酶工程(酶制劑制備2)

二、酶蛋白的提純與精制

3酶蛋白純度檢測

酶蛋白經(jīng)分離純化后的純度如何，必須用適當(dāng)?shù)膶嶒灧椒ㄟM行鑒定，最常用的方法是‘聚丙烯酰胺凝膠電泳’（PolyacrylamideGelElectrophoresisPAGE）,現(xiàn)已發(fā)展成很多方法，如：PAGE圓盤電泳（柱狀電泳）、PAGE垂直板狀電泳等。

二、酶蛋白的提純與精制

3酶蛋白純度檢測⑴電泳的基本原理聚丙烯酰胺凝是由丙烯酰胺單體（Acr)和N，N-亞甲基-雙丙烯酰胺(Bis)在催化劑的作用下，經(jīng)聚合反應(yīng)而形成的，根據(jù)欲分離的蛋白分子的大小，通過控制Acr和Bis的比例以及總濃度來控制凝膠的孔徑大小，制成各種孔徑的凝膠，這樣蛋白質(zhì)顆粒在電泳時，兩種作用力，即電場力和蛋白質(zhì)顆粒在電場中運動所受的阻力，

F=H.Q……………（1）

F/=6π．γην（2）F:電場力；

H：電場強度；Q：質(zhì)點所帶電荷；

F/：：質(zhì)點所受阻力；γ：質(zhì)點半徑；η：電解質(zhì)黏度；ν電泳述度；

在一定的電場中，蛋白質(zhì)分子的理論電泳遷移述率（即遷移述度）

V=Q/6π．γ.η（3）

從這個公式中可以看出，V與蛋白質(zhì)所帶電荷的多少成正比，而與蛋白質(zhì)分子的大小成反比。不同的蛋白質(zhì)，其分子量和所帶電荷的多少都表現(xiàn)出不同程度的差異，從而在電泳時有不同的遷移輸率，經(jīng)電泳后，不同的蛋白分子遷移到電泳介質(zhì)的不同部位，經(jīng)過蛋白質(zhì)染色處理，在凝膠的不同區(qū)域表現(xiàn)出相應(yīng)的電泳帶。從這個原理來講，電泳技術(shù)不僅能對蛋白質(zhì)進行純度鑒定，并且還是分離提純的有效方法。⑵基本操作要點①聚丙烯酰胺凝膠濃度確定凝膠的孔徑由丙烯酰胺單體（Acr）和雙體（Bis）的總濃度（T%）和雙體占總濃度的百分比（C%）所決定。

T%＝（a＋b）/m×100%

C%＝b/（a＋b）×100%a：單體；b：雙體；m:凝膠溶液體積T％：凝膠總濃度，主要考慮要分離的蛋白質(zhì)分子量的大小而定；C％決定凝膠的交聯(lián)度的高低；在T％確定后；調(diào)整C%，可改變凝膠孔徑的大小。經(jīng)驗公式是：C＝6.5－0.3T

還有些學(xué)者主張固定為C＝5％T

聚丙烯酰胺凝膠濃度參考表

樣品分子量范圍適宜的T%

蛋白質(zhì)<10420-30104－4×10415-20

4×104－10510-15105－5×1055-10

>5×1052

-5核酸<10415-20104－1055-10105－2×1062

–2.6②凝膠的聚合化學(xué)聚合：用過硫酸銨（AP）作催化劑，用四甲基乙二胺（TEMED）作加速劑；用量：TEMED加總體積的0.005倍

PA％加總體積的0.05倍聚合時間一般在室溫下30-60min光聚合：用核黃素作催化劑1mg/100ml③點樣：注意樣品的密度和點樣量；④電泳：恒壓電泳和恒流電泳⑤取膠：⑥固定：7%醋酸或12.5％的三氯醋酸⑦染色：染色液有氨基黑10B

考馬斯亮蘭G250

考馬斯亮蘭R250

⑧蛋白質(zhì)純度確定：純一譜帶三、酶制劑的成型與保存

1酶制劑的主要劑型及其制備⑴酶制劑的主要劑型：粗酶制劑：實際包括兩類制劑，液體酶制劑和固體粗酶制劑。純酶制劑：經(jīng)過純化后的制劑，通常是結(jié)晶酶制劑，有時也制成液體制劑，如遺傳工程的工具酶，常加甘油成劑；醫(yī)用酶有液體口服劑、針劑(安瓶)、片劑、酶藥劑、固定化微囊等商品；分析試劑用酶，則常為結(jié)晶酶；工業(yè)用酶多為粉劑、顆粒酶、麩皮酶等粗制酶；液體酶制劑，較不穩(wěn)定，但較經(jīng)濟，常為某些工業(yè)用戶就近使用而生產(chǎn)。三、酶制劑的成型與保存

