無菌工藝驗(yàn)證-培養(yǎng)基灌封試驗(yàn)

9/17/2022無菌工藝驗(yàn)證－ 培養(yǎng)基灌封試驗(yàn)主講人：崔強(qiáng)2022年3月E-mail:9/17/2022

為什么需要進(jìn)行培養(yǎng)基灌封試驗(yàn)

？29/17/2022

來自生產(chǎn)工藝的要求

……對產(chǎn)品進(jìn)行最終滅菌，是降低微生物污染風(fēng)險的常用辦法。但有大量藥品不適用于最終滅菌而只能采用無菌生產(chǎn)工藝方法。無菌生產(chǎn)工藝是制藥領(lǐng)域中最難的工藝之一，確保產(chǎn)品無菌是該工藝最大的難點(diǎn)。減少無菌工藝藥品污染風(fēng)險的兩項(xiàng)重要措施

人員培訓(xùn)

無菌工藝驗(yàn)證3

最終滅菌工藝與無菌生產(chǎn)工藝的差異最終滅菌工藝

在高潔凈凈環(huán)境下進(jìn)行灌裝和密封

通常，產(chǎn)品、容器和密封件的微生

物污染水平很低

在密封容器中進(jìn)行最終滅菌無菌生產(chǎn)工藝

產(chǎn)品、容器和密封件分別進(jìn)行滅菌，

然后進(jìn)行灌封

在極高潔凈環(huán)境下進(jìn)行灌裝和密封

產(chǎn)品在最終容器中不再做進(jìn)一步的

滅菌處理

對各個組成部分的滅菌工藝需要進(jìn)空瓶滅菌隧道除菌過濾密封件

半壓

塞瓶凍干機(jī)全壓塞瓶

行嚴(yán)格驗(yàn)證和監(jiān)控

蒸汽滅菌釜

在灌封前和灌封過程中的操作會帶

來污染風(fēng)險

人員9/17/2022

49/17/2022

來自FDA和USP的要求FDA

CGMP

無菌工藝藥品指南（2022年版）

An

aseptic

processing

operation

should

be

validated

using

a

microbiological

growth

medium

in

place

of

the

product.

This

process

simulation,

also

known

as

a

media

fill.

USP

31

<1116>

潔凈室和其它控制環(huán)境的微生物學(xué)評價

To

assure

that

minimal

bioburden

is

achieved,

additional

information

on

the

evaluation

of

the

microbiological

status

of

the

controlled

environment

can

be

obtained

by

the

use

of

media

fills

.

An

acceptable

media

fill

shows

that

a

successful

simulated

product

run

can

be

conducted

on

the

manufacturing

line

at

that

point

in

time.59/17/2022

來自EUGMP和國內(nèi)的要求EU

GMP

附件1

無菌藥品的生產(chǎn)（2022年2月新版）

Validation

of

aseptic

processing

should

include

a

process

simulation

test

using

a

nutrient

medium

(media

fill).中國藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范附錄（

1998

年修訂）SFDA

化學(xué)藥品注射劑基本技術(shù)要求（試行）…

培養(yǎng)基灌裝驗(yàn)證是對設(shè)備、環(huán)境以及人員操作的一種系統(tǒng)驗(yàn)證

,是判斷無菌保證水平的關(guān)鍵手段

……

采用無菌生產(chǎn)工藝的粉針劑，應(yīng)能保證

SAL

不大于

10

-3

…

69/17/2022無菌工藝產(chǎn)品的無菌保證

無菌工藝產(chǎn)品工藝驗(yàn)證

Personnel人員Environment

環(huán)境

原料無菌檢驗(yàn)7作業(yè)環(huán)節(jié)驗(yàn)證難易度人員依賴程度相關(guān)風(fēng)險滅菌易低低房間設(shè)計N/AN/A中等環(huán)境監(jiān)測中等可變高消毒難高高更衣難很高很高物品轉(zhuǎn)移難高高無菌技術(shù)（灌封）難很高很高無菌裝配難很高很高9/17/2022作業(yè)環(huán)節(jié)與風(fēng)險89/17/2022培養(yǎng)基灌封實(shí)驗(yàn)的

