生物化學實驗指導2

實驗室規(guī)則

歡迎同學們到醫(yī)學分析與檢測實驗室來！同學們在醫(yī)學

分析與檢測實驗方面要取得好成績，在很大程度上，取決于

對這些專業(yè)實驗技術的熟練掌握和對實驗原理的深入了解。

應該做到：

1.遵守實驗紀律，按時到達實驗室，不得遲到或早退。

實驗中途因故需外出時應向任課教師請假。

2.進入實驗室之前要換好白大衣及拖鞋。

3.保持實驗室安靜，不許在實驗室內(nèi)大聲喧嘩及隨意走

動。

4.必須嚴肅認真地進行實驗。實驗期間不得進行任何與

實驗無關的活動。

5.實驗室內(nèi)各組儀器及器材由各組自已使用，不得互相

調(diào)換。要愛護儀器、標本和設備。如遇儀器損壞或不靈，應

及時報告任課教師，以便修理或更換，不要自行亂修。損壞

器材或設備者應按有關規(guī)定進行賠償。

6.注意節(jié)約實驗材料、藥品和水、電等。

7.實驗操作過程中凡遇產(chǎn)生煙霧或有毒性腐蝕性氣體

時，應放在通風柜內(nèi)進行。如果實驗室內(nèi)無此種設施，則必

須注意及時打開窗戶通風。

8.以移液管取用試劑應使用橡皮吸球。對于劇毒或有腐

蝕性試劑的取用更要注意安全，應使移液管的尖湍固定在液

面下適當?shù)奈恢茫苑涝噭┻M入吸球。如果不慎已吸入球內(nèi)，

則應隨時洗凈晾干。

9.乙醛、乙醇、丙酮、氯仿等易燃試劑應放在遠離火源

處，并不可直接放在火源上蒸煮，以防引起火災。

10.在分子生物學實驗中，接觸苯酚、氯仿、溟乙錠等

有毒試劑時應戴手套，以防止腐蝕，傷害皮膚。

11.保持實驗室內(nèi)清潔整齊。實驗結束后，各組必須認

真清理各自的實驗臺面，將器材清洗后點清數(shù)目，然后擺放

整齊。班級值日生負責清掃室內(nèi)衛(wèi)生，關好水、電開關和門、

窗等，經(jīng)教師允許后方可離開實驗室。

12.動物尸體、紙片及實驗廢物應放到指定地點，不得

隨意亂丟。

13.有不遵守上述要求者，任課老師將終止其實驗，并

取消其當堂實驗成績。

實驗應急處理（實驗室意外事故的急救）

1.皮膚灼傷處理皮膚不慎被強酸、溟、氯等物質灼傷

時，應即時用大量自來水沖洗，然后用5%碳酸氫鈉液洗滌。

2.強酸液進入口內(nèi)的處理應立即用清水或0.lmol/L

氫氧化鈉液漱口，再服用氧化鎂、鎂乳等和牛奶混合劑，但

不宜服重碳酸鈉液，以免因和酸作用而產(chǎn)生過量氣體加劇對

胃的刺激。

3.強堿溶液進入口內(nèi)的處理，立即用大量清水或5%硼酸

液漱口，再服用適量5%醋酸。

4.酸、堿等化學試劑濺入眼內(nèi)的處理先用自來水或蒸

儲水沖洗眼部，如濺入酸類物質則可再用5%碳酸鈉仔細洗；

如系堿類物質，可用2%硼酸沖洗。然后滴1—2滴油性物質,

使起滋潤保護作用。

5.被電擊的處理實驗室內(nèi)電器設備多，如某項設備漏電,

使用時則有觸電危險。如有人不慎觸電，首先應立即切斷電

源。在沒有斷開電源時絕不可赤手去拉觸電者，宜迅速用干

木棒、塑料棒等絕緣物把導電物和觸電者分開。然后對觸電

者進行搶救。嚴重者應立即送醫(yī)院。

6.酸、堿等化學試劑濺灑在衣物鞋襪上的處理強酸或強

堿類物質灑在衣服鞋襪上，應立即脫下用自來水浸泡沖洗；

濺灑物如系苯酚類物質，而衣服又是化纖織物，則可先用60

—70%酒精擦洗被濺處，然后再將衣物放清水中浸泡沖洗。

第一章：

第一章蛋白質測定、分離、鑒定技術

實驗一雙縮胭(Biuret)法測定蛋白質含量

【目的要求】

掌握雙縮胭法測定蛋白質含量的原理和方法。

【實驗原理】

蛋白質分子中的肽鍵(-CO-NH-)在堿性溶液中與C/+形

成紫紅色絡合物，在540nm波長有特定吸收峰，所產(chǎn)生的顏

色深淺與蛋白質濃度成正比，依此原理可測蛋白質含量。由

于此反應和兩個尿素分子縮合后生成的雙縮胭

(H2N-OC-NH-CO-NH2)在堿性溶液中與銅離子作用生成紫紅色

的反應相似，故稱雙縮服(Biuret)反應。

【試劑】

1.雙縮版試劑：取CuS04-5乩0(C.P.)1.5g和酒石酸鉀

鈉(NaKC^Oe?4H20)(C.P.)6.Og以少量蒸儲水溶解，再加

2.5mol/LNaOH溶液300mLKI1.0g,然后力口水至1000ml。

棕色瓶中避光保存。長期放置后若有暗紅色沉淀出現(xiàn)，即不

能使用。

2.蛋白標準液：取牛血清白蛋白，用生理鹽水稀釋至濃

度10g/L。

【器材】

1.試管：15X150mm試管7只

2.lml,5ml移液管

3.坐標紙

4.722(721)分光光度計

【操作步驟】

一、標準曲線法

空白管12345溜定管

盤白標準液lOg/Uml)一0.10.20.30.40.5—

生理鹽水(ml)0.50.40.30.20.1一0.4

待測樣品(ml)——0.1

雙縮麻試劑(ml)3.03.03.03.03.03.03.0

相當?shù)鞍踪|(g/L)01020304050

混勻，37℃水浴20分鐘，冷卻至室溫，在分光光度計波長

540nm處，用一空白管校正吸光度為零，讀取各管吸光度值。

1?5為標準曲線管，測得吸光度后，以吸光度為縱坐標，蛋

白質濃度為橫坐標繪制標準曲線。測得測定管的吸光度，對

照標準曲線求得蛋白質濃度。

二、標準管法

取3支試管，按下表操作:

加入物(ml)空白管(B)標準管(S)測定管(U)

血清樣品——0.05

標準液—0.05—

蒸儲水0.05——

雙縮胭試劑(應用3.03.03.0

試劑)

