生產(chǎn)技術(shù)制藥課件

EPO的保存方法注射用重組人促紅素（CHO細胞）

重組人促紅素注射液（CHO細胞）

本品是由含有高效表達人紅細胞生成素（簡稱人促紅素）基因的中國倉鼠卵巢（CHO）細胞，經(jīng)細胞培養(yǎng)、分離和高度純化後凍幹製成。含適宜穩(wěn)定劑，不含防腐劑和抗生素。重組人促紅素工程細胞是由帶有人促紅素基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的CHO-dhfr(二氫葉酸還原酶基因缺陷型細胞）細胞系。細胞庫的建立、傳代及保存由原始細胞庫的細胞傳代，擴增後凍存於液氮中，作為主細胞庫從主細胞庫的細胞傳代，擴增後凍存於液氮中，作為工作細胞庫（每次傳代不超過批準的代次。細胞系凍存於液氮中，檢定合格後方可用於生產(chǎn)）注一

成品一.分批應(yīng)符合“生物製品分批規(guī)程”規(guī)定。

生物製品分批規(guī)程批號系用以區(qū)分和識別產(chǎn)品批的標誌。為避免混淆和誤差，各生物製品之成品均應(yīng)按照本規(guī)程分批和編批1．生物製品之批號由生產(chǎn)部門編制，品質(zhì)保證部門審定。2．生物製品批號的編碼順序為“年月流水號”。3．生物製品之某一批號，其所含內(nèi)容應(yīng)完全一致，即同一批的任何一瓶製品之來源與品質(zhì)必須與其他任何一瓶完全相同，在抽檢若干瓶數(shù)後，能對整批製品作出評定4·批號的確定注二5．製品分批後，每批所用器械及用具未經(jīng)洗淨(jìng)滅菌，不得用於另一批製品。

6．同一製品的批號不得重複；同一製品不同規(guī)格不應(yīng)採用同一批號。二.分裝及凍幹

應(yīng)符合“生物製品分裝和凍幹規(guī)程”規(guī)定。半成品應(yīng)及時分裝、冷凍。凍幹的全過程中，製品溫度應(yīng)不高於30℃

。

生物製品分裝和凍幹規(guī)程本規(guī)程僅適用於生物製品的注射劑（一）.品質(zhì)保證部門認可

待分裝、冷凍乾燥（以下簡稱凍幹）的半成品，須經(jīng)品質(zhì)保證部門審查或檢定，對符合品質(zhì)標準者，發(fā)出分裝通知單後，方可進行分裝或分裝後凍幹(二)、分裝、凍幹用容器及用具

1．分裝、凍幹製品的最終容器的原材料標準，應(yīng)符合國家藥品包裝用材料和容器管理的標準。注三2.凡接觸不同製品的分裝容器及用具必須分別洗刷。血清類製品、血液製品、卡介苗、結(jié)核菌素等分裝用具必須專用。

（三）分裝、凍幹車間

1．分裝、凍幹車間應(yīng)符合現(xiàn)行中國《藥品生產(chǎn)品質(zhì)管理規(guī)範》的要求。（四）人員

直接參加分裝、凍幹的人員，每年至少應(yīng)做一次健康檢查，凡患有活動性結(jié)核、病毒性肝炎感染者或其他有污染製品危險的傳染病患者，應(yīng)禁止參加分裝、凍幹工作。（五）.待分裝半成品的規(guī)定

1．待分裝之半成品，其最近一次無菌檢查不得超過6個月

2．待分裝製品的標籤必須完整、明確，瓶口需包紮嚴密，瓶塞須完整，容器無裂痕3．待分裝製品的存放和運輸必須採取嚴密的防汙染措施。（六）.分裝要求1．分裝前應(yīng)加強核對，防止錯批或混批。2.全部分裝過程中應(yīng)嚴格注意無菌操作。注五3．製品分裝後應(yīng)立即熔封。分裝於玻璃瓶或塑膠瓶者，須立即加蓋瓶塞並用滅菌鋁蓋加封4．對溫度敏感的製品，在分裝過程中製品應(yīng)維持在25℃以下或?qū)ρu品採取有效的降溫措施。5．分裝所用最終容器及瓶塞，應(yīng)不影響內(nèi)容物的生物學(xué)效價、澄清度和pH6．製品實際分裝量。瓶裝製品的實際裝量應(yīng)多於標籤標示量(七)、凍幹要求

1．應(yīng)根據(jù)製品的不同特性，制定並選擇相適應(yīng)的凍幹工藝和凍幹曲線，並有自動掃描記錄。不論任何製品，凍幹全過程都要做到嚴格的無菌操作。2．應(yīng)根據(jù)製品的不同特性，選擇適宜的凍幹賦形劑。注六

3．真空封口者應(yīng)測定真空度。充氮封口應(yīng)充足氮量，氮氣純度應(yīng)不低於99.99%

．

三.包裝應(yīng)符合“生物製品包裝規(guī)程”規(guī)定(一).總則1.生物製品的包裝應(yīng)按國務(wù)院藥品監(jiān)督管理部門頒佈的《藥品說明書和標籤管理規(guī)定》執(zhí)行。

2．包裝車間的設(shè)施應(yīng)符合現(xiàn)行中國《藥品生產(chǎn)品質(zhì)管理規(guī)範》要求。包裝用材料應(yīng)符合國家藥品包裝用材料和容器標準中有關(guān)要求。

3，己分裝或凍幹後製品，經(jīng)品質(zhì)檢定部門檢定合格和綜合審評，對符合品質(zhì)標準者發(fā)出包裝通知單後，方可進行包裝。4．同一車間有數(shù)條包裝生產(chǎn)線同時進行包裝時，各包裝線之間應(yīng)有隔離設(shè)施。外觀相似的製品不得在相鄰的包裝線上包裝。每條包裝線均應(yīng)標明正在包裝的製品名稱及批號。（二）透視檢查（透檢）1

．熔封後的安瓶，在透檢前須經(jīng)破漏檢查。注七

2．製品在包裝前必須按照要求進行外觀檢查。（三）標籤（四）包裝1．包裝前，應(yīng)按品質(zhì)檢定部門發(fā)出的包裝通知單所載有效期準備瓶簽或印字戳。瓶簽上的字跡應(yīng)清楚。2．在包裝時，要與品質(zhì)檢定部門發(fā)出的包裝通知單仔細核對批號是否相符，防止包錯包混。在包裝過程中，發(fā)現(xiàn)製品的外觀異常、容器破漏或有異物者應(yīng)剔除。3.包裝製品應(yīng)在25℃

以下進行。4.製品包裝全部完成後，在未收到產(chǎn)品合格證前．應(yīng)封存於待檢區(qū)。收到合格證後，方可填寫入庫單，交送成品庫。四.保存、運輸及有效期

於2-8℃以下避光保存和運輸。自分裝之日起，按批準的有效期執(zhí)行?！吧镅u品貯藏和運輸規(guī)程”為保證產(chǎn)品品質(zhì)的穩(wěn)定性，生物製品在生產(chǎn)過程、待檢過程、待銷售及分發(fā)過程中，均應(yīng)按本規(guī)程要求進行貯藏和運輸。1．按中國《藥品生產(chǎn)品質(zhì)管理規(guī)範》要求，各生產(chǎn)單位應(yīng)有專用的冷藏設(shè)備，供貯存收穫物、原液、半成品及成品之用。2．下列收穫物、原液、半成品及成品須分別貯存。貯存庫應(yīng)設(shè)有隔離設(shè)施，以免混淆。

(l）尚未或正在加工處理的收穫物及原液，由製造部門分別貯存。

（2）已經(jīng)完成加工的原液、半成品，在尚未得出檢定結(jié)果前，仍由製造部門分別貯存。

(3）待分裝半成品及分裝後待檢或檢定合格尚未包裝之製品，由分裝和包裝部門分別貯存。

(4）已經(jīng)檢定合格和包裝後之製品，應(yīng)交成品庫貯存。3．貯存收穫物、原液、半成品、成品的容器應(yīng)貼有明顯標誌，注明製品名、批（亞批）號、規(guī)格、數(shù)量以及貯存日期。