常規(guī)要求99/17/2022

證明生產(chǎn)線采用無菌工藝生產(chǎn)無菌產(chǎn)品的能力對人員進(jìn)行資格確認(rèn)符合cGMP的要求

定義與目的

使用培養(yǎng)基模擬藥品進(jìn)行無菌灌封，對無菌工藝進(jìn)行

驗(yàn)證。又稱為“工藝模擬試驗(yàn)”.目的109/17/2022

工藝模擬試驗(yàn)的通常流程將培養(yǎng)基暴露于設(shè)備、容器膠塞密封系統(tǒng)的表面和關(guān)鍵環(huán)境條件中，并模擬實(shí)際生產(chǎn)完成工藝操作。

對裝有培養(yǎng)基的密閉容器進(jìn)行培養(yǎng)以檢查微生物的生長。

評價結(jié)果，確定實(shí)際生產(chǎn)中（如灌裝前的調(diào)試、加入無菌原輔材料、無菌連接、灌裝和密封）產(chǎn)品污染的可能性。119/17/2022培養(yǎng)基灌封試驗(yàn)的時機(jī)

–

初始驗(yàn)證與再驗(yàn)證初始驗(yàn)證

需要重復(fù)多次，以確保結(jié)果的一致性和有效性。有差異的多次實(shí)驗(yàn)結(jié)果工藝過程失控的象征

定期再驗(yàn)證

定期進(jìn)行，評估無菌工藝的受控情況。

應(yīng)綜合考慮每一班次及班次變化過程中有代表性的活動及干預(yù)。對人員的資格再確認(rèn)應(yīng)納入到定期再驗(yàn)證中。129/17/2022培養(yǎng)基灌封試驗(yàn)的時機(jī)

–

增補(bǔ)性培養(yǎng)基灌封試驗(yàn)變更及其評估

對產(chǎn)品或生產(chǎn)線的每一種變更，均應(yīng)根據(jù)書面

的變更控制系統(tǒng)進(jìn)行評估

。

如果通過評估認(rèn)為此項(xiàng)變更會影響到無菌生產(chǎn)工藝產(chǎn)品的無菌保證水平，則需要進(jìn)行增補(bǔ)性培養(yǎng)基灌封實(shí)驗(yàn)。比如，設(shè)施或設(shè)備的變化、生產(chǎn)線配置的變動、人員重要變動、環(huán)境監(jiān)控結(jié)果異常、容器

-

膠塞系統(tǒng)變更、停車時間延長、無菌檢查結(jié)果陽性等。139/17/2022

實(shí)驗(yàn)用培養(yǎng)基和培養(yǎng)溫度的選擇選擇時的注意事項(xiàng)

適應(yīng)廣譜微生物生長，包括細(xì)菌和真菌

較好的澄明度，較小的粘度易于除菌過濾常用培養(yǎng)基：

3

％大豆胰蛋白肉湯（

TSB

）厭氧培養(yǎng)基僅在特殊情況下使用

培養(yǎng)溫度

FDA

-

20-35

℃

，目標(biāo)值

±2.5

℃

，不少于

14

天；如選擇兩個溫度，則每一溫度下至少培養(yǎng)

7

天，從低溫開始。PIC

-

20-25

℃

下至少

14

天，或，先

20-25

℃

下

7

天，

然后30-35

℃

下

7

天。149/17/2022

灌裝體積與數(shù)量灌裝體積

每只容器的灌裝體積不少于總?cè)莘e的

1/3

同樣，灌裝體積也不宜過大

既要考慮到瓶倒轉(zhuǎn)或旋轉(zhuǎn)時，培養(yǎng)基能充分接觸到容器

和密封件的內(nèi)表面，又要保證容器內(nèi)有足夠的氧氣支持

微生物生長。灌封數(shù)量

綜合考慮統(tǒng)計學(xué)要求和實(shí)際生產(chǎn)批量。

FDA

(>5000

瓶

)