混勻，37℃恒溫水浴lOmin,540nm波長，以空白管調(diào)零,

測定各管吸光度。

計算：樣品中總蛋白含量(g/L)=&XCs

As

【參考值】60?80g/L

【注意事項】

1.雙縮胭試劑中，加入酒石酸鉀鈉，Ci?+形成穩(wěn)定的絡

合銅離子，以防止CUSOL5H2O不穩(wěn)定形成Cu(OH)2沉淀。酒

石酸鉀鈉與CuS04?5乩0之比不低于3：1,加入KI作為抗氧

化試劑。

2.雙縮服試劑要封閉貯存.防止吸收空氣中的二氧化碳。

3.本法各種蛋白質的顯色程度基本相同，重復性好，幾

乎不受溫度影響，唯一缺點是靈敏度較低。

4.黃疸血清.嚴重溶血對本法有明顯干擾。

【問答題】

1.雙縮胭法測定蛋白質的原理是什么?其他還有什么方

法測定蛋白質的含量？

2.請用雙縮胭法，設計一個測定蛋白質含量的定量方法

（除標準曲線法外）。

實驗二蛋白質紫外分光測定法

【原理】

由于蛋白分子中酪氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共趣雙

鍵，因此蛋白質具有吸收紫外線的性質，吸收高峰在280nm

波長處。在此波長范圍內(nèi)，蛋白質溶液的光吸收值（A280）

與其含量呈正比關系，可用作定量測定。

由于核酸在280波長處也有光吸收，對蛋白質的測定有

干擾作用,但核酸的最大吸收峰在260nm處,如同時測定260nm

的光吸收，通過計算可能消除其對蛋白質測定的影響，因此

溶液中存在核酸時必須同時測定280nm及260nm之光密度，

方可通過計算測得溶液中的蛋白質濃度。

利用紫外線吸收法測定蛋白質含量的優(yōu)點是迅速、簡便、

不消耗樣品，低濃度鹽類不干擾測定。因此，在蛋白質和酶

的生化制備中（特別是在柱色譜分離中）廣泛應用。此法的

缺點是（D對于測定那些與標準蛋白質中酪氨酸和色氨酸含

量差異較大的蛋白質，有一定的誤差；（2）若樣品中含有喋

吟、喀咤等吸收紫外線的物質，會出現(xiàn)較大的干擾。

不同蛋白質和核酸的紫外吸收是不同的，即使經(jīng)過校正，

測定結果也還存在一定的誤差。但可作為初步定量的依據(jù)。

【操作】

一、標準曲線法

1.標準曲線的繪制

2.樣品測定

取待測蛋白質溶液1血，加入蒸餌水31nL搖勻，按上述方

法在280nm波長處測定光吸收值，并從標準曲線上查出經(jīng)稀

釋的待測蛋白質的濃度。

二、其他方法

(1)將待測蛋白質溶液適當稀釋，在波長260nm和280nm

處分別測出A值，然后利用280nm及260nm下的吸收差求出

蛋白質濃度。

計算

蛋白質濃度(mg/ml)=1.45A280-0.74A26O

式中Azso和A260分別是該溶液在280nm和260nm波長下測得

的光吸收值。

實驗三考馬斯亮藍法測定蛋白質含量

【基本原理】

考馬斯亮藍G-250在酸性溶液中的游離狀態(tài)呈紅褐色,與蛋

白質結合呈藍色，且最大吸收波長從465nm轉變?yōu)?95nll1。蛋

白質溶液在一定濃度范圍內(nèi)，與595nm的光密度值成正比，可

用于蛋白質的比色定量。

【器材】

721分光光度計、試管、吸管。

【試劑】

1.蛋白質標準液(250ug/ml)：小牛血清白蛋白251ng

加生理鹽水至100ml。

2.考馬斯亮藍G-250：考馬斯亮藍G-250100mg,加195%

乙醇501nL加185%(W/V)H3PoJOOml,加蒸儲水稀釋至1000ml,

置棕色瓶過夜，用二層濾紙過濾。

【操作步驟】

取三支試管，編號,垓讀蝶作：

B(空白管)S(標

準管)U(樣品管)___________________________

生理鹽水(ml)0.10

蛋白標準液(250ug/ml)(ml)—

0.10—

待測樣品(ml)—

0.10—

考馬斯亮藍試劑(ml)5.00

5.005.00

充分混勻各管溶液。5分鐘后用595nin波長比色，以空白

管調(diào)零，讀取標準管及樣品管的吸光度值(As、Au)o

【計算】

待測液蛋白濃度=—X蛋白標準液濃度X稀釋倍數(shù)

As

如用標準曲線法可用牛血清清蛋白配成0.1m中含蛋白質

10Pg、20pg、40pg、60Rg、80iig的一系列標準液，上

述各管各加考馬斯亮藍試劑5.0mL5分鐘后，在595nm波長比

色，讀取各管光密度值。以光密度值為縱坐標，以蛋白質含

量為橫坐標，繪制標準曲線。根據(jù)同樣條件測得的待測液的

光密度值，可從標準曲線中查得蛋白質含量，另外也可用蛋

白質濃度已知的人血清用生理鹽水適當稀釋成一系列標準液,

制備標準曲線。

【注】本法待測液0.1ml中含蛋白質10~8011g為宜，如

果樣品蛋白質濃度過高，可用生理鹽水適當稀釋后再測。

【思考題】用標準曲線法及標準管法測定蛋白質有何區(qū)

別與意義。

實驗四血清Y-球蛋白的層析分離

【基本原理】

利用硫酸鍍分段鹽析將血清中的丫-球蛋白與清蛋白、a-

球蛋白、球蛋白等加以分離，再用凝膠過濾法除鹽即可

得到比較純的丫-球蛋白。

【器材】

玻璃層析柱(1.OX12cm)、圓形尼龍布(直徑1.5cm)、凹

孔白瓷板、試管、離心管、燒杯、滴管、螺旋夾等。

【試劑】

1.血清

2.磷酸鹽緩沖液-生理鹽水(PBS)：用O.Olmol/L磷酸鹽

緩沖液配制的0.9%NaCl溶液。配制方法如下：

0.2mol/L｝混勻后稀釋20倍

Na2HP0472ml

0.2mol/LNaH2P。428ml

3.pH7.2飽和硫酸鐵溶液：用氨水將飽和硫酸鍍?nèi)?/p>

液調(diào)到pH7.2

4.葡聚糖凝膠G-50(SephadexG-50)

5.納氏試劑(Nessler)sreagent)：

⑴儲存液：于500ml錐形瓶內(nèi)加碘化鉀(KI)150g,蒸

鐳水100ml,溶解劭口碘(&)110g,振搖至溶解后再加汞(Hg)

150g,連續(xù)振搖7~15分鐘。在此過程中，碘的顏色漸淺并發(fā)

熱，可在冷水浴中連續(xù)振搖到溶液由棕紅色(碘色)轉變成淺

黃綠色(碘化鉀汞色)為止。將上清液倒入2升量筒內(nèi)，并用

蒸儲水洗錐形瓶內(nèi)沉淀物數(shù)次，洗液全部倒入量筒內(nèi)，再加水

至2升后混勻。

⑵應用液：取儲存液150ml加10%Na0H溶液700ml.蒸

儲水150nli混勻，放棕色瓶內(nèi)靜置數(shù)日后取上清液使用。此

液要求酸堿度適宜。即與1.ONHC1滴定時需此試劑H.0?

