醋酸纖維薄膜電泳法分離血清蛋白

醋酸纖維薄膜電泳法分離血清蛋白學(xué)號(hào)：200900140157班級(jí)：09生科3班姓名：俞華軍時(shí)間：2011/03/27一．實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.掌握醋酸纖維薄膜電泳法分離蛋白質(zhì)的原理和方法。2.掌握電泳儀的使用方法。二．實(shí)驗(yàn)原理蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)。在pH小于其等電點(diǎn)的溶液中，蛋白質(zhì)為正離子，在電場中向陰極定向移動(dòng)，在pH大于其等電點(diǎn)的溶液中，蛋白質(zhì)為負(fù)離子，在電場中想陽極移動(dòng)。血清中含有書中蛋白質(zhì)，它們所具有的可解離基團(tuán)不同，在同一pH值得溶液中，所帶凈電荷不同，因此在電場中的移動(dòng)速度不同，故可利用電泳法將它們分離。血清中含有白蛋白、α—球蛋白、β—球蛋白、γ—球蛋白等，各種蛋白質(zhì)由于氨基酸組分、立體構(gòu)象、相對(duì)分子質(zhì)量、等電點(diǎn)及形狀不同（見表一），在電場中遷移速度不同，由表一可知，血清中5中蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)大部分低于pH7.0，所以在緩沖液（pH8.6）中，它們都電離成負(fù)離子，在電場中向陽極移動(dòng)。表一人體血清中各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)及相對(duì)分子質(zhì)量蛋白質(zhì)名稱等電點(diǎn)（pI）相對(duì)分子質(zhì)量/Mr白蛋白4.8869000α1—球蛋白5.06200000α2—球蛋白5.06300000β—球蛋白5.1290000—150000γ—球蛋白6.85—7.50156000—300000在一定范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)的含量與結(jié)合的染料量成正比，故可將蛋白質(zhì)區(qū)帶剪下，分別用0.4mol/L的氫氧化鈉溶液浸洗下來，進(jìn)行比色，測定其相對(duì)含量。也可以將染色后的薄膜直接用光密度計(jì)掃描，測定其相對(duì)含量。腎病、彌漫性肝損害、肝硬化、原發(fā)性肝癌、多發(fā)性骨髓瘤、慢性炎癥、妊娠等都可以使血清中蛋白含量下降，腎病時(shí)α1、α2、β—球蛋白升高，γ—球蛋白降低。肝硬化時(shí)α2、β—球蛋白降低，而α1、γ—球蛋白升高。所以，可以測定人體血清中蛋白含量的值來診斷一些疾病。三．實(shí)驗(yàn)器材試劑：巴比妥—巴比妥鈉緩沖液、95%乙醇、無水乙醇、冰醋酸、染色液用品：醋酸纖維薄膜（x2）、人血清、培養(yǎng)皿（x3）、載玻片、蓋玻片、電吹風(fēng)、吸管5ml（x1）、2ml（x2）、直流穩(wěn)壓電泳儀、電泳槽、鑷子、濾紙、燒杯100ml（x2）、錐形瓶300ml（x2）四．實(shí)驗(yàn)步驟1.薄膜浸泡選擇可用的醋酸纖維薄膜（2cmx8cm）兩條，浸于緩沖液中30min以上；2.電泳儀準(zhǔn)備連接號(hào)電泳儀的線路，檢查電路是否可用，檢查完畢后往電泳槽中導(dǎo)入電解液，即巴比妥—巴比妥鈉緩沖液；3.