：如果正常生產(chǎn)的批次量低于

5000

瓶，

則培養(yǎng)基灌封至少應(yīng)為實(shí)際生產(chǎn)線的最大批次量。

PIC

(>3000

瓶

)

：如果正常生產(chǎn)的批次量低于

3000

瓶，則

培養(yǎng)基灌封至少應(yīng)為實(shí)際生產(chǎn)線的最大批次量。159/17/2022

灌封時間與批次量控制灌裝時間

對于初始性驗(yàn)證，培養(yǎng)基灌封實(shí)驗(yàn)應(yīng)安排在一周內(nèi)的不同

時間進(jìn)行。

對于再驗(yàn)證，可選擇在一周結(jié)束或其它最差條件下進(jìn)行。灌封時間要涵蓋實(shí)際生產(chǎn)班次。

批次量控制

初次驗(yàn)證，至少要連續(xù)成功灌封

3

個批次。

再驗(yàn)證至少需要成功灌封

1

個批次。16 培養(yǎng)基灌封實(shí)驗(yàn)的合格標(biāo)準(zhǔn)FDA指南（2022版）與EU

GMP

附件1標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一1.灌封量<5000瓶時，若有1瓶污染，需徹底調(diào)查， 并重新驗(yàn)證(3批)。2.灌封量為5000-10000瓶時，若有1瓶污染，視調(diào) 查結(jié)果決定是否需要重新進(jìn)行1批培養(yǎng)基灌封試 驗(yàn)；若有兩瓶污染，必須重新驗(yàn)證（3批），同 時進(jìn)行徹底調(diào)查。3.

灌封量

>10000

瓶時，若有

1

瓶污染，需徹底調(diào)查；

4.9/17/2022若有兩瓶污染，必須進(jìn)行徹底調(diào)查，并重新驗(yàn)證（3批）。注：歐盟標(biāo)準(zhǔn)將自2022年3月起執(zhí)行。 17污染瓶數(shù)01234567891095%置信限值34.746.37.759.1510.5111.8413.1514.4315.7116.969/17/2022

培養(yǎng)基灌封實(shí)驗(yàn)的合格標(biāo)準(zhǔn) 2022年3月以前歐盟通用標(biāo)準(zhǔn)：污染率低于0.1% 計算公式：實(shí)際污染率=(95%置信限值)/(灌封容器數(shù))×100%污染瓶數(shù)與95%置信限值間的關(guān)系18批量（瓶）3000475063007760允許污染的數(shù)量（瓶）0≤

1≤

2≤

39/17/2022

培養(yǎng)基灌封實(shí)驗(yàn)的合格標(biāo)準(zhǔn)

SFDA

化學(xué)藥品注射劑基本技術(shù)要求（試行）培養(yǎng)基灌裝試驗(yàn)的批量與判斷合格的標(biāo)準(zhǔn)199/17/2022不同劑型的特殊要求209/17/2022

凍干制劑對培養(yǎng)基灌封的要求凍干制劑的典型生產(chǎn)流程

配制

→

灌裝

→

凍干

→

加塞

→

軋蓋

第一種方式，模擬裝載

/

卸載過程，縮短放置時間（首選）

容器內(nèi)灌封好培養(yǎng)基，以半壓塞狀態(tài)裝入凍干機(jī)