11.5ml使酚醐指示劑變色為宜，否則需加以糾正。

6、雙縮胭試劑：

CuS04-5H200.39g,酒石酸鉀鈉1.2g分別溶于50ml蒸

儲水中，力口2.5NNaOH60mLKI0.2g,混勻后力口水至200ml。

【操作步驟】

1.鹽析

⑴血清1ml放入離心管中，加入磷酸鹽緩沖液-生理鹽

水（PBS）1ml混勻逐滴加入pH7.2飽和硫酸鐵溶液1ml,邊加

邊搖勻。靜置30分鐘后，離心3000rpm10分鐘，傾上清液

（上清中主要含清蛋白）。

⑵將離心管中的沉淀用1mlPBS攪拌溶解，再逐滴加

入pH7.2飽和硫酸鍍?nèi)芤?.5mL邊加邊搖勻。靜置30分鐘

后，離心3000rpm10分鐘。傾上清液（上清中主要含a、p

球蛋白）。

2.脫鹽

⑴裝柱：稱取葡聚糖凝膠G-501g,放入100ml燒杯中，

加蒸儲水50ml,微火煮沸1小時（注意需隨時補充蒸儲水以

免蒸干）。冷卻后傾棄上清液。再加入PBS10ml,用玻璃棒

輕輕攪拌，傾入有尼龍布堵住下口的玻璃層析柱內(nèi)。于柱下口

接一小段膠管,待全部凝膠傾入柱內(nèi)且液面接近凝膠上表面時

將出口膠管夾緊。為使凝膠表面平坦，可用手指輕輕彈動層析

柱，然后小心放松調(diào)節(jié)夾，使液體緩緩流出8?10滴/分。同

時檢查流出液中是否有NH；存在，若有則需用PBS洗至流出液

中無NIV為止。當液面恰好與凝膠表面重合時，立即將出口膠

管夾緊，裝柱即結束（注意：液面不得低于凝膠表面，且柱內(nèi)