1酶制劑的主要劑型及其制備⑵酶制劑的成型：①固體粗酶制劑：固體粗酶制劑的干燥成型酶液經(jīng)濃縮、沉淀或吸附后，再經(jīng)干燥處理并添加填充劑、穩(wěn)定劑調(diào)配即成成品干劑。在干燥作業(yè)中，常添加一些添加劑，以防止酶粉飛揚，而制成顆粒酶，或增加酶的熱穩(wěn)定性和保藏穩(wěn)定性。

②酶粉粘結(jié)劑：在許多酶濃縮液中，加入一定比例的含結(jié)晶水的鹽類，混合后在干燥過程由于結(jié)晶水釋放，可使酶粉粘結(jié)，以防酶粉塵被吸入后，引起過敏反應(yīng)。含結(jié)晶水的鹽計有18種可供選用。即：

Na2SO4.10H20Na2CO3.10H2ONa2SO4.7H20Na2HPO4.12H20Na2S203.5H20Na2B4O7.10H20Na2SiO3.9H20A12(SO4)3.18H20K2SO4.A12(SO4)3.24H20、

Ba(OH)2.8H2OCaCl2.6H2OFeSO4.7H2OMgSO4.7H20ZnSO4.6H20C6H5O7Na.5H2O(檸檬酸鈉)C4H4O4Na26H20C2H3O2Na5H20C6H10O6Na.5H2O(琥珀酸鈉)(醋酸鈉)(乳酸鈉)③顆粒酶成型劑：Na2SO4

或三聚磷酸鈉、或硼砂、或檸檬酸鈉溶液與蛋白酶濃縮液混勻，在室溫下加丙酮，沉淀物于55℃真空干燥，即得到顆粒酶。添加適量聚乙烯醇及類似物混合后也可在噴霧干燥時得到顆粒酶，將酶與粘合劑和水混合、擠壓成線條狀，再經(jīng)成丸器制成球狀，并在干燥后包上蠟層。這種制劑貯藏穩(wěn)定性好。

④熱穩(wěn)定性增強劑：液化型細菌淀粉酶提純后，于pH6.0～6.5室溫下，加陽離子表面活性劑烷基二甲基芐基氯化銨或甲基芐基二甲基—2—乙基氯化銨，至終濃度為0.1％～0.2％，可以增強該酶的熱穩(wěn)定性。加1％～5％的鈣鹽可增強酶保藏穩(wěn)定性。其它添加劑如加12％～20％(固形物)的蔗糖于酶液中，可以提高噴霧干燥的酶穩(wěn)定性。⑤填充料：在食品用酶制劑中，常用的填充料有蔗糖、葡萄糖、乳糖、淀粉、食鹽、酪蛋白、動物膠等；制革、造紙等用酶制劑中常用高嶺土、硅藻土等；紡織工業(yè)用酶制劑多用淀粉、面粉等。有時也可以用磷酸鹽、硫酸鈣等作緩沖劑調(diào)整pH值，以增強酶活力。⑥醫(yī)用酶制劑的特殊工藝：除去熱源物質(zhì)醫(yī)用特別是注射用酶制劑，務(wù)必除去熱源物質(zhì)。熱源是染菌后細菌分泌的一類類毒素。帶有這類物質(zhì)的酶制劑，注射到動物體后，能引起體溫升高。熱源物質(zhì)為糖蛋白，分子量100000以上，因細菌來源不同而有差別。這類物質(zhì)對熱相當(dāng)穩(wěn)定，往往要通過長時間高溫作用，例如180℃一220℃，二小時以上的處理，才會分解；也很耐酸；但在堿中，例如pH＞10，作用48小時會逐漸破壞；熱源物質(zhì)對氧化劑十分敏感，在新鮮配制的洗液中，1小時就可以將其除去。

除去熱源物質(zhì)，可以用DEAE纖維素等陰離子交換劑、磷酸鈣、氧化鋁凝膠等吸附；也可以用活性炭吸附；用熱源物質(zhì)的抗體或凝集素制備的親和吸附劑，也可除去；在純化酶時用鹽析而不用有機溶劑沉淀法沉淀，其熱源物可以少些。超濾也可除去某些酶制劑的熱源物質(zhì)。

三、酶制劑的成型與保存

2酶制劑的保存

產(chǎn)品保存大多