凍干機(jī)內(nèi)部分抽真空（

500mbar

），在室溫放置一定的時間，

不得冷凍。

用無菌空氣破真空（不使用惰性氣體），全壓塞

軋蓋

注意，若所使用的容器透明度不高，應(yīng)將內(nèi)容物倒出進(jìn)行檢查。

凍干制劑培養(yǎng)基灌封試驗(yàn)的特殊性

對產(chǎn)品在凍干機(jī)內(nèi)放置步驟的模擬219/17/2022

凍干制劑對培養(yǎng)基灌封的要求第二種方式，模擬凍干時間

半壓塞產(chǎn)品在凍干機(jī)腔室內(nèi)的放置時間同于正常工藝。缺點(diǎn)：耗時長

第三種方式，以經(jīng)稀釋的培養(yǎng)基模擬凍干過程

容器內(nèi)灌封好經(jīng)稀釋的培養(yǎng)基（

diluted

medium

），以半壓塞狀態(tài)裝入凍干機(jī)模擬凍干過程，直到容器內(nèi)的培養(yǎng)基大致達(dá)到正常濃度（

full

strength

）為止。缺點(diǎn)：耗時長，需開發(fā)特殊的凍干程序，營養(yǎng)支持性不均一，影響微生物的存活力。22

粉針劑對培養(yǎng)基灌封的要求第一種方法

在灌裝線上直接灌裝液體培養(yǎng)基，灌裝后壓塞

-

軋蓋或熔封。

9/17/2022第二種方法

先灌裝干粉培養(yǎng)基，再加入注射用水第三種方法

先灌裝惰性劑，再加入液體培養(yǎng)基要點(diǎn)

采用第二、三種方法時，所用惰性劑或干粉培養(yǎng)基需

事先經(jīng)過輻射滅菌。

常用惰性劑有聚乙二醇

8000

、羧甲基纖維素、乳糖。

23

混懸劑

/

半固體制劑對培養(yǎng)基灌封的要求懸浮劑

需要模擬攪拌或循環(huán)流動的過程。

9/17/2022

如果有無菌添加過程，也應(yīng)進(jìn)行模擬。半固體制劑

需要將液體培養(yǎng)基增稠到適當(dāng)粘度。

可選用瓊脂或羧甲基纖維素作為增稠劑，也可選用其

它試劑，但要證明其沒有抑制細(xì)菌或真菌的作用。

在培養(yǎng)結(jié)束后，需將培養(yǎng)基從塑料或金屬管中擠出檢

查其混濁度和真菌菌落，也可進(jìn)行無菌檢查實(shí)驗(yàn)。

如果選擇顯色培養(yǎng)基遇到污染物變色的方法，則需要

對其進(jìn)行驗(yàn)證。

249/17/2022方案

與

報告259/17/2022制訂培養(yǎng)基灌封實(shí)驗(yàn)方案的考慮因素（一）

生產(chǎn)線最長運(yùn)行時間及其造成的相關(guān)風(fēng)險干預(yù)的次數(shù)、類型和復(fù)雜程度是否有凍干工序設(shè)備的無菌裝配總?cè)藬?shù)和所從事的操作無菌加入和無菌轉(zhuǎn)移的次數(shù)班次更換、暫停和必要的更衣無菌設(shè)備的拆卸與連接環(huán)境監(jiān)測269/17/2022制訂培養(yǎng)基灌封實(shí)驗(yàn)方案的考慮因素（二）

生產(chǎn)線的配置和運(yùn)行速度產(chǎn)品重量檢查容器

/

密封系統(tǒng)與無菌操作相關(guān)的各種特殊規(guī)定總?cè)藬?shù)和所從事的操作總的原則

綜合考慮生產(chǎn)線可能造成污染的各種因素盡可能模擬實(shí)際生產(chǎn)的無菌操作可能時，應(yīng)包括最差條件的模擬測試279/17/2022

驗(yàn)證開始前的準(zhǔn)備工作設(shè)備確認(rèn)

通風(fēng)系統(tǒng)（

HVAC

）的確認(rèn)

設(shè)備的在線清洗和滅菌

CIP,SIP滅（除）菌工藝驗(yàn)證

濕熱、干熱滅菌工藝

除菌過濾

空氣過濾器的完好性檢測

容器

/

膠塞密封完好性測試人員培訓(xùn)潔凈室環(huán)境達(dá)到設(shè)計要求28培養(yǎng)基灌封實(shí)驗(yàn)方案的內(nèi)容舉例