不得有氣泡）。

（2）脫鹽：向裝有丫-球蛋白的離心管內(nèi)加入PBS10滴，

用玻璃棒攪拌使之溶解。再用乳頭吸管吸出Y-球蛋白液，加

到層析柱內(nèi)凝膠表面。然后稍打開流出口，使流速為8?10

滴/分。待丫-球蛋白液全部進入凝膠柱內(nèi)時，再用乳頭吸管小

心加入PBS約1cm高，待大部分液體進入凝膠柱后，再繼續(xù)加

PBS直至洗脫完畢（加液時注意不要沖擊凝膠表面）。在整個

洗脫過程中不能讓液面降至凝膠面以下。

（3）收集：準備12只小試管用于收集流出液。從加樣后開

始，每管收集lmlo收集12管后繼續(xù)用PBS洗至無NH；時，

停止洗脫?；厥漳z和尼龍布等。

（4）檢測：準備反應板兩塊。將12管收集液各取1滴分別放

入反應板的12個凹孔。一塊板的各孔內(nèi)加納氏試劑1滴，有

NH：者呈黃色至橙色。可用+、一號表示有無呈色或顏色深淺。

再向另一塊板的各孔內(nèi)加雙縮胭試劑1滴，有蛋白者呈藍紫

色。亦可用+、一號表示有無呈色或顏色深淺。將呈色最深

的一管收集液保留供實驗3使用。利用實驗3醋酸纖維素薄

膜電泳檢測本次實驗所提Y-球蛋白的純度。

實驗五醋酸纖維素薄膜電泳分離血清蛋白質

【基本原理】

帶電粒子在電場中向著與其電性相反方向移動的現(xiàn)象稱為

電泳。蛋白質為兩性電解質，在不同pH條件下，其帶電情況

不同。在等電點時，蛋白質為兼性離子，其實效電荷為零，

在電場中不發(fā)生泳動；蛋白質分子在pH小于其等電點的溶液

中，呈堿式解離，帶正電荷，在電場中向負極泳動；蛋白質

分子在pH大于其等電點的溶液中，呈酸式解離，帶負電荷，

在電場中向正極泳動。泳動速度除與電場強度和溶液性質有

關外，主要決定于分子顆粒的電荷量以及分子的大小與形狀。

電荷較多、分子較小的球狀蛋白質泳動較快。

醋酸纖維素薄膜電泳是利用醋酸纖維素薄膜做固體支持物

的電泳技術。與紙上電泳相似，是在其基礎上發(fā)展起來的。

該電泳技術具有比紙電泳電滲小、分離速度快、樣品用量小

（可少于10微升）、而分辨率高和分離清晰等優(yōu)點。因此，

從1956年Kohn首先應用此法以來，紙上電泳已逐漸被取代。

醋酸纖維素薄膜電泳的操作方法除比瓊脂電泳、淀粉膠電泳

和聚丙烯酰鍍凝膠電泳簡便外，還有一個顯著優(yōu)點，即染色

后的薄膜可用乙醇和冰醋酸溶液浸泡透明，透明后的薄膜便

于保存和定量分析。

醋酸纖維素薄膜可用于一般血清蛋白電泳、脂蛋白電泳、

同工酶電泳、甲胎球蛋白電泳（AFP）、血紅蛋白電泳以及免

疫電泳等。

本實驗以醋酸纖維素薄膜作為支持物，于浸有緩沖液的薄

膜一端加微量血清，膜兩端連接于緩沖液。所用緩沖液的pH

為8.6,大于血清中各種蛋白質的等電點（見注）。因此，各

種蛋白質皆帶負電荷，在電場中向正極方向泳動，因泳動速

度不同而被分離。依次為清蛋白A、a1、a28和丫-球蛋

白，將蛋白質染色后，可按染色區(qū)帶位置進行定性觀察，也

可對各條色帶進行定量測定。

【器材】

電泳儀、醋酸纖維素薄膜（2X8cm）、點樣板、鉛筆、尺

【試劑】

1.巴比妥緩沖液（pH8.6,離子強度0.06）：巴比妥鈉

12.76g,巴比妥1.66g加蒸鐳水數(shù)百毫升,加熱溶解后再補加

蒸儲水至1000ml,混勻。

2.染色液：氨基黑10B0.5g,溶于甲醇50ml中，再加

冰醋酸10mL蒸饋水40ml混勻。

3.漂洗液：甲醇（或95%乙醇）45ml,冰醋酸5ml,

蒸儲水50ml混勻。

4.洗脫液：0.4NNaOH溶液

5.透明液：95%乙醇20mL冰醋酸5ml混勻。

【基本操作】

1.電泳槽內(nèi)放適量的緩沖液，于兩端的液槽間放一充滿

緩沖液的連通管，經(jīng)過一定時間使兩側液面達到平衡后，取

下連通管。在電泳槽的兩側的支持板上分別用四層濾紙（或

紗布）搭橋，即使其一端搭到支持板上，另一端浸入緩沖液

中。在醋酸纖維薄膜（2X8cm）的無光澤面距一端2cm處,，

用鉛筆畫一橫線（與此端平行），作為準備點樣的位置，稱為

點樣線或者是起點線。把膜放進PH8.6的巴比妥緩沖溶液中

浸泡數(shù)小時使膜完全浸透。

2.點樣

把浸透緩沖液的醋酸纖維素膜取出，夾到濾紙中，輕撫使

吸去多余的緩沖液，使膜的無光澤面向上，把微量樣品［血清、

丫-球蛋白提純液、A液、B液等（見實驗二）］分別均勻地涂

另于蓋玻片的一端，把玻片豎直輕貼到膜的點樣線上，使樣

品吸入膜內(nèi)。注意應使點樣線成為粗細一致的直線狀。

3.電泳

把膜放進電泳槽內(nèi)，注意要把膜的點樣面即無光澤面向下,

點樣端靠近陰極側，把膜的兩端緊貼到內(nèi)側支持板上搭橋的

濾紙或沙布上，把膜擺平拉直，蓋好電泳槽蓋。

檢查電泳槽電極的連接正確無誤后通電，調(diào)節(jié)電流按總膜

寬計算，每cm寬給電流0.4-0.6mA,通電時間45?60分鐘。

4.染色

關閉電源后立即將膜取出，放入染色液中浸染3?5分鐘,

然后移放漂洗液中漂洗數(shù)次，至蛋白條帶清晰，本底無色為

止，取出薄膜用濾紙吸干。

5.定量

把漂洗干凈的膜夾在濾紙中吸干，剪下各蛋白區(qū)帶及一段

平均大小的空白區(qū)，分別依次放入試管中，標清管號，向清

蛋白管加0.4NNaOH10ml,其余各管加0.4NNaOH5ml,輕

輕振搖，使著色完全洗脫于溶液中，用620nm波長比色，記

取各管光密度值。然后計算各組分相對百分含量。計算方法

如下：

設測得各管光密度值為DA、Da】、Da2、6、DY,則光

密度值總和DT=2DA+Da1+Da2+DB+DY。

Da\

清蛋白％=奇蟲。。，"蛋白％xlOO,其余類推，可分

DT

別求出各蛋白所占總蛋白的百分數(shù)。

【注】

1.血清蛋白各組分的等電點、分子量及其在正常血清中

的百分含量如下表：

等電點分子量

占總蛋白的%

清蛋白4.6469,000

57?72

a1球蛋白5.06200,000

2?5

a2球蛋白5.06300,000

4?9

B球蛋白5.1290,000—150,000

6.5?12

Y球蛋白6.85~7.3156,000—950,000

12?20

2.血清蛋白電泳有一定的臨床意義。例如肝硬化時清蛋

白明顯降底，而Y球蛋白可增高2倍；腎病綜合癥和慢性腎

小球腎炎可見到清蛋白降低，a和B球蛋白增高。從電泳譜

上亦可查出某些異常，例如多發(fā)性骨髓瘤病人血清，有時在

B與Y球蛋白之間出現(xiàn)巨球蛋白；原發(fā)性肝癌病人血清在清

蛋白與a?球蛋白之間可見到甲胎蛋白。

【思考題】

1.電泳后，泳動在最前面的是何種蛋白質？各譜帶為何

種成份？請分析原因。

2.電泳時，點樣端置于電場的正極還是負極，為什么？

實驗七聚丙烯酰胺凝膠圓盤電泳分離血清蛋白

【基本原理】

1.聚丙烯酰胺的合成和結構

聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺(Acrylamide簡寫為Acr)

和交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺(N,N1-methylene-bisacrylamide,

簡寫B(tài)is)在催化劑的作用下，聚合交聯(lián)成含有酰胺基側鏈的

脂肪族大分子化合物。

2.催化劑

過硫酸胺-四甲基乙二胺(N、N、N、N-Tetramethyl—

thylenediamine,簡寫TEMED)系統(tǒng),其中過硫酸錢是引發(fā)

劑。它在光照射下裂解成帶有自由基的硫酸錠，

通過自由基的傳遞，使丙烯酰胺成為自由基，發(fā)動聚合反

應，TEMED是加速劑，加快引發(fā)劑釋放自由基的速度。

(NH4)裊&?(NH4)2SO4

聚丙烯酰胺凝膠具有三維網(wǎng)狀結構，能起分子篩作用。用

它作電泳支持物，對樣品的分離不僅取決于各組分所帶電荷

的多少，也與分子大小有關。凝膠網(wǎng)孔的大小主要受成膠物

的總濃度及Acr和Bis的比例的影響。一般電泳采用成膠物

質總濃度為7.5%,此濃度稱為標準凝膠濃度。如果改變總膠

濃度，也應相應改變Acr和Bis的比例。

總膠濃度為5%以下時，Acr：Bis在20左右。

總膠濃度為5?10%時，Acr：Bis在40左右。

總膠濃度為5?20%時，Acr：Bis在125?200左右。

實驗中應根據(jù)分子量大小，選擇合適的凝膠總濃度和Acr

和Bis的比例。

分子量與凝膠濃度的關系

分子量范圍凝膠濃度(%)