4．貯存的原液、半成品和成品應(yīng)設(shè)有庫存貨位卡及分類帳，由專人負責(zé)管理、及時填寫進出庫記錄並簽字。5．各種原液和半成品瓶口須嚴密包紮或封口。6.各種原液、半成品和成品應(yīng)按所規(guī)定的溫度、濕度及避光要求貯存，應(yīng)定時檢查和記錄貯存庫的溫度和濕度。貯存溫度通常為2-8℃7．應(yīng)指定專人負責(zé)管理原液、半成品和成品貯存庫。8．凡未經(jīng)檢定的原液、半成品或成品，須貼有“待檢”明顯標誌。

9．檢定不合格的原液、半成品或成品，應(yīng)貼有“不合格”明顯標誌，並及時按有關(guān)規(guī)定處理。10.凡檢定合格的原液、半成品或成品，應(yīng)貼有“合格”明顯標誌，並及時按有關(guān)規(guī)定處理。26EPO中的雜質(zhì)檢查項外源性DNACHO細胞蛋白牛血清白蛋白鈉離子枸櫞酸離子細菌內(nèi)毒素異常毒性實驗可見異物檢查27一.外源性DNA殘留量測定法

—斑點雜交法

原理：供試品中的外源DNA經(jīng)變性為單鏈後吸附於固相膜上，在一定溫度下可與相匹配的單鏈DNA複性而重新結(jié)合成為雙鏈DNA。將特異性單鏈DNA探針標記後，與吸附在固相膜上的供試品單鏈DNA雜交，並使用與標記物相應(yīng)的顯示系統(tǒng)顯示雜交結(jié)果，與已知含量的陽性DNA比對後，可測定供試品中外源DNA的含量。28試劑：DNA標記和檢測試劑盒DNA雜交膜尼龍膜或硝酸纖維素膜2%蛋白酶K溶液稱取蛋白酶K0.20g，溶於滅菌水10ml中，分裝後儲藏於-20℃

備用。3%牛血清白蛋白溶液稱取牛血清白蛋白0.03g，溶於滅菌水10ml中。1mol/L三羥甲基氨基甲烷（Tris）溶液（pH8.0）用鹽酸調(diào)pH值至8.05.0mol/L氯化鈉溶液0.0.5mol/L乙二胺四乙酸二鈉溶液（pH8.0）.5mol/L乙二胺四乙酸二鈉溶液（pH8.0）。2920%十二烷基硫酸鈉（SDS）溶液用鹽酸調(diào)pH至7.2。蛋白酶緩衝液（pH8.0）量取1mol/LTris溶液1.0ml(pH8.0),5mol/L氯化鈉溶液2.0ml，0.5mol/LEDTA溶液（pH8.0）2.0ml，20%SDS溶液2.5ml,加滅菌水至10ml。TE緩衝液（pH8.0)量取1mol/LTris溶液（pH8.0）10ml,0.5mol/LEDTA溶液（pH8.0）2ml,加滅菌水至1000ml。1%魚精DNA溶液精密稱取魚精DNA0.01g,置10ml量瓶中，用TE緩衝液溶解並稀釋至刻度，搖勻，用7號針頭反復(fù)抽打以剪切DNA成為小分子，分裝後貯藏於-20℃

備用。DNA稀釋液取1%魚精DNA溶液50μl，加TE緩衝液至10ml。30

用於探針標記和陽性對照的DNA,由生產(chǎn)供試品用的傳代細胞、工程菌或雜交瘤細胞提取純化獲得，其提純和鑒定可參考下述推薦方案進行。探針標記和陽性對照的DNA的製備31

將待提取的細胞基質(zhì)懸液的細胞濃度調(diào)整為每lml含107個細胞。取懸液lml，離心，在沉澱中加裂解液400μl

混勻，37℃作用12-24小時後，加入飽和酚溶液450μl,劇烈混合，以每分鐘10000轉(zhuǎn)離心10分鐘，轉(zhuǎn)移上層液體，以飽和酚溶液450μl

重複抽提一次;轉(zhuǎn)移上層液體，加入三氯甲烷450μl

，劇烈混勻，以每分鐘10000轉(zhuǎn)離心10分鐘;轉(zhuǎn)移上層液體，加入pH5.2的3mol/L醋酸鈉溶液40μl

，充分混合，再加入-20℃以下的無水乙醇1ml,充分混合，-20℃以下作用2小時，以每分鐘15000轉(zhuǎn)離心15分鐘;用適量-20℃70%乙醇溶液洗滌沉澱1次，以每分鐘15000轉(zhuǎn)離心15分鐘，棄上清液，保留沉澱，吹至乾燥後，加適量滅菌TE緩衝液溶解，RNase酶切，酚/三氯甲烷抽提，分子篩純化DNA,即得。32鑒定陽性對照品的DNA純度:10%瓊脂糖凝膠電泳法:無RNA和寡核昔酸存在;分光光度法:A260/A280比值應(yīng)在1.8-2.0之間。

用於陽性對照和標記探針的DNA在使用前應(yīng)進行酶切或超聲波處理，使其片斷大小適合於DNA雜交和探針標記。探針的標記按試劑盒使用說明書進行。33測定法—斑點雜交法

(1)蛋白酶K預(yù)處理按下表對供試品、陽性和陰性對照進行加樣，混合後37℃保溫4小時以上，以保證酶切反應(yīng)完全。34注意事項:1）Dl、D2、D3為稀釋的陽性DNA對照。用DNA稀釋液稀釋至每1ml中含DNA1000ng。然後依次10倍稀釋成10ng/100μl(D1)、1ng/100μl(D2)、100pg/100μl(D3)三個稀釋度;如成品使用劑量較大，而且DNA限量要求（100pg/劑量）較嚴格時，則需要提高DNA檢測靈敏度，相應(yīng)的陽性DNA對照應(yīng)稀釋成100pg/100μl(D1)、10pg/100μl(D2)、1pg/100μl(D3)三個稀釋度。陰性對照為DNA稀釋液。352）用DNA稀釋液將供試品(原液)稀釋至每100μl含1人份劑量。

3）加入3%牛血清白蛋白溶液適量，是為了使陽性對照和陰性對照中含有一定的蛋白質(zhì)與供試品(通常為蛋白質(zhì))的酶切條件保持一致;如供試品為其他物質(zhì)，則應(yīng)改用其他相應(yīng)物質(zhì)。36(2)點膜用TE緩衝液浸潤雜交膜後，將預(yù)處理的供試品、陽性對照、陰性對照置100℃水浴加熱10分鐘，迅速冰浴冷卻，以每分鐘8000轉(zhuǎn)離心5秒，用抽濾加樣器點樣於雜交膜(因有蛋白質(zhì)沉澱，故要視沉澱多少確定加樣量，以避免加入蛋白質(zhì)沉澱。所有供試品與陽性對照、陰性對照加樣體積應(yīng)一致，或按同樣比例加樣)。晾乾後置80℃真空幹烤1小時以上。37

（3）雜交及顯色按試劑盒使用說明書進行。將膜置於預(yù)雜交液中(5*SSC,Blockingreagent1%w/v,N-lauroylsarcosinesodiumsalt0.1%w/v,SDS0.02%w/v)68℃預(yù)雜交4h,置膜於含25ng/ml探針的雜交液中，68℃雜交16h。為了降低雜交膜背景，膜片的洗滌用2*SSC,0.1%SDS室溫洗2次，15min/次，後用0.1*SSC,0.1%SDS洗二次，每次15min，不斷振搖後將膜置於l0mlBufferI(0.lmol/LTris-HClpH7.50.15mol/LNaCI)中，靜置1min，再將膜置於BufferⅡ(BufferI加入1%Blockingreagent)中30min，再置於含150mU/mlAnti-digoxigenin-APconjugate的Buffer中37℃40min。待反應(yīng)完畢後，用BufferI洗膜2次，15min/次，用BufferⅢ(100mmo1/LTris-HClpH9.5，100mmo1/LNaCI,50mmo1/LMgCl2)平衡5min後，取l0mlBufferⅢ加人400μl

顯色液浸勻，將膜片置於其中，暗處顯色。當斑點清晰後，用注射用水洗膜，室溫晾乾。

38結(jié)果判定

陽性對照應(yīng)顯色，其顏色深度與DNA含量相對應(yīng)，呈一定的顏色梯度，陰性對照應(yīng)不顯色，或顯色深度小於陽性DNA對照D3，試驗成立。將供試品與陽性對照進行比較，根據(jù)顯色的深淺判定供試品中外源性DNA的含量。3940二.雙抗體夾心法測雜蛋白含量檢測原理：

