中心）。5.制劑的開發(fā)：制劑后藥物的吸收、分布、代謝和排泄情況，制劑的穩(wěn)定性試驗，分析數(shù)據(jù)。6.連續(xù)三批生產(chǎn)的藥品，申報文件的準備。

抗體工程要點抗體藥物的申報：I期臨床試驗在新藥開發(fā)過程中,將新藥第一次用于人體以研究新藥的性質的試驗,稱之為Ⅰ期臨床試驗.即在嚴格控制的條件下,給少量試驗藥物于少數(shù)經(jīng)過謹慎選擇和篩選出的健康志愿者(對腫瘤藥物而言通常為腫瘤病人),然后仔細監(jiān)測藥物的血液濃度\排泄性質和任何有益反應或不良作用,以評價藥物在人體內的性質.Ⅰ期臨床試驗通常要求健康志愿者住院以進行2