蛋白質〈IO"20-30

1-4X10415-20

4X1O4-1X1O510-15

1?5X105

5-10

>5X9

2-5

核酸＜及15-20

IO,?及5-10

l~2X1052-5

2.不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠圓盤電泳的三種效應

(1)濃縮效應。不連續(xù)園盤電泳一般是在小玻璃管內(nèi)進

行的。把三種性質不完全一樣的聚

丙烯酰胺凝膠重疊起來。如圖4-3樣品股

所示，上層為樣品膠，中間為濃縮《間隔般，蟲抄UZ的、

膠，這兩層膠的凝膠濃度為3%是大

孔膠，應用Tris-HCL緩沖液，其分離酸(電沫殷》

PH6.7o下層是分離膠，此層凝膠總

濃度為7.5%,是小孔膠，也用

Tris-HCL緩沖液，pH8.90上下電

極槽緩沖液是Tris-甘氨酸緩沖液，pH=8.3。通電后，向陽極

泳動的陰離子有三種，即C1,蛋白質陰離子(Pr。和甘氨

酸陰離子(Gly-)0在樣品膠及濃縮膠pH=6.7的環(huán)境下HC1

全部電離為Cr,甘氨酸僅極少部分電離為Gly一（甘氨酸等

電點pI=6.0）,一般酸性蛋白質也解離為陰離子。這樣，C1-

泳動最快（稱快離子），Gly-泳動最慢（稱慢離子），蛋白質介

于其間。通電后，快離子很快超過蛋白質離子和Gly,泳動

到最前面。于是，快慢離子之間形成一個離子濃度低的區(qū)域,

即低電導區(qū)域，低電導區(qū)域有較高的電壓梯度。電壓梯度驅

動慢離子加速泳動。這樣，當快慢離子移動速度相等時，就

建立一個不斷向陽極移動的界面。Pr一的泳動速度恰好介于

快慢離子之間。因而被擠壓在快慢離子之間形成一條窄帶。

這種濃縮作用可使蛋白質濃縮數(shù)百倍。血清蛋白在紙上電泳

和醋酸纖維素薄膜電泳上僅可分成5?7個組分。而在聚丙烯

酰胺凝膠電泳上則可以分為20-30個成分。

（2）電荷效應：蛋白質樣品在界面處被濃縮成一狹窄的

高濃度蛋白質區(qū)，但由于每種蛋白質分子所帶有效電荷不同,

因而泳動率也不同，因此各種蛋白質就按泳動率快慢順序排

列成一個一個圓盤區(qū)帶。在進入分離膠時，電荷效應仍起作

用。

（3）分子篩效應：當被濃縮的蛋白質樣品從濃縮膠進入

分離膠時，pH值和凝膠孔徑突然改變，選擇分離膠的pH值

8.9接近甘氨酸的Pka值（9.7?9.8）,這樣慢離子的解離度

增大，因而它的有效泳動率也增加。此時慢離子的有效泳動

率超過了所有蛋白質的有效泳動率。這樣，高電勢梯度不存

在了，各種蛋白質僅會由于其分子量或構型的不同，在一個

均一的電勢梯度和pH條件下通過一定孔徑的分離膠時所受阻

滯的程度不同，表現(xiàn)的泳動率的不同而被分開。

【器材】

電泳儀、垂直板電泳槽、進樣器、乳頭吸管、50ml小燒

杯

【試劑】

1.30%丙烯酰胺溶液：丙烯酰胺29.2g,甲叉雙丙烯酰胺

0.8g,加水至100mL棕色瓶4℃保存。

2.1.5mol/LTris-HCl分離膠緩沖液pH8.8（4x）：取

18.15gTris,用1MHC1調(diào)pH至&8,加水至100ml,4℃保

存。

3.0.5mol/LTris-HCl濃縮膠緩沖液，pH6.8（4x）：

取5.98gTris,用INHC1調(diào)至pH6.8,加水至100ml,4℃

保存。

4.電極緩沖液（pH8.3）：取14.49g甘氨酸，3.02gTris,

加100ml10%SDS,加水至1升,4c保存。

5.10%過硫酸筱溶液（AP）：臨用前現(xiàn)配。

6.染色液（0.25%考馬斯亮藍R-250、50%甲醇、7%乙酸）:

考馬斯亮藍R-2502.5g、甲醇（可用無水乙醇代替）500ml>

70ml冰乙酸，溶解后補足水至總體積1000mlo

7.脫色液（30%甲醇、7%乙酸）：甲醇（可用無水乙醇代

替）300ml,冰乙酸70mL補足水至1000mL

【操作步驟】

1.凝膠柱的制備

（1）取兩端已有金鋼砂磨平的10X0.6cm的玻璃管。在

距一端7cm和7.5cm處，各劃一條線。插入橡皮墊，垂直安

放于試管架中。

（2）按分離膠配制比例（見下表）加入各種試劑，混勻

后即成為分離膠溶液。迅速用乳頭吸管將分離膠加入玻璃管

內(nèi)，至7cm劃線處。

（3）用細尖的乳頭吸管沿玻璃管壁加入蒸儲水約0.5cm,

加水時要緩慢，盡量減少凝膠表面的震動與混合。靜置1小

時以上。

(4)按濃縮膠配制比例(見下表)加入各種試劑:

分離膠和濃縮膠溶液的配制

分離膠(ml)濃縮膠(ml)

H2O6.207.65

30%丙烯酰胺2.501.00

分離膠緩沖液1.25—

(pH8.8)

濃縮膠緩沖液—1.25

(pH6.8)

TEMED0.0050.005

10%過硫酸錢0.050.05

總體積10ml10ml

(5)用乳頭吸管吸去分離膠管上面的水層，加入少許濃

縮膠迅速吸出去(目的是洗出分離膠表面的水)。

(6)用乳頭吸管沿凝膠管壁加入濃縮膠溶液至7.5cm處,

并隨即沿管壁緩慢加入約0.5cm高度，靜置20分鐘。

2.樣品配制

正常入血清0.1ml,加入濃縮膠緩沖液1.5ml,加入蔗糖

200mg/ML0.1ml,及0.05%溟酚蘭水溶液0.1ml,,輕搖混勻。

3.電泳

(1)選擇無氣泡和裂縫、聚合均勻的凝膠去水并垂直安

放在上電極糟的橡皮塞孔中。

(2)加入電極緩沖液于上、下電泳槽中，使電極緩沖液

淹沒凝膠管中，用乳頭吸管排除凝膠管上下口中的氣泡。

(3)加樣：用微量注射器取樣品液加30ul,沿管壁加

在濃縮膠面上，注入時要慢。標記各管的編號。

(4)電冰：將上層電極糟的電極接在電泳儀的負極、下

層電極糟的電極接在電泳議的正極、接好電源。調(diào)節(jié)電流為

l-2mA/管。待示蹤劑進入分離膠時，調(diào)節(jié)電流為2-4mA/管。

當示蹤劑移出玻璃管下口約30分鐘，切斷電源。

4.剝膠

取下凝膠管，用帶有10cm長局麻針頭注射器，盛滿蒸饋

水做潤滑劑。將針頭插入膠與管壁之間，邊注入水邊旋轉玻

璃管。直至膠柱與管壁分開。然后用吸耳球輕輕在膠管的一

端加壓，使凝膠從玻璃管中緩慢滑出，進入到已編號的試管

內(nèi)。

5.染色、脫色、固定、保存

向裝有凝膠柱的試管中加入染色液，使凝膠柱全都浸泡在

染色液于60c水浴中染色30分鐘、傾去染色液，加入固定、

保存液，更換三次，次日觀察結果。

【注】Acr和Bis都是神經(jīng)性毒劑，對皮膚有刺激作用、但

在形成凝膠后則無毒，操作時應盡量避免接觸皮膚，并注意

洗手。

【思考題】

1.配制樣品時，為什么要加入蔗糖？

2.電泳時，為什么要把上層電泳槽接在負極上？

實驗七蛋白質印跡免疫分析(WesternBlot

Anglysis)