將已知抗體包被微量反應(yīng)板和待測抗原發(fā)生特異性免疫反應(yīng)，再加酶標抗體和底物，根據(jù)顯色反應(yīng)對抗原進行定性或定量。41421.抗BSA單抗的製備及篩選用BSA免疫BALB/c小鼠，共3次，每次間隔2-3周。取脾，SP2/0骨髓瘤細胞融合，篩選陽性克隆，檢測單抗亞型。大量製備並純化單抗。2．抗BSA多克隆抗體的製備及標記用BSA免疫白兔3次，每次間隔1周，采血，硫酸銨沉澱及層析純化，蛋白定量，採用過碘酸鈉一乙二醇方法標記辣根過氧化物酶(HRP)。433.EL1SA夾心法將定量後的單抗稀釋到1:400後包被96孔酶標板，4℃包被過夜，37℃封閉1h。分別加入0-40ng/ml濃度BSA的標準溶液，每濃度2孔，100μl/孔。以稀釋液作為空白對照。待測樣品分別測定原倍和2倍稀釋後濃度。37孵℃育1h,PBST-Tween20洗滌。加入1:12000稀釋度的酶標抗BSA多克隆抗體，100μl/孔，室溫30min。PBST-Tween20洗滌。加入TMB顯色，100μl/孔，室溫10min。加入1mol/LHCl終止。測定A450，以0ng/ml標準溶液的A值消零。以BSA含量為橫坐標，A值(兩孔均值)為縱坐標，繪製標準曲線。應(yīng)為一直線相關(guān)。4445三.鈉離子測定法

本法系用火焰光度法測定供試品中鈉離子含量。某些含鹼金屬或鹼土金屬元素的供試品溶液用噴霧裝置以氣溶膠形式引入火焰光源中，靠火焰的熱能將供試品元素原子化並激發(fā)出它們的特徵光譜，通過光電檢測系統(tǒng)測量出待測元素特徵光譜的發(fā)光強度可求出供試品中待測元素的含量。通常借比較對照品溶液和供試品溶液的發(fā)光強度，求得供試品中待側(cè)元素的含量。

46

測定法

精密量取供試品0.5ml,置50ml量瓶中,用水稀釋至刻度，即為供試品溶液。按火焰光度法測定，在589nm波長處測定供試品溶液的發(fā)光強度。另精密稱取於110℃乾燥至恒重的氯化鈉0.293g,置100ml量瓶中，用水稀釋至刻度，再精密量取該溶液0.9ml、1.1ml、1.3ml、1.5ml、1.7ml，分別置50ml量瓶中，用水稀釋至刻度，製成0.9mmol/L、1.1mmol/L、1.3mmol/L、1.5mmol/L、1.7mmol/L的系列標準鈉溶液，同法操作。用系列標準鈉溶液的濃度對其相應(yīng)的發(fā)光強度作直線回歸處理，將供試品溶液發(fā)光強度代入回歸方程，求得供試品溶液鈉離子濃度為(mmol/L),，再乘以供試品的稀釋倍數(shù)(100),計算出供試品鈉離子含量。47四.枸櫞酸離子測定法

高效液相色譜法系採用高壓輸液泵將規(guī)定的流動相泵入裝有填充劑的色譜柱進行分離測定的色譜方法。注入的供試品，由流動相帶入柱內(nèi)，各成分在柱內(nèi)被分離，並依次進入檢測器，由記錄儀、積分儀或數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄色譜信號。應(yīng)用HPLC對樣品進行分離分析，主要根據(jù)樣品的性質(zhì)選擇分離類型及相應(yīng)的色譜柱，流動相，檢測器等。48

色譜條件用苯乙烯—二乙烯基苯共聚物為基質(zhì)的陽離子交換色潛柱(H+)，粒度9μm或8μm,內(nèi)徑7.8mm,柱長300mm;柱溫為50℃;流動相為0.004mol/L硫酸溶液，流速為每分鐘0.8ml，示差折光檢測器。49測定法精密稱取經(jīng)減壓乾燥至恒重的枸椽酸鈉0.735g，置100ml量瓶中，用水溶解並稀釋至刻度，精密量取5.0ml、10.0ml、15.0ml，分別置25ml量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻,即得相對應(yīng)的5.0mmol/L、10.0mmol/L、15.0mmol/L枸檬酸離子對照品溶液。分別精密量取20μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖;另精密量取供試品溶液1ml,置15ml離心管中，精密加1.5%磺基水楊酸溶液lml,混勻。室溫下以每分鐘2000轉(zhuǎn)離心10分鐘。取上清液，同法測定。用對照品溶液的枸櫞酸離子濃度對峰面積進行直線回歸，求得回歸方程，計算出供試品溶液枸櫞酸鈉含量(mmol/L)，再乘以供試品稀釋倍數(shù)，計算出供試品枸櫞酸離子含量(mmol/L).50五.細菌內(nèi)毒素檢查法

鑒於家兔法費時較長，操作繁瑣，近年來發(fā)展了體外熱原試驗法即鱟試驗法，其原理是利用鱟(Limuspolyphemus)的變形細胞溶解物(amebecytelysate)與內(nèi)毒素之間的凝集反應(yīng)來檢測或定量內(nèi)毒素。通過凝膠限量試驗來檢測由革蘭陰性菌產(chǎn)生的細菌內(nèi)毒素，以判斷供試品中細菌內(nèi)毒素的限量是否符合規(guī)定。51鱟試驗檢測細菌內(nèi)毒素的機理

52

凝膠法細菌內(nèi)毒素檢查用水系指內(nèi)毒素含量小於0.015EU/ml的滅菌注射用水。試驗所用的器皿需經(jīng)處理，以去除可能存在的外源性內(nèi)毒素。常用的方法是在250℃幹烤至少60分鐘，也可採用其他確證不干擾細菌內(nèi)毒素檢查的適宜方法。若使用塑膠器械，如微孔板和一與微量加樣器配套的吸頭等，應(yīng)選用標明無內(nèi)毒素並且對試驗無干擾的器械。試驗操作過程應(yīng)防止微生物的污染。53

供試品溶液的製備

某些供試品需進行複溶、稀釋或在水性溶液中浸提制成供試品溶液。一般要求供試品溶液的pH值在6.0-8.0的範圍內(nèi)。對於過酸、過堿或本身有緩衝能力的供試品，需調(diào)節(jié)被測溶液(或其稀釋液)的pH值，可使用酸、堿溶液或鱟試劑生產(chǎn)廠家推薦的適宜的緩衝液調(diào)節(jié)pH值。酸或堿溶液須用細菌內(nèi)毒素檢查用水在已去除內(nèi)毒素的容器中配製。緩衝液必須經(jīng)過驗證不含內(nèi)毒素和干擾因數(shù)。54

內(nèi)毒素限值的確定藥品、生物製品的細菌內(nèi)毒素限值(L)一般按以下公式確定:L=K/M式中L，為供試品的細菌內(nèi)毒素限值，以EU/ml、EU/mg或EU/U(活性單位)表示;K為人每公斤體重每小時最大可接受的內(nèi)毒素劑量。以EU/(kg·h)表示，注射劑K=5EU/(kg·h)，放射性藥品注射劑K=2.5EU/(kg·h)，鞘內(nèi)用注射劑K=0.2EU/(kg·h);M為人用每公斤體重每小時的最大供試品劑量，以ml/(kg·h)、mg/(kg·h)或U/(kg·h)表示，人均體重按60kg計算，注射時間若不足1小時，按1小時計算。55確定最大有效稀釋倍數(shù)(MVD)最大有效稀釋倍數(shù)是指在試驗中供試品溶液被允許稀釋的最大倍數(shù)，在不超過此稀釋倍數(shù)的濃度下進行內(nèi)毒素限值的檢測。用以下公式來確定MVD:MVD=cL/λ式中L為供試品的細菌內(nèi)毒素限值;c為供試品溶液的濃度，如供試為注射用無菌粉末或原料藥，則MVD取1,計算供試品的最小有效稀釋濃度c=λ/L;λ為在凝膠法中鱟試劑的標示靈敏度(EU/ml)。

56鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗

根據(jù)鱟試劑靈敏度的標示值（λ）將細菌內(nèi)毒素國家標準品或細菌內(nèi)毒素工作標準品用細菌內(nèi)毒素檢查用水溶解，在旋渦混合器上混勻15分鐘，然後製成2λ、λ、0.5λ和0.25λ四個濃度的內(nèi)毒素標準溶液，每稀釋一步均應(yīng)在旋渦混合器上混勻30秒。取分裝有0.1ml鱟試劑溶液的10*75mm試管或複溶後的0.1ml/支規(guī)格的鱟試劑原安瓶18支，其中16管分別加入0.1ml不同濃度的內(nèi)毒素標準溶液，每一個內(nèi)毒素濃度平行做4管;另外2管加0.1ml細菌內(nèi)毒素檢查用水作為陰性對照。將試管中溶液輕輕混勻後，封閉管口，垂直放入37℃士1℃的恒溫器中，保溫60分鐘士2分鐘。5758

將試管從恒溫器中輕輕取出，緩緩倒轉(zhuǎn)180度若管內(nèi)形成凝膠，且不變形、不從管壁滑脫者為陽性;未形成凝膠或形成的凝膠不堅實、變形並從管壁滑脫者為陰性。保溫和拿取試管過程應(yīng)避免受到振動造成假陰性結(jié)果。59

當最大濃度2λ管均為陽性，最低濃度0.25λ管均為陰性，陰性對照管為陰性，試驗方為有效。按下式計算反應(yīng)終點濃度的幾何平均值，即為鱟試劑靈敏度的測定值(λc)。

λc=lg-1(∑X/4)式中X為反應(yīng)終點濃度的對數(shù)值(lg)。反應(yīng)終點濃度是指系列遞減的內(nèi)毒素濃度中最後一個是陽性結(jié)果的濃度。當λc在0.5λ-2λ(包括0.5λ和2λ)時，方可用於細菌內(nèi)毒素檢查，並以標示靈敏度λ為該批鱟試劑的靈敏度。60抑制性干擾試驗適用情況：

1.進行新藥的內(nèi)毒素檢查試驗前

2.無內(nèi)毒素檢查項的品種建立內(nèi)毒素檢查法時

3.當鱟試劑、供試品的配方、生產(chǎn)工藝改變或試驗環(huán)境中發(fā)生了任何有可能影響試驗結(jié)果的變化時，須重新進行干擾試驗61按下表製備溶液A、B、C和D，按鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗項下操作。只有當溶液A和陰性對照溶液D的所有平行管都為陰性，並且系列溶液C的結(jié)果在鱟試劑靈敏度復(fù)核範圍內(nèi)時，試驗方為有效。62按下式計算系列溶液C和B的反應(yīng)終點濃度的幾何平均值(Es和Et)。Et=lg-1(∑Xt/4)Es=lg-1(∑Xs/4)Xs、Xt分別為系列溶液C和溶液B的反應(yīng)終點濃度的對數(shù)值。當Es在0.5λ-2λ(包括0.5λ和2λ)及Et在0.5Es-2Es(包括0.5Es和2Es)時，認為供試品在該濃度下無干擾作用。63檢查法凝膠限量試驗按下表製備溶液A,B,C和D。使用稀釋倍數(shù)為最大有效稀釋倍數(shù)並且已經(jīng)排除干擾的供試品溶液來製備溶液A和B。按鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗項下操作。凝膠限量試驗溶液的製備注:A為供試品溶液,B為供試品陽性對照，C為陽性對照，D為陰性對照。64

結(jié)果判斷

保溫60分鐘+2分鐘後觀察結(jié)果。若陰性對照溶液D的平行管均為陰性，供試品陽性對照溶液B的平行管均為陽性，陽性對照溶液C的平行管均為陽性，試驗有效。若溶液A的兩個平行管均為陰性，判供試品符合規(guī)定;若溶液A的兩個平行管均為陽性，判供試品不符合規(guī)定。若溶液A的兩個平行管中的一管為陽性，另一管為陰性，需進行復(fù)試。復(fù)試時，溶液A需做4支平行管，若所有平行管均為陰性，判供試品符合規(guī)定;否則判供試品不符合規(guī)定。65六.異常毒性檢查法

本法系生物製品的非特異性毒性的通用安全驗檢查製品中是否污染外源性毒性物質(zhì)以及是否存在意外的不安全因素。

原理：用一定劑量的藥物按指定的操作方法和給藥途徑給予規(guī)定體重的某種試驗動物，觀察其毒性反應(yīng)。反應(yīng)的判斷以試驗動物的死亡與否為終點。66檢查法

小鼠試驗法除另有規(guī)定外，每批供試品用5只小鼠，注射前每只小鼠稱體重，應(yīng)為18-22g。每只小鼠腹腔注射供試品0.5ml,觀察7天。觀察期內(nèi),小鼠應(yīng)全部健存，且無異常反應(yīng)，到期時每只小鼠體重應(yīng)增加，供試品判為合格。如不符合上述要求，可用10只小鼠復(fù)試一次，判定標準同前。67七.可見異物檢查法

(燈檢法)

可見異物是指存在於注射劑中，在規(guī)定條件下目視可以觀測到的任何不溶性物質(zhì)。實驗室檢測時應(yīng)避免引入可見異物。當複溶凍幹製劑時，或盛裝供試品的容器(如不透明、不規(guī)則形狀容器等)不適於檢測，需轉(zhuǎn)移至潔淨(jìng)透明的適宜容器中時，均應(yīng)在l00級潔淨(jìng)環(huán)境(如層流淨(jìng)化臺)中進行。68圖中A為帶有遮光板的日光燈光源。光照度可在1000-3000lx範圍內(nèi)調(diào)節(jié)。用於無色溶液檢查，光照度應(yīng)為l000-1500lx;用於透明塑膠容器或有色溶液檢查，光照度應(yīng)為2000-3000lx。B為不反光的黑色背景。C為不反光的白色背景和底部(供檢查有色異物)。D為反光的自色背景(指遮光板內(nèi)側(cè))。69檢查法除另有規(guī)定外，取供試品，除去容器標籤，擦淨(jìng)安瓶外壁污痕，放室溫靜置一定時間,在避光室內(nèi)或暗處，手持瓶頸部於傘棚邊緣處,在明視距離(指供試品至人眼的距離，通常為25cm)，分別在黑色和白色背景下,輕輕旋轉(zhuǎn)和翻轉(zhuǎn)容器使藥液中可能存在的可見異物懸浮(注意不使藥液產(chǎn)生氣泡)，用目檢視。檢查時限為20秒。供試品裝量每支(瓶)在10ml以下的每次檢查拿取2支(瓶);10ml以上的每次檢查拿取1瓶(支)。50ml或50ml以上注射液按直、橫、倒三步法旋轉(zhuǎn)檢視。70(1)注射液除另有規(guī)定外，取供試品20支(瓶)，照上述方法檢查，檢出可見異物的應(yīng)不得超過1支(瓶)。如檢出可見異物的有2支(瓶)，應(yīng)另取20支(瓶)同法復(fù)試，均不得檢出玻璃屑、纖維、色點、色塊及其他外來異物。(2）注射用凍幹製劑除另有規(guī)定外，取供試品5支(瓶)。將供試品和溶解液的溫度平衡至各品種規(guī)定的溶解溫度，再沿瓶壁緩緩注入溶解液，旋轉(zhuǎn)輕搖溶解。有真空的供試品，待供試品即將全部溶解時，破其真空，照上述方法檢查;無真空度的供試品，待供試品全部溶解後照上述方法檢查，應(yīng)不得檢出可見異物。如檢出可見異物的有1支(瓶)，應(yīng)另取5支(瓶)同法復(fù)試，均不得檢出玻璃屑、纖維、色點、色塊及其他外來異物。71紅細胞生成素(erythropoietin,EPO)

紅細胞生成素(erythropoietin,EPO)是一種糖蛋白,它是紅細胞發(fā)育成熟過程中的一種最重要的調(diào)節(jié)因數(shù),它在治療腎衰引起的貧血中,顯示明顯的療效和很小的副作用;在糾正惡性腫瘤相關(guān)貧血、愛滋病引起的貧血和化療引起的貧血等方面,也顯示樂觀的前景;還可在手術(shù)前作為自體輸血,從而避免感染血源性疾病等等。因此EPO是很有前途的一種細胞因數(shù)