定義被模擬的工藝

定義使用的房間，灌封線和

設(shè)備

使用的容器和密封件的類型

灌裝線的速度

灌封數(shù)量

模擬過程中的干擾和中斷的

數(shù)目和類型

參與的人員數(shù)目

使用的培養(yǎng)基

9/17/2022

灌封到容器內(nèi)培養(yǎng)基的體積選擇的最差條件及其原理培養(yǎng)條件，培養(yǎng)溫度，培養(yǎng)時間所進(jìn)行的環(huán)境監(jiān)測批記錄復(fù)印件職責(zé)說明所有工作的合格標(biāo)準(zhǔn)列舉最終報告中需要的文件本次模擬的持續(xù)時間299/17/2022

方案的執(zhí)行與記錄（一）培養(yǎng)基灌封的日期和時間使用的房間和設(shè)備容器膠塞的型號和尺寸培養(yǎng)基種類和滅菌方式每容器中的灌裝體積灌裝速度灌封的瓶數(shù)，燈檢丟棄的瓶數(shù)和原因培養(yǎng)的瓶數(shù)，陽性的數(shù)量培養(yǎng)時間和溫度309/17/2022

方案的執(zhí)行與記錄（二）環(huán)境監(jiān)測的數(shù)據(jù)參與培養(yǎng)基灌封的人員培養(yǎng)基靈敏度檢查的結(jié)果有無陽性結(jié)果。如有，要給出微生物鑒定的結(jié)果。如發(fā)生異常情況，需給出調(diào)查報告。319/17/2022

培養(yǎng)基灌封實(shí)驗(yàn)中的環(huán)境監(jiān)測環(huán)境監(jiān)測－按照相應(yīng)的規(guī)程進(jìn)行，包括：

空氣粒子數(shù)沉降碟浮游菌表面監(jiān)測人員監(jiān)測?對無菌生產(chǎn)區(qū)環(huán)境的評估329/17/2022

培養(yǎng)基灌封實(shí)驗(yàn)中的靈敏度檢查實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基靈敏度檢查實(shí)驗(yàn)：

使用完成

14

天培養(yǎng)的灌封前期培養(yǎng)基樣品

用枯草芽孢桿菌、金.葡萄球菌、白色念珠球菌、銅綠假單胞菌、黑曲霉和環(huán)境菌作為陽性菌將每個菌種準(zhǔn)備含<100cfu/0.1ml的菌液，每個菌種接種2支培養(yǎng)基樣品，同時并平板計數(shù)（雙份）對真菌在20-25C下培養(yǎng)，對細(xì)菌在30-35C下培養(yǎng)，每天檢查，5天內(nèi)需有生長跡象339/17/2022再驗(yàn)證與增補(bǔ)性驗(yàn)證的要求

再驗(yàn)證

對每條生產(chǎn)線，每年進(jìn)行兩次再驗(yàn)證，間隔時間為

5-7

個月。人員至少每年參加一次再驗(yàn)證，以進(jìn)行資格再確認(rèn)。每條生產(chǎn)線輪流使用最大和最小規(guī)格的容器，變換生產(chǎn)線的速度。

增補(bǔ)性驗(yàn)證

根據(jù)風(fēng)險程度決定培養(yǎng)基灌封實(shí)驗(yàn)的批數(shù)。通常為

1-3

批。349/17/2022

培養(yǎng)基灌封實(shí)驗(yàn)的總結(jié)報告最終報告中應(yīng)包括以下內(nèi)容

模擬的最差條件

事件清單

環(huán)境監(jiān)測結(jié)果

微生物鑒別結(jié)果

培養(yǎng)基的營養(yǎng)檢查實(shí)驗(yàn)結(jié)果

培養(yǎng)條件、結(jié)果讀取日、結(jié)果讀取人、每位參與者的灌裝瓶

數(shù)等信息。

結(jié)論（結(jié)果是否可以接受）合格證書

工藝驗(yàn)證

/

再驗(yàn)證合格證書

人員資格確認(rèn)證書359/17/2022難點(diǎn)討論369/17/2022

培養(yǎng)基灌封實(shí)驗(yàn)陽性結(jié)果的調(diào)查

(

一

)調(diào)查的范圍應(yīng)包括

環(huán)