【基本原理】

蛋白質印跡免疫分析的過程包括蛋白質經(jīng)凝膠電泳分離

后，在電場作用下將凝膠上的蛋白質條帶轉移到硝酸纖維素

膜上，經(jīng)封閉后再用抗待檢蛋白質的抗體作為探針與之結合,

經(jīng)洗滌后，再將濾膜與二級試劑一放射性標記的或辣根過氧

化物酶或堿性磷酸酶偶聯(lián)抗免疫球蛋白抗體結合，進一步洗

滌后，通過放射自顯影或原位酶反應來確定抗原一抗體一抗

抗體復合物在濾膜上的位置和豐度。

【器材】

轉移電泳儀，硝酸纖維素膜，濾紙，剪刀，手套，小尺

【試劑】

1.IgG標準品

2.羊抗人辣根過氧化物酶(HRP)標記的IgG抗體

3.轉移buffer：Tris3.03g,Glyl4.4g,甲醇200ml,

加三蒸水至1000ml充分溶解，4℃冰箱貯存。

4.Trisbuffer(TBS)：Tris2.42g,NaCl29.2g,溶于

600ml三蒸水，再用INHC1調(diào)至pH7.5,然后補加三蒸水至

1000mlo

5.漂洗液(TTBS)：TBSM500ml,加Tween20250ulo

6.封閉液：5%脫脂奶粉。

7.抗體buffer：1.5gBSA溶于50mlTTBSo

8.顯色液DAB(3.3-diaminobenzidine,3.3-二氨基聯(lián)苯

胺)配制：5mgDAB溶于10ml檸檬酸buffer(0.Olmol/L檸

檬酸2.6ml,0.02mol/LNa2HP0417.39ml),力口30%H20210

ul(臨用時現(xiàn)配)。

9.脫色液：甲醇2501nL冰醋酸100mL加蒸儲水至1000mlo

10.氨基黑染色液(0.現(xiàn)氨基黑-10B)：0.2g氨基黑-10B

溶于200nli脫色液中，充分攪拌溶解，濾紙過濾。

【操作步驟】

一、樣品的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

L安裝制膠模具

2.根據(jù)所測蛋白質選擇某一合適的分離膠濃度。按下表

所列的試劑用量配。

分離膠的配制

7.5%(m15%(ml)

1)10%(ml)

4.904.102.40

H2O

30%丙烯酰胺2.503.305.00

分離膠緩沖液2.502.502.50

(pH8.8)

10%SDS0.100.100.10

TEMED0.020.020.02

10%過硫酸鐵0.020.020.02

總體積10ml10ml10ml

將分離膠混勻后立即灌注于玻板間隙中，上層小心覆蓋

一層正丁醇。將膠板垂直放于室溫下，待分離膠聚合完全后,

傾去正丁醇并用濾紙吸干。

3.濃縮膠的制備

按下表配制濃縮膠，將濃縮膠混勻后直接灌注在已聚合

的分離膠上，立即插入梳子，將凝膠垂直放于室溫下聚合。

濃縮膠的配制

3%(ml)4%(ml)6%(ml)