72rhEPO的工程細胞

rhEPO(人重組紅細胞生成素)

的工程細胞通常使用CHO細胞,因為CHO細胞是重組糖蛋白生產(chǎn)的首選體系,而rhEPO就是一種糖蛋白.CHO細胞是體壁依賴性細胞.73培養(yǎng)基微載體生物反應(yīng)器rhEPOrhEPO工程細胞CHO培養(yǎng)參數(shù)分泌產(chǎn)物分離純化74培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基無血清培養(yǎng)基75無血清培養(yǎng)基無血清培養(yǎng)基是在合成培養(yǎng)基內(nèi)加入不同種類的補充因數(shù)而替代PBS的培養(yǎng)基.它避免了血清培養(yǎng)基污染的可能性,並排除了批次間的差別還減少了純化的難度.但無血清培養(yǎng)基沒有廣泛的適應(yīng)性,不同的細胞甚至不同的細胞株和細胞系有各自獨立的無血型培養(yǎng)基配方.76

補充因數(shù)是無血清培養(yǎng)基中各種血清替代成分的總稱。補充因數(shù)的種類繁多,主要有生物大分子、小分子和微量元素等。補充因數(shù)又可歸類為必需補充因數(shù)和特殊補充因數(shù)。必需補充因數(shù):胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白和亞硒酸鈉所有的細胞株在無血清培養(yǎng)基中生長時都需要的,特殊補充因數(shù):①生長因數(shù)②激素③貼壁因數(shù)④其他補充因數(shù)771.胰島素:細胞無血清培養(yǎng)中,胰島素的使用濃度為0.1~10μg·mL-1。胰島素可以促進RNA、蛋白質(zhì)和脂肪酸的合成,抑制細胞凋亡,是重要的細胞存活因數(shù),部分學(xué)者認為在批式培養(yǎng)中胰島素迅速耗盡是細胞比生長速率下降的主要原因。CHO細胞能在僅含重組人胰島素一種蛋白成分的無血清培養(yǎng)基中連續(xù)傳代782.轉(zhuǎn)鐵蛋白:大多數(shù)哺乳動物細胞上存在特定的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體,受體與轉(zhuǎn)鐵蛋白/Fe3+複合物結(jié)合是細胞獲取必需的微量元素鐵的主要來源,此外轉(zhuǎn)鐵蛋白還具有生長因數(shù)的性質(zhì)並能與其他微量元素如釩等結(jié)合。轉(zhuǎn)鐵蛋白的使用濃度為0.5~100μg·mL-1,亦有研究報告指出,無血清培養(yǎng)基中必須要有轉(zhuǎn)鐵蛋白至少5μg·mL-1,胰島素才能起作用。也有資料證實轉(zhuǎn)鐵蛋白在無血清培養(yǎng)基中的作用可以為某些鐵鹽所代替,如檸檬酸鐵、二甲胂酸鐵、葡糖酸鐵等。793.亞硒酸鈉:Hewlett在1991年曾指出硒在任何一種細胞,特別是人體細胞的生長過程中確實具有明顯作用,微量元素硒參與穀胱甘肽過氧化物酶和過氧化物歧化酶的作用過程,消除氧化物酶和氧自由基對細胞的傷害。亞硒酸鈉的最適添加濃度是30~60nmol·L-1。80生產(chǎn)rhEPO的無血清培養(yǎng)基用於基因重組促人紅細胞生成素(Recombinanthumanerythropoietin,rHuEPO)生產(chǎn)且不含牛血清白蛋白的無血清培養(yǎng)基-p(Serumfreemedium-p,SFM-p)培養(yǎng)液,就是在達爾貝可改良的伊格爾(DulbeccosmodifiedEaglesmedium,DMEM)∶F12(1∶1)培養(yǎng)基中添加了Se、乙醇胺、多種維生素、蛋白腖、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白和一些細胞因數(shù)等成分構(gòu)成的專用培養(yǎng)基81使用無血清培養(yǎng)基的問題

無血清培養(yǎng)基雖然在各個方面都顯示出其強大的優(yōu)勢和發(fā)展前景,但採用無血清培養(yǎng)而誘發(fā)的細胞凋亡也成為動物細胞無血清培養(yǎng)技術(shù)中亟待解決的問題.在培養(yǎng)基中加入某些化合物,如金精三羧酸(Aurintricarboxylicacid,ATA)、鋅離子、抗氧化劑和細胞因數(shù)等,在一定程度上可阻止因採用無血清培養(yǎng)基而導(dǎo)致的細胞凋亡.82無血清培養(yǎng)基展望培養(yǎng)基中所添加的蛋白成分主要還是來源於動物或人,仍然存在病毒污染的危險,只有完全採用非動物來源的材料,才是相對安全的,而植物提取物將是理想的選擇.可以這樣預(yù)測,未來開發(fā)的新一代無血清培養(yǎng)基,將是一種既無血清、無蛋白,又可以高溫消毒,且適合於多種不同細胞生長的全能型培養(yǎng)基83微載體微載體培養(yǎng)是細胞在由葡聚糖製成的小球表面成單層生長,通過輕輕攪拌使細胞維持懸浮狀態(tài)。這種培養(yǎng)較傳統(tǒng)的單層細胞培養(yǎng),面積大大增加,將這種微載體在流化床式、固定床式反應(yīng)器中進行培養(yǎng),則可獲得比原來多20~50倍的高密度細胞.84常用的微載體85Cytodex微載體上細胞生長情況868788899091Cytopore的性質(zhì)92動物細胞生物反應(yīng)器93常見動物細胞生物反應(yīng)器類型氣升式(airlift)生物反應(yīng)器中空纖維管(hollow-fiber)生物反應(yīng)器流化床(fluidiz-bed)生物反應(yīng)器(FBR)攪拌罐(stir-tank)生物反應(yīng)器(STR)固定床(fixed-bed)生物反應(yīng)器填充床(packed-bed)生物反應(yīng)器94填充床生物反應(yīng)器動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)需要合適的生物反應(yīng)器.目前國內(nèi)用的比較多的適合CHO細胞生長並能高效表達產(chǎn)物的反應(yīng)器是填充床式生物反應(yīng)器,其中比較有名的是美國NBS公司生產(chǎn)的Celligen系列.95CelligenplusCelligen31096Cellgen系列生物反應(yīng)器的特點適合貼壁培養(yǎng)細胞和懸浮細胞,適合各種動物細胞,昆蟲細胞和植物細胞等灌流式的培養(yǎng)過程低（無）剪切力攪拌,無氣泡通氣；特殊的貼壁載體,比表面積大,靜止培養(yǎng)通過持續(xù)檢測攝氧率即時檢測細胞濃度符合現(xiàn)行藥品生產(chǎn)品質(zhì)管理規(guī)範(cGMP)97灌注培養(yǎng)灌注屬於連續(xù)培養(yǎng),細胞保留在反應(yīng)器系統(tǒng)中,收穫培養(yǎng)液的同時不斷加入新鮮培養(yǎng)基.灌注培養(yǎng)的主要優(yōu)點是連續(xù)灌注的培養(yǎng)基可以提供充分的營養(yǎng)成分,並帶走代謝產(chǎn)物.同時,細胞保留在反應(yīng)器中,可以達到很高的細胞密度.同其他方法相比,灌注培養(yǎng)的產(chǎn)率可以提高一個數(shù)量級,並可以大大降低勞動力的消耗.9899Celligen系列生物反應(yīng)器的特點適合貼壁培養(yǎng)細胞和懸浮細胞,適合各種動物細胞,昆蟲細胞和植物細胞等灌流式的培養(yǎng)過程低（無）剪切力攪拌,無氣泡通氣；特殊的貼壁載體,比表面積大,靜止培養(yǎng)通過持續(xù)檢測攝氧率即時檢測細胞濃度符合現(xiàn)行藥品生產(chǎn)品質(zhì)管理規(guī)範(cGMP)100攪拌葉輪種類101Celligen系列生物反應(yīng)器的特點適合貼壁培養(yǎng)細胞和懸浮細胞,適合各種動物細胞,昆蟲細胞和植物細胞等灌流式的培養(yǎng)過程低（無）剪切力攪拌,無氣泡通氣；特殊的貼壁載體,比表面積大,靜止培養(yǎng)通過持續(xù)檢測攝氧率即時檢測細胞濃度符合現(xiàn)行藥品生產(chǎn)品質(zhì)管理規(guī)範(cGMP)102Cell igen系列使用的載體—Fibra-Cel(聚酯片)103FibraCel的技術(shù)指標104FibraCel的電鏡照片無細胞生長的FibraCelHEK293細胞在FibraCel上生長4天的情況HEK293細胞在FibraCel上生長7天的情況105FibraCel適用的細胞種類106籃式纖維填充床107Celligen系列生物反應(yīng)器工作原理(P113)