點(diǎn)樣（1）將浸泡30min以上的醋酸纖維薄膜弄鑷子輕輕取出，將薄膜一面平放在干凈濾紙上，幾秒后，把薄膜翻過來，把另一面平放在濾紙上，吸去多余的緩沖液，吸完后把薄膜平放于干凈的玻璃上，準(zhǔn)備點(diǎn)樣；（2）取幾滴人血清樣品于載玻片上，根據(jù)薄膜大小裁剪蓋玻片大小，然后用蓋玻片輕輕蘸取血清樣品，然后輕輕與薄一端1.5cm處接觸，待薄膜上有一條清晰的血清痕跡即可點(diǎn)樣結(jié)束；4.電泳（1）用鑷子夾住薄膜兩端，并把薄膜拉直，輕輕放到電極橋上，點(diǎn)樣端為陰極，并用鑷子壓薄膜與電極橋接觸的兩端，使其接觸緊密；（2）平衡10min后打開電源，調(diào)至90V，預(yù)電泳10min，隨后再把電壓調(diào)至110V，電泳50min—1h；5.染色電泳完畢后，將薄膜浸于染色液中9min—10min6.漂洗（1）配制漂洗液：45ml95%乙醇+5ml冰乙酸+50ml蒸餾水；（2）把染色完后的薄膜弄鑷子取出，用漂洗液漂洗至背景為灰藍(lán)色（大概3—4次），漂洗結(jié)束后把薄膜貼于干凈的玻璃上，用吹風(fēng)機(jī)吹干。7.透明和取帶（1）配制透明液：以無水乙醇：冰乙酸=7:3的比例配20ml；（2）薄膜用吹風(fēng)機(jī)吹干后，浸入透明液中，值背景為透明為止，大概10min左右，取出薄膜并貼于干凈玻璃上，用吹風(fēng)機(jī)吹干后輕輕從薄膜上揭下蛋白質(zhì)帶。五．實(shí)驗(yàn)結(jié)果記錄與處理六．實(shí)驗(yàn)分析1.薄膜浸泡必須30min以上，否則會(huì)影響電泳效果，取出薄膜吸取過多的緩沖液時(shí)，要注意不能長久放置于濾紙上，這樣會(huì)使?jié)B透于薄膜內(nèi)的緩沖液被吸出來，使電泳時(shí)蛋白質(zhì)不能完全分開，影響最后結(jié)果，而本次實(shí)驗(yàn)中，蛋白質(zhì)區(qū)帶區(qū)分并不明顯，可能與此有關(guān)。2.連接電泳儀線路時(shí)要注意正負(fù)極，用前檢查電泳儀是否可用，在打開電源之前一定要把電壓旋鈕調(diào)至零，否則一打開電源，瞬間電壓過高會(huì)燒壞儀器。3.在往電解槽中加入電極液時(shí)要注意電極液高度不能超過紅色劃線，且電極槽液面要保持一致，同時(shí)要漫過電橋，否則無法形成回路，不能進(jìn)行電泳。4.點(diǎn)樣時(shí)要注意只需輕輕的點(diǎn)一下即可，有一條清晰的血清痕跡即可，且要注意不要距端口太近，而如果重復(fù)點(diǎn)樣，重復(fù)點(diǎn)樣會(huì)導(dǎo)致電泳結(jié)果不清晰，條帶混雜，本次實(shí)驗(yàn)部分條帶出現(xiàn)這種情況，可能是這個(gè)原因。5.在把薄膜放到電橋上時(shí)，要注意點(diǎn)樣區(qū)不能接觸到電橋上的濾紙，且點(diǎn)樣區(qū)放在陰極端，還有，薄膜必須要拉直，中間部分不能與電解槽接觸。6.配制漂洗液、透明液利用冰乙酸時(shí)要注意不能接觸到手、皮膚或衣物，因?yàn)楸宜嵊袕?qiáng)烈的腐蝕性，同時(shí)也要注意不可聞其氣味，因?yàn)楸宜釟馕都捌錆饬?，?duì)鼻黏膜有損害；染色液用完要注意回收。7.漂洗時(shí)要注意時(shí)間產(chǎn)度，背景色變?yōu)榛宜{(lán)色即可，過度漂洗會(huì)使蛋白質(zhì)條帶也被洗掉，影響最后實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。8.進(jìn)行透明時(shí)也要注意時(shí)間長度，時(shí)間過長也會(huì)引起蛋白