H2O3.052.7

3.2

30%丙烯酰胺0.651.0

0.5

濃縮膠緩沖液1.251.25

(pH6.8)1.25

10%SDS0.050.05

0.05

TEMED0.050.05

0.05

10%過硫酸鉉0.050.05

0.05

總體積5ml5ml5ml

4.樣品預處理：取樣品液與等體積樣品緩沖液混合，100℃

加熱1?2分鐘。

5.待濃縮膠聚合完全后，小心移出梳子，然后將膠板固

定于電泳裝置上，上下槽各加入電極緩沖液。

6.加樣：用微量進樣器加樣。每個樣品孔加入20ul樣

品。

7.電泳：在100?150V的電壓下電泳，直至溟酚藍達到

膠底部，關閉電源。

加樣時，注意在同一塊膠上按順序做一份重復點樣，以備

電泳結束時，一份用于免疫鑒定，一份用于蛋白染色顯帶，

以利相互對比，分析實驗結果。

二、轉移印跡

1.轉移前準備：將濾紙，硝酸纖維素膜(NC)剪成與膠

同樣大小，NC膜浸入蒸儲水中10-20min后浸入轉移buffer

中平衡30min。

2.凝膠平衡：將電泳后的SDS膠板置于轉移buffer

中平衡30-60mino

3.按圖操作：逐層鋪平，各層之間勿留有氣泡和皺折。

4.開始轉移，連接正負極，蓋好蓋子，接上電源，恒流

0.8mA/cm,室溫下轉移lh,轉移后的凝膠再用氨基黑10B染

色液染色20min,然后脫色檢測轉移效果。

三、免疫染色

1.轉移后的NC膜于5%脫脂奶粉中封閉，4℃過夜。

2.TBS洗膜1-2次，lOmin/次。

3.加HRP標記的抗體，室溫lho

4.TBS洗3次,lOmin/次。

5.NC膜再轉入DAB顯色液中，置暗處反應，待顯色反應

達到最佳程度時，立即用三蒸水洗滌終止反應。

負極

濾紙

轉移單位示意圖

正極

【思考題】

此實驗的注意事項是什么？

實驗八微機模擬蛋白質純化實驗

將計算機輔助教學手段（即CAI）用于高等學校的教學工

作，近年來已取得了很大發(fā)展，這是高校教學改革的重要方

向。而將CAI用于實驗教學，模擬動態(tài)的實驗過程，則難度

較大，目前成熟的實用軟件還不多見。在生物化學大實驗中

使用計算機模擬純化生物大分子的實驗軟件，意義就更為重

大，因為生化大實驗的試劑十分昂貴，要用到各種離心機和

分光光度計，以及自動部份收集器、電泳儀等十幾種儀器設

備，對實驗室的儀器裝備條件要求很高。此外，由于生物材

料的組成十分復雜，生物大分子的含量通常極微量，實驗流

程又長，有的實驗要連續(xù)做一、二周，因而實驗難度較大，

如果能在生化大實驗中使用CAI,則可以獲得比其他實驗課更

顯著的教學效果。

清華大學生物系生化大實驗教學組多年前就十分重視CAI

的工作，從1989年開始就將計算機模擬蛋白質純化的實驗教

學軟件用于生化大實驗的教學，簡稱為“干實驗”。

[]Windows界面下計算機模擬純化蛋白質的實驗軟件：

由于DOS系統(tǒng)下的實驗軟件已使用多年，而且是八十年

代編制的，現(xiàn)已十分落后，分離純化實驗條件的選擇太少，

產(chǎn)率的計算時常超過100%,同一種酶使用不同的分離純化實

驗條件，有時會得到相同的結果，因此由1996年開始編制新

的Windows界面下的實驗軟件，軟件名稱是“Protein”,該

軟件是用VisualBasic編寫的Win3.1/Win95應用程序，

界面簡潔明了，可以用鼠標很方便的操作，并有完整的幫助

文件，對操作方法和使用的各種生化實驗技術詳加說明，使

用者短時間即可熟練操作。

“Protein”軟件有36個任務，即36組待分離純化的蛋

白。任務要求利用軟件提供的幾種實驗技術，提純每一個目

的蛋白，最終達到單向電泳一條帶，雙向電泳一個點，而且

使用的人時和經(jīng)費（根據(jù)提取步驟計算得到）不得超過一個特

定值。在每個任務開始時，軟件給出目的蛋白的一些性質，

如熱穩(wěn)定的溫度范圍和pH穩(wěn)定范圍等，利用這些信息，可以

使實驗少走彎路。

“Protein”提供的分離純化方法有七種：①熱變性；②

硫錢沉淀；③排阻層析（凝膠色譜）；④離子交換層析；⑤吸

附層析；⑥聚焦層析；⑦制備電泳。

例如，在使用層析方法時，可在Chromatography菜單下

點選上述四種層析方法，彈出相應的參數(shù)對話框，此時要求

輸入柱長、內(nèi)徑、柱填料類型、緩沖液組分及pH值和洗脫速

度等。如果采用梯度洗脫，還要求輸入梯度洗脫的初始和終

末濃度及洗脫體積，在輸入?yún)?shù)之后，計算機模擬洗脫過程,

并且畫出A280洗脫曲線和酶活曲線，此時，可以根據(jù)分離的

情況和酶活的峰位來收集組份，在收集之前還可以用電泳查

看洗脫曲線上某一部位的分離效果。在確認收集之后，

“Protein”軟件記錄該步操作的條件，計算回收率、純化倍

數(shù)以及消耗的人時和經(jīng)費等。

經(jīng)過反復多次的模擬實驗，初步純化了目的蛋白，在雙

向電泳圖上能夠確定該蛋白質的分子量和等電點之后，還需

要重新對其各步驟的實驗條件，尤其是離子交換層析、排阻

層析和制備電泳等實驗步驟的實驗條件進行修改，以找到適

合該蛋白質的最佳分離純化實驗方案和實驗條件。

在“Protein”所提供的各種分離純化方法中，熱變性法

和鹽析法是比較好的粗提方法，在提純的早期使用效果較好。

層析是各種方法中最強有力的方法，制備電泳雖然純化倍數(shù)

高，但是回收率低。在各種層析方法中，又以離子交換層析

最為有效和易于使用，并且耗費的人時和經(jīng)費也較少。排層

層析和聚焦層析耗費較大，但在某些特定情況下，這兩種方

法是不可替代的。

“Protein”提供了四種電泳方法：即，SDS、PAGE、

等電聚焦電泳和雙向電泳。這些電泳方法不但可以用以檢測

樣品的純度，而且也給出了樣品的一些信息，如分子量、等

電點等，這些信息對于后續(xù)提純有重要的參考價值，等電聚

焦電泳和PAGE還可以用于制備。

“Protein”新軟件的投入使用，使生化大實驗的CAI教

學水平上了一個新臺階，它的優(yōu)點是：在幾小時內(nèi)可以模擬

完成大量的生化實驗分離純化過程，既經(jīng)濟，效率又很高，

實現(xiàn)了學生們想設計生化大實驗的要求，而在實驗室里要想

實現(xiàn)這一過程是非常困難的。通過“干實驗”的教學，對生

化大實驗中的各種實驗條件進行反復的比較和選用，對所用

的幾種主要生化實驗技術可以加深認識和理解。

本實驗要求完成Windows版實驗軟件中四至五種酶的分

離純化，而且要挑選一種酶做出其鹽析曲線。

實驗報告要求列表詳細寫出分離純化的實驗步驟、實驗條

件和實驗結果（包括分子量和等電點），并畫出洗脫曲線。

第二章核酸的化學

實驗九真核生物基因組DNA的制備（苯酚法）

【原理】

DNA是儲存遺傳信息的物質，是遺傳的物質基礎，它與生

命的正?；顒尤绶N的遺傳、生長發(fā)育有密切關系。其結構與

功能的研究是當前分子生物學研究的主要內(nèi)容之一。

核酸廣泛存在于生物中，DNA含有生物體的全部遺傳信息,

在生物組織中以核蛋白(DNP)形式存在。真核生物中，DNA主

要存在于細胞核中，核外也有少量，如線粒體DNA,稱為核外

基因。DNA的分子長度一般隨生物由低級進化到高級而增加。

9

人類基因組含2.9X10bpo

無論是研究核酸的結構，還是它的功能，首先需要對核酸

進行分離與提純。分離與提純核酸最基本的要求是保持核酸

的完整性及純度。

要從生物組織中提取DNA,因DNA是以核蛋白(DNP)形式

存在于細胞核中故首先必須粉碎組織，裂解細胞膜和核膜，

使DNP釋放出來，再用苯酚提取蛋白。由于細胞中的核糖核

蛋白(RNP)和DNP往往一起被提取，故DNA沉淀中混有RNA。

需用核糖核酸酶(RNase)處理，去除RNA。并用蛋白酶將遺留

的少量蛋白質水解除去，再經(jīng)苯酚處理，乙醇沉淀，最后可

得較為純凈的DNAo它的純度可以從260nm波長處的光密度和

280nm波長處的光密度之比值測知，一般以OD260nm/0D

280nin能達到1.8左右為標準。

分離與提純過程中保持DNA的完整性和純度存在許多困

難，主要原因有：

(D細胞內(nèi)存在很高的DNA酶活性，在分離與提純過程中

會造成核酸的降解。，

(2)DNA分子很大，分離過程中因化學因素或物理因素使

DNA降解，如強酸、強堿、溫度過高或機械張力剪切等。DNA

的定量可采用化學的定磷法、定核酸法。目前多數(shù)實驗室采

用紫外分光光度法測定核酸含量，以下公式可作為紫外定量

時參考：雙鏈DNA含量：OD260nmX樣品稀釋倍數(shù)X50ug/

ml=ug/ml樣品。

【器材】

1.塑料離心管：6

2.刻度離心管：1

3.滴管：長：1吸酚：氯仿混合液

中：1吸乙醇

短(鈍口)：1吸DNA水溶液

4.細玻棒：1

5.移液管：1

6.微量取樣器1

7.手套：1副

8.離心機

9.紫外分光光度計

10.37℃水浴，50℃水浴

11.組織搗碎器

12.電泳儀及電泳槽

【試劑】

1.裂解緩沖液：

(l)50mmol/1Tris-HClpH7.4(2)20mmol/lEDTA

(3)0.5%SDS(4)100mmol/lNaCl

配法：

lmol/1Tris-HClpH7.450ml

20%SDS25ml

2mol/lNaCl50ml

0.5mol/lEDTA40ml

蒸儲水稀釋至1000ml

其中Tris-HclpH7.4維持PH恒定，防止DNA變性和水

解。EDTA能絡合二價金屬離子，當Mg+，被絡合后，細胞內(nèi)