EPO生化特性及結(jié)構(gòu)

成熟的EPO是一種糖蛋白激素，含有約40%的糖，蛋白質(zhì)部分由166個氨基酸組成，分子量為34kD。其編碼基因是單拷貝基因，定位於人的7號染色體長臂21區(qū)。EPO的二級結(jié)構(gòu)由α螺旋和無規(guī)線圈組成，形成了1個類似於生長素的球形結(jié)構(gòu)。包括3個N連接（Asp-24,38,83）和1個氧連接(Ser-126）的寡糖鏈以及4個半胱氨酸殘基（7，29，33，161）（通過兩個二硫鍵結(jié)合）。

EPO生物合成基因的分離及氨基酸分析

EPO基因於1985年由jacobs首次分離，它由4個內(nèi)含子和5個外顯子組成，其中外顯子編碼的193個氨基酸殘基的N端前27個高度疏水的前導(dǎo)鏈在分泌時裂解下來變?yōu)槌墒斓腅PO。

組織特異性的EPO表達

在胚胎期，肝臟是合成EPO主要的場所，而成人體內(nèi)的EPO主要由腎皮質(zhì)層間質(zhì)細胞產(chǎn)生，肝合成的EPO占總量的20%，其中絕大多數(shù)是由中央靜脈周圍的肝細胞產(chǎn)生，其餘由與成纖維母細胞極相似的Ito細胞產(chǎn)生。EPO基因序列分析

5’-旁側(cè)序列

-0.4kb的5’-旁側(cè)序列存在有與低氧誘導(dǎo)肝細胞內(nèi)EPO基因表達有關(guān)的順式反應(yīng)元件

-6～0.4kb5’-旁側(cè)序列記憶體在有負調(diào)節(jié)元件

-9.5～-6kb5’-旁側(cè)序列存在有肝臟EPO基因表達有關(guān)的順式作用元件

-9.5～-14kb5’-旁側(cè)序列存在有腎臟EPO基因表達有關(guān)的順式作用元件5’-啟動子

-91bp片段能夠控制在正常條件下EPO基因的基礎(chǔ)表達

-117bp啟動子存在時，低氧能誘導(dǎo)EPO基因表達提高3～5倍3’-增強子人EPO基因3’端低氧誘導(dǎo)增強子位於聚腺嘌呤核苷酸位點下游116bp，由43bp組成

CTACGTGC序列HIF-1的結(jié)合位點

CA重複子

TGACCT序列HNF-4的結(jié)合位點必要性胰島素這類活性蛋白多肽和細胞因數(shù)居有高度生物活性，分子量很大，立體結(jié)構(gòu)異常複雜，體外難以人工合成。所以過去糖尿病患者只能服用從牛、豬體中提取的胰島素來治療；但牛、豬胰島素結(jié)構(gòu)上與人胰島素有差別，如與豬胰島素B鏈第30個基酸殘基不同，長期服用會引起腎和眼的疾病，故必需要用基因工程方法獲得重組人胰島素進行治療。原理基因工程技術(shù)主要內(nèi)容或步驟可分為目的基因製備和分離，構(gòu)建DNA重組體；DNA重組體擴增和表達，重組體篩選和鑒定；外源基因表達，產(chǎn)物分離純化和鑒定以及將目的基因克隆到表達載體上，導(dǎo)入宿主細胞，使之在新的遺傳背景下次進行功能性表達，生產(chǎn)出人類所需要的物質(zhì)。預(yù)想把人的胰島素的基因提取出來，接在一個小的載體上，得到一個重組的載體，再轉(zhuǎn)化到真核細胞，細胞並不認為是人的基因就不管它，會當成自己的基因進行胰島素的合成，每一個細胞就相當於生產(chǎn)胰島素的工廠，實際上我們可以通過改變胰島素基因前面的調(diào)控序列，讓細胞停止合成其他的蛋白質(zhì)，只合成胰島素。但是胰島素的A鏈、B鏈分別表達後如何使其正確連接成了人們關(guān)注的問題。

人胰島β細胞生成胰島素過程主要分為三個階段：第一步，機體首先合成由109個氨基酸組成的前胰島素原。第二步，前胰島素原脫去23個氨基酸，轉(zhuǎn)變成含有86個氨基酸的胰島素原。胰島素原分子量為9000，是長的單鏈，含胰島素的A鏈和B鏈及連接鏈。第三步，胰島素原再脫去4個堿基氨基酸，生成含31個氨基酸的C肽及含51個氨基酸的胰島素分子。用E.coli做表達系統(tǒng)

及A鏈、B鏈分別表達的問題 E.coli是原核生物沒有真核生物翻譯後加工、修飾。E.coli中表達的小分子外源蛋白不穩(wěn)定。E.coli與人的種屬差異較大，有密碼子的偏好性。A鏈、B鏈間二硫鍵正確連接和其空間構(gòu)象正確形成較難。一些解決辦法替換表達系統(tǒng),換為酵母或動物細胞等真核表達系統(tǒng)。仍用E.coli作為表達系統(tǒng)，將胰島素基因與一些較大的蛋白分子的基因適當連接，使表達的蛋白分子量足夠大，避免被蛋白水解酶分解，提高其穩(wěn)定性及表達率。在A鏈、B鏈間加入C鏈或其功能類似物，使胰島素能夠形成正確的空間構(gòu)象。一、人胰島素原在Pichiapastoris

（畢赤酵母）中的表達畢赤酵母是一種甲醇營養(yǎng)酵母，用酵母合成胰島素的主要優(yōu)點是可以進行體內(nèi)加工形成二硫鍵的正確配對，產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)基中，下游純化比較簡單。甲醇誘導(dǎo)醇氧化酶(AlcoholOxidase)，AOX的表達是在轉(zhuǎn)錄水準上調(diào)控的，其啟動子(PAoxl)屬誘導(dǎo)型啟動子，能非常有效的控制外源基因的表達。不僅能克服強啟動子在宿主細胞內(nèi)大劑量表達外源蛋白，會導(dǎo)致宿主細胞受損，甚至死亡的缺點，而且能高水準表達。

材料與方法

1．

材料1．1菌種和質(zhì)粒

E.coli

、JMl09、SMDll68，質(zhì)粒pUCl8、pHIL—S11．2限制性內(nèi)切酶

EcoRⅠ、BamHⅠ、BglⅡ及T4DNA連續(xù)酶均購於Promega公司

1．3培養(yǎng)基·LB、YPD、RDB、BMG、BMM其中包括的主要成分YNB(yeastnitrogenbase)購於Difco公司

1．4其他材料DNA回收試劑盒購於原平公司2方法2．1克隆步驟擴增已克隆在質(zhì)粒pUCl8上的胰島素原基因，用EcoRI和BamHI雙酶切，電泳，瓊脂糖凝膠上回收283bp的胰島素原基因片段，將穿梭質(zhì)粒同樣用EcoRI和BamHI雙酶切，65℃，15min，酶滅活。酚抽提，酒精沉澱。溶於0．1XTE中。用T4DNA連接酶連接穿梭質(zhì)粒與膠上回收片段。氯化鈣法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JMl09中，挑單菌落擴增鑒定。2．2表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母SMDl168菌製備酵母感受態(tài)細胞，再將帶有外源基因的穿梭質(zhì)粒線性化，(可用BglⅡ酶切)。可用電激法，也可用invitrogen公司提供的轉(zhuǎn)化試劑盒進行轉(zhuǎn)化。然後在RDB選擇培養(yǎng)基上篩選?！憬湍皋D(zhuǎn)化菌需在28—30℃長2—4天。2．3．1酵母生長期將轉(zhuǎn)化菌在BMG培養(yǎng)基中生長至OD600=4—6時，4℃離心3000g，5min，棄上清。2．3．2誘導(dǎo)表達期棄上清，菌體重新培養(yǎng)於l／5原體積的BMM培養(yǎng)基中進行誘導(dǎo)。每隔24小時，加0.5％體積的誘導(dǎo)劑—甲醇，誘導(dǎo)時間在100h以上。2．3．3SDS凝膠電泳分析

4℃離心7000g，5min，留上清，電泳分析。2．3．4超濾濃縮與分子篩分離純化胰島素原。二.人胰島素原及其類似物

在E.coli表達系統(tǒng)中的表達為了使表達的胰島素原穩(wěn)定採取了下列方法：１．構(gòu)建雙Ｃ肽的人胰島素基因２．構(gòu)建融合蛋白基因（其他蛋白基因＋胰島素原基因）３．構(gòu)建胰島素原基因串（一）Met－Lys－雙Ｃ肽人胰島素原基因

的構(gòu)建表達及分離純化在研究胰島素的結(jié)構(gòu)與生物功能的關(guān)係中，過去人們一直認為C肽含有使胰島素二硫鍵正確配對足夠的結(jié)構(gòu)資訊。我國科學(xué)家在成功地解決胰島素的A、B鏈重組問題及隨後對交聯(lián)胰島素的研究後，人們對“C肽含有使胰島素二硫鍵正確配對的足夠的結(jié)構(gòu)資訊”這一論點產(chǎn)生了質(zhì)疑。

20世紀80年代至90年代，科學(xué)家對不同長度的C肽進行了研究，結(jié)果表明，C肽在胰島素A、B鏈正確配對時，可能只起柔性連結(jié)肽作用，使得雙分子反應(yīng)變?yōu)榉肿觾?nèi)反應(yīng)。而A、B鏈包含了足夠的使二硫鍵正確配對的資訊，C肽的長短可能對A、B鏈的重組產(chǎn)生影響。材料與方法1．1材料1．1．1質(zhì)粒與菌株質(zhì)粒pJGl03:含B-C-A人胰島素原基因(Met-HPⅠ）；質(zhì)粒pJG111：含B—C′—C—A人胰島素原基因(Met—雙C肽—HPⅠ)表達載體；質(zhì)粒pBV220：溫度誘導(dǎo)質(zhì)粒。1．1．2酶和主要試劑胰蛋白酶(10900U／mg)、人胰島素(26．0U／mg)、豬胰島素(26．0U／mg)、羧肽酶B、限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、dNTPs、T4DNA聚合酶、DNA測序試劑盒、T7SequencingTMKit、陰離子交換層析柱ResourceTMQ、SephadexG—75、胰島素放免試劑盒、人胎盤胰島素受體。1．1．3引物

5′突變引物

5′GGAATTCCGGATGAAGTTTGTC3′，起始密碼子ATG與Phe之間插入了Lys的密碼子AAG．測序引物

5′ACGCTTTTGAAGTGAT3′，與雙C肽人胰島素原基因294～279堿基互補．3′通用引物

5′GTCGACGGATCCTCA3′．1．2方法1．2．1重組質(zhì)粒pJG112(含Met—Lys—雙C肽人胰島素原基因)的構(gòu)建．以pJG111(含Met—雙C肽人胰島素原基因)質(zhì)粒DNA作為範本，利用5′端突變引物和3′端通用引物，進行PCR擴增，反應(yīng)體系總體積50μl，95℃預(yù)變性10min後加入1.5UTaq聚合酶，反應(yīng)參數(shù)為93℃,45s；50℃，60s；72℃，90s；35個迴圈後72℃延伸10min．1．5％低熔點瓊脂糖凝膠電泳回收PCR產(chǎn)物，然後用EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切，回收後與pJGl03(含B—C—A人胰島素原基因)載體大片段連接(經(jīng)EcoR

Ⅰ和BamHⅠ雙酶切後回收)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α．1．2．2質(zhì)粒pJGll2的篩選和鑒定酶切篩選：將轉(zhuǎn)化出的單菌落採用常規(guī)小量質(zhì)粒製備方法製備質(zhì)粒DNA，取1μgDNA，用EcoRI和BamHI雙酶切後進行1．5％瓊脂糖凝膠電泳，凡有約380bp片段出現(xiàn)的重組克隆作序列分析鑒定．溫度誘導(dǎo)表達篩選：挑取轉(zhuǎn)化的單菌落，37℃培養(yǎng)過夜，次日擴大10倍37℃培養(yǎng)3h，42℃誘導(dǎo)4—6h。離心得菌體，適量無菌水懸浮後，取適量菌體懸浮液進行15％SDS—PAGE，以pBV220和pJGl03轉(zhuǎn)化菌液作為對照．DNA序列測定：採用izard?plusMiniprepsDNApurificationSystem提取測序範本，採用Sanger雙去氧終止法，測序反應(yīng)按Pharmacia公司T7SequencingTMKit說明書進行．6％變性聚丙烯醯胺凝膠電泳分析．1．2．3Met—Lys—雙C肽人胰島素原基因的搖瓶表達挑取單菌落於3mlLBAmp+培養(yǎng)液中，37℃培養(yǎng)12h，擴大100倍30℃培養(yǎng)過夜，次日上午以1：10稀釋，30℃培養(yǎng)4h，42℃誘導(dǎo)6h，6000r／min離心收穫菌體．1．2．4Met—Lys—雙C肽人胰島素原的分離純化

20g濕菌體經(jīng)超聲破碎細胞，裂解包含體，還原，重組，超濾濃縮至6～7ml的重組液．經(jīng)SephadexG—75(1．7cm×l00cm)層析分離，收集目的蛋白．取少量進行“％SDS—PAGE分析，其餘的調(diào)pH2．5～3．0，加入NaCl使終濃度達12％(W／V)，離心，收集沉澱，冰凍保存．1．2．5Met—Lys—雙C肽人胰島素原轉(zhuǎn)化為人胰島素取適量上述胰島素原類似物鹽析沉澱溶於0.05mol／LTris—HCLpH7．5緩衝液，經(jīng)紫外吸收法準確測定Met—Lys—雙C肽HPI的濃度後，加入適量胰蛋白酶和羧肽酶B，使品質(zhì)比例分別為50：1和300：1，37℃反應(yīng)0．5h，立即冷卻，終止反應(yīng)，酶解液用HCl調(diào)pH2．5～3．0，並加入異丙醇使其濃度達40％(V／V)經(jīng)ResourceTMQ(1m1)陰離子交換柱分離，採用NaCl鹽濃度梯度為0～0．15mol/l的上述緩衝液進行洗脫，以豬胰島素作為對照，收集胰島素峰，用0．5mol/l乙酸透析除鹽，凍幹備用．結(jié)果

2．l重組質(zhì)粒的構(gòu)建利用5′端起始密碼子ATG和胰島素B1TTT之間加入Lys密碼子AAG的突變引物相3′端通用引物，以含雙C肽胰島素原基因的質(zhì)粒pJG111作範本，進行PCR擴增，獲得約380bp的產(chǎn)物，由於胰島素原基因的5′端和3′端分別引入了EcoRI和BamHI酶切位點，因此PCR產(chǎn)物和載體質(zhì)粒pJGl03(含B—C—A人胰島素原基因)可分別用這兩種酶酶切後產(chǎn)生粘性末端，經(jīng)回收的PCR產(chǎn)物酶切小片段與載體大片段連接，轉(zhuǎn)化E．coliDH5α後獲得重組質(zhì)粒pJG112，採用3種方法進行篩選和鑒定。首先提取pJG112質(zhì)粒DNA，經(jīng)EcoRI和BamHI雙酶切篩選，產(chǎn)物進行1．5％瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果表明雙酶切的小片段大小與pJG111雙酶切小片段相近，約370bp，比pJGl03雙酶切的小片段(約280bp)大，初步說明已獲得突變胰島素原類似物基因，並重組到pJGl03質(zhì)粒內(nèi)。鑒於所用載體為一個表達型載體，所以可進行表達篩選．將初步篩選出的陽性克隆小量進行表達，產(chǎn)物進行SDS—PAGE分析，結(jié)果表明在電泳條帶的前沿有明顯表達帶，分子大小比pJGl03質(zhì)粒表達產(chǎn)物Met人胰島素原大，由於pJG111表達產(chǎn)物為Met—雙C肽人胰島素原，與pJG112表達產(chǎn)物Met—Lys雙C肽人胰島素原僅有一個氨基酸差別，故二者條帶位置相近，而對照質(zhì)粒pBV220(空載體)表達產(chǎn)物中的上述二個相應(yīng)位置處均無明顯條帶。最後進行DNA序列測定分析：在Met—Lys—雙C肽人胰島素原基因序列中有一個Lys密碼子AAG插在於起始密碼子ATG和B1Phe密碼子TTT之間，測序電泳結(jié)果表明突變已正確發(fā)生，從而獲得重組質(zhì)粒pJG112。選用植物做表達載體的原因1.人胰島素A﹑B鏈基因序列