釋放出來的DNA酶的作用被抑制，以避免DNA的降解，同時

金屬離于絡合后，細胞膜的穩(wěn)定性下降，有利于膜的裂解；

SDS有使蛋白質變性的作用，它能破壞膜蛋白的構象，因此使

膜裂解，它又能使核蛋白中的核酸與蛋白質解離，并且SDS

也具有抑制DNA酶的作用。

2.苯酚

重蒸苯酚加入抗氧化劑8-羥喳琳Img/mL用lmol/1

PH8.0Tris-HCl洗一次，再用0.lmol/ITris-HClPH8.0

洗二次，苯酚PH在7.6?7.8之間。

3.苯酚：氯仿混和液（1：1）

苯酚加上等體積氯仿并用水飽和，混和液分層，上層為

水相，下層為有機相且?guī)S色。苯酚和氯仿都是蛋白質變性

劑，苯酚使蛋白質變性的作用強于氯仿，但氯仿具有較好的

分層作用。

4.無水乙醇

DNA在PH7.4條件下分于帶負電，在NaCl存在條件下，

DNA鹽呈電中性，乙醇將DNA分子周圍的水分奪去，DNA失水

形成白色絮狀沉淀。

5.TE緩沖液

50mmol/lTris-HClpH7.0

5mmol/lEDTA

配法：

Imol/1Tris-HClpH7.410ml

0.5mol/lEDTAEDTA

蒸儲水稀釋至1000ml

6.RNaselOmg/ml

配法：

稱取RNase溶解在lOmmol/1Tris-HCl(PH7.5)和15mmol

/LTris-HC1(PH7.5)和15mmol/INacl落液中使之濃度為

10mg/mlo100C加溫15分鐘，使夾雜的少許DNase失活，

然后慢慢冷卻，分裝于小管中-20℃保存。

7.蛋白酶K(10mg/ml)-20℃保存。

蛋白酶K優(yōu)點：水解能力很強，作用廣泛，可與SDS

及EDTA合并使用。

8.20%SDS

9.0.5mol/LEDTA

10.12mol/L高氯酸

【操作】

1.取新鮮鼠肝用冰生理鹽水洗去血水，用濾紙吸干,

-70℃冰箱中保存，用時取出。

2.1克鼠肝加10ml裂解緩沖液，在組織勻漿器中勻漿約

1分鐘（2次，每次30秒）

3.取塑料離心管1支加入1/3支勻漿液（若勻漿液太稠,

則再加入hnlTE緩沖液），然后再加入等體積苯酚：氯仿混和

液抽提。每次抽提輕緩地來回搖動5分鐘，然后離心10000

轉/分鐘X5分鐘，水相吸入另一干凈的離心管中，重復抽提

二次。

注意：每次水相時不要將界面上的變性蛋白質混入，抽提

r-]

本卷

爻性苑由藤

一貨機相

臧注■,

?心后的分■

二次后一般有機相和水相界面上的變性蛋白質極少，肉眼基

本看不見。若界面上變性蛋白質仍較多，可增加抽提次數(shù)

4.水相加入一刻度離心管中后，加入2.5倍體積的冰

無水乙醇（可用刻度離心管測量體積）。加5mol/LNaGI到終

濃度為0.lmol/L,在離心管中輕緩的混勻，此時可見白色絮

狀沉淀，此即DNA粗制品。

5.用玻棒撈起DNA沉淀，放入小燒杯中，用70%乙醇洗

滌沉淀一次，洗滌時動作要輕，防止DNA被切斷。

6.沉淀取出放入一干凈的塑料離心管中，用ImlTE緩沖

液溶解。

7.在ImlDNA溶液中加入10mg/ml的RNA酶20P1,使

最終濃度達到200ug/血，37c保溫30分鐘。

8.加入20%SDS25U1,使最終濃度至0.5%加入0.5mol/l

EDTA30ul至20mmol/l；力口10mg/ml蛋白酶K20ul,使最終濃

度為200ug/ml,50E保溫30分鐘。

9.加等體積苯酚：氯仿混合液抽提，重復一次，去除蛋

白酶K及其它殘留的蛋白質，至界面無明顯的變性蛋白質為

止。每次抽提輕緩地來回搖動5分鐘，離心10000轉/分鐘

X5分鐘。

10.吸取水相，水相吸至一干凈刻度離心管中量出積體,

再加入2.5倍體積的冰無水乙醇，加5moi/LNaCl至終濃度

為0.lmol/L,混勻后可得較純的DNA沉淀，再用70%乙醇

洗滌沉淀一次。

11.在一干凈的塑料離心管中用0.3—0.5ml緩沖液溶

解沉淀，得到提純的DNA原液。

12.吸取DNA原液lOOuL用TE緩沖液稀釋至3ml(1:30

稀釋)，(若DNA原液太濃,取原液50uL太稀則取原液200ul)o

在紫外分光光度計中測定0.D260nm及0.D280nm的讀數(shù)。計

算：0.D260nm/0.D280nm比值，DNA濃度及DNA總量。剩余

原液寫上自己的學號，交給帶教老師保存，留作做PCR實驗,

【注意事項】.

1.為盡可能避免DNA大分子的斷裂，在實驗過程中必須

(1)勻漿時應保持低溫，勻漿時間應短，勿用玻璃勻漿器。

(2)實驗中使用的吸取DNA水溶液的滴管管口需粗而短，

并燒成鈍口。

(3)酚抽提時勿劇烈振搖。

2.保持DNA活性，避免酸、堿或其它變性因素使DNA變

性。，

3.苯酚是一種強列的蛋白質變性劑。實驗時，應戴手套

操作，避免碰到皮膚，以免灼傷。苯酚蒸汽毒性較大，實驗

中應注意將盛酚的試劑瓶蓋好。

4.離心時要注意管于間的重量平衡。管于要對稱放置，

當離心達到所需速度后再開始計時。

【思考題】

1.如樣晶中有蛋白質存在，其紫外分析結果有何表現(xiàn)?

如何進一步純化？

2.DNA的定量可采用那些方法？目前常用的是哪種?如何

測定DNA的含量？

3.從生物細胞中提取DNA的主要注意點是什么?應如何

控制？

4.能引起DNA變性的因素有哪些?DNA降解和DNA變性有

何區(qū)別?如何鑒別？

實驗十DNA與RNA含量測定

【基本原理】

核酸分子中含有堿基使核酸在260nm下有最大吸收。紫外

吸收是噂吟環(huán)和喀咤環(huán)的共飄雙鍵系統(tǒng)所具有的性質，含有

口票吟和喀咤的物質，不論是核昔、核昔酸或核酸都有吸收紫

外光的特性。

蛋白質由于含芳香族氨基酸，因此也能吸收紫外光，通常

蛋白質在280nm波長有特異吸收。因此核酸在A海及A260>A%。

測定的比值（A260/A28。）可以反映樣品中核酸的含量及純度。

RNA在A26o/A28o的比值在2.0以上；DNA在A260/A280的比值為1.8

左右。當樣品中蛋白質含量較高時比值即下降。

DNA濃度計算公式：

小濃度（〃g/"）=皿亞皿鯉

根據(jù)濃度計算DNA總量:

DNA總量（ug）=DNA濃度（ug/111）義體積（口1）

【器材】

紫外分光光度計、紫外燈或凝膠成像儀

【試劑】

1.雙蒸水

2.DNA樣品或RNA樣品

【操作步驟】

1.將樣品加適量水