再根據(jù)Genebank人胰島素A﹑B鏈氨基酸序列（登錄號為AY138590)設(shè)計人胰島素A﹑B鏈基因DNA序列。A﹑B鏈之間用BamHI位點連接；並在B鏈DNA序列前加上起始密碼子ATG和SnabI﹑XbaI酶切位點；在A鏈後面加上終止密碼子TGA和Smal﹑AvrII酶切位點。限制酶SnabIBamHIXbaISmaI5’

—TACGTATCTAGAATGTTTGTGAACCAACACCTTTGCGGCTCTCACTTGGTTGAAGCTTTGTACTTGGTTTGCGGAGAGAGGGGATTCTTCTACACTCCTAAGACTGGATCCGGAATTGTTGAGCAATGCTGCACTAGCATTTGCTCTTTGTACCAGTTGGAGAACTACTGCAACTGACCCGGGCCTAGG—3’

送上海Sangon生物工程有限公司進行全基因合成，並提供含目的基因的重組質(zhì)粒pUC18–IN和含質(zhì)粒的大腸桿菌DH5α菌株實驗使用質(zhì)粒克隆質(zhì)粒pUC–18表達質(zhì)粒pBI121(含有強啟動子CaMV353)2.人胰島素A﹑B鏈基因植物表達載體pBI121–IN的構(gòu)建pUC18–IN和pBI121質(zhì)粒DNA的提取和純化（用堿變性法發(fā)提取質(zhì)粒DNA）質(zhì)粒DNA的酶切﹑DNA大小片段的回收和連接回收用SmaI和XbaI完全雙酶切pUC18–IN和pBI121質(zhì)粒DNA，用膠回收試劑盒酶切得到的目的基因片段質(zhì)粒大片段,用T4DNA連接酶連接IN片段和pBI121質(zhì)粒DNA大片段親和提純ecotin-proinsulin5mlHiTrapHiTrapNHS-activatedSepharoseHP(Amersham)coupledwith45mgtrypsinogen(Sigma)250mlperiplasmicextract4℃3–4ml/min

Wash:100mMTris–HCl,pH8.5Elution:50mMHClbyFPLC（快速蛋白液相色譜法）凝血酶消化ecotin-proinsulin0.1mg凝血酶室溫孵化2h分離ecotin和proinsulinNi–NTAchromatographyNaCl、咪唑加入到收集液調(diào)終濃度分別為300mM和5mMHisTrapFF5mlcolumn4℃FPLCWash:50mMTris–HCl,300mMNaCl,10mMimidazole,pH8.0Elution:線性梯度0-300mM咪唑30min1ml/minSDSNuPAGE4–12%Bis–Trisgels(Invitrogen)Buffer:

0.1MTris,4.8%SDS,16%glycerol,0.1%Bromophenolblueand1Mb-mercaptoethanol,pH8.0ProinsulintoinsulinProinsulin(0.8μmoleperml)trypsin(25μgperml)carboxypeptidaseB(12.5μgperml)at37℃pH7.510min1、胰島素的結(jié)構(gòu)胰島素是一條多肽，分子品質(zhì)5734，由51個氨基酸組成。它含有A、B兩條鏈，A鏈由21個氨基酸組成，B鏈由30個氨基酸組成，它們之間有兩條二硫鍵A7-B6、A20-B19。此外，A鏈自身在6

與11位有第三條二硫鍵2.用基因工程方法生產(chǎn)人胰島素主要途徑一種是胰島素原途徑，即基因工程所生產(chǎn)的是胰島素原或是其類似物，然後將胰島素原或者其類似物體外轉(zhuǎn)化為胰島素。另一種是A，B鏈重組途徑，即用基因工程方法分別產(chǎn)生胰島素A，B鏈，純化的A，B鏈再經(jīng)重組產(chǎn)生胰島素。

人胰島素原類似物BKRA基因的合成將BKRA基因分成6個片段合成，其中F1、F3、F5片段為正向鏈，F(xiàn)2、F4、F6片段為反向鏈（Fig.1）。將各基因片段按等摩爾數(shù)混合、退火：以Klenow片段完成中間補鏈和末端補平，獲得含有限制性酶切位點的BKRA基因片段，全長

182bp。BKRA片段基因結(jié)構(gòu)GGGAATTCTATGTTCGTTAACCAGCACCTGTGTGGCTCTCACCCC

TTA

AGATACAAGCAATTGGTCGTGGACACACCGAGACTGCTCGTAGAAGCTCTGTACCTGGTTTGCGGTGAACGTGGCTTCGAGCATCTTCGAGACATGGACCAAACGCCACTTGCACCGAAGTTTTACACTCCGAAAACTAAGCGCGGTATCGTTGAACAGTGTAAAATGTGAGGCTTTTGATTCGCGCCATAGCAACTTGTCACATGCACCTCCATCTGCTCCCTTTACCAGCTGGAGAACTACTGTACGTGGAGGTAGACG

AGGGAAATGGTCGACCTCTTGATGACAAACTGAAGCTTGGGTTGACT

TCGAACCCEcoRI小C肽PvuIIHindIIIF1F2F3F4F5F6MKR終止B肽A肽人胰島素原類似物BKRA基因的克隆分別以EcoRⅠ-HindⅢ雙酶切pUC18DNA和上述構(gòu)建的BKRA基因片段（182bp），將載體DNA與BKRA片段（171bp）連接，獲得重組質(zhì)粒pUCⅠ。分別經(jīng)EcoRⅠ-HindⅢ雙酶切和PvuⅡ不完全酶切鑒定，均產(chǎn)生了與其大小的DNA片段。串聯(lián)BKRA基因的構(gòu)建為了正確連接兩個BKRA基因，在此設(shè)計了一個連接頭接在前一個BKRA基因的末端，並構(gòu)建了一個能與下一個BKRA基因5’端EcoRI粘端互補的序列。然而由於接頭是在PvuII平末端與前一個BKRA基因連接的，因此會切掉部分胰島素A鏈基因，所以接頭要補上相應(yīng)的部分。串聯(lián)BKRA基因的構(gòu)建為進行，合成了彼此互補的兩個片段：然後將磷酸化的F7與等摩爾的F8退火，中間接頭形成：F7：CTGGAGAACTACTGTAACCGTCGC

正向鏈F8：AATTGCGACGGTTACAGTAGTTCTCCAG反向鏈-CTGGAGAACTACTGTAACCGTCGC--GACCTCTTGATGACATTGGCAGCGTTAA-5’3’接頭基因?qū)Ρ萈vuII位點EcoRI位點TGCACCTCCATCTGCTCCCTTTACCAGCTGGAGAACTACTGTACGTGGAGGTAGACG

AGGGAAATGGTCGACCTCTTGATGACAAACTGAAGCTTGGGTTGACT

TCGAACCCTGCACCTCCATCTGCTCCCTTTACCAGCTGGAGAACTACTGTACGTGGAGGTAGACG

AGGGAAATGGTCGACCTCTTGATGACAAACCGTCGC

AATTCTATGTTCGTT……TTGGCAGCGTTAAGATACAAGCAA……切掉的A鏈基因F7F8接頭LeuGluAsnTyrCysLeuGluAsnTyrCysAsn終止AsnArgArgAsnSerMet接頭基因的對比串聯(lián)BKRA基因的克隆其5’端為PvuⅡ平端，3’端含有與EcoⅠ粘端互補的序列，但連接後不能再被EcoRI切割。然後共連接pKK223-3DNA的PvuⅡ-HindⅢ雙酶切較大片段(2602bp)和BKRA基因片段(171bp)與上述接頭，獲得BKRA基因5’端帶有接頭的重組質(zhì)粒pKILPHEP