境微生物

監(jiān)測

數(shù)據(jù)，空氣

懸

浮粒子

監(jiān)測

數(shù)據(jù)CIP

設(shè)備

，清

潔

、消毒程序的

執(zhí)

行情況培

養(yǎng)

基、

設(shè)備

和零件的

滅

菌工

藝

，

滅

菌釜的校正情況高效

過濾

器

檢測

(

空氣

懸

浮粒子水平，

過濾

器

檢

漏，風(fēng)

速

測

量，密封系

統(tǒng)檢查

，使用年限等

)除菌

過濾

器完好性房

間

氣流型式與

壓

差人

員

操作技

術(shù)

培

訓(xùn)

情況379/17/2022

培養(yǎng)基灌封實(shí)驗(yàn)陽性結(jié)果的調(diào)查

(

二

)調(diào)查的范圍還應(yīng)包括

以往

產(chǎn)

品無菌

檢查實(shí)驗(yàn)結(jié)

果

人

員衛(wèi)

生狀況

監(jiān)測

數(shù)據(jù)培

養(yǎng)

基灌裝

實(shí)驗(yàn)

中的干

預(yù)

方式分析該

區(qū)域近期是否有

過維

修活

動

，生

產(chǎn)線

的改造情況該

生

產(chǎn)線

培

養(yǎng)

基灌封

實(shí)驗(yàn)歷

史數(shù)據(jù)已

滅

菌物品的

儲

存條件培

養(yǎng)

基灌封

過

程中的異常事件陽性

污

染菌與

環(huán)

境

監(jiān)測污

染菌的

鑒別38

培養(yǎng)基灌封實(shí)驗(yàn)陽性結(jié)果的調(diào)查

(

三

)調(diào)查結(jié)論與風(fēng)險評估

培養(yǎng)基灌封實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效

暫停生產(chǎn)，直至確定污染來源并采取有效的糾偏措施。再驗(yàn)證合格后，產(chǎn)品方可放行。對培養(yǎng)基灌封實(shí)驗(yàn)后和此前所生產(chǎn)的產(chǎn)品，進(jìn)行風(fēng)險評估

培養(yǎng)基灌封實(shí)驗(yàn)結(jié)果無效

→

重新進(jìn)行培養(yǎng)基灌封實(shí)驗(yàn)

9/17/2022條件

1

無菌灌裝區(qū)的物理?xiàng)l件不滿足要求條件

2

人員未按照正常生產(chǎn)程序操作

399/17/2022

培養(yǎng)基灌封后的生產(chǎn)培養(yǎng)基灌封后可以進(jìn)行生產(chǎn)，但要等培養(yǎng)基灌封合格后產(chǎn)品才能放行（產(chǎn)品有報廢的風(fēng)險）。無效的培養(yǎng)基灌封后可以進(jìn)行生產(chǎn)，但所生產(chǎn)的批次要在成功培養(yǎng)基灌封后方可放行。培養(yǎng)基灌封失敗生產(chǎn)線不能用來生產(chǎn)，根據(jù)調(diào)查結(jié)果決定培養(yǎng)基灌封的次數(shù)和數(shù)量，培養(yǎng)基灌封合格后，才能生產(chǎn)。409/17/2022

討論：最差條件

Worst

Case最差條件

高于或低于正常范圍的條件限度，與正常生產(chǎn)條件相比最有可能造成工藝或生產(chǎn)失敗的條件。

注意

如果某些做法會帶來污染的風(fēng)險，則不允許用培養(yǎng)基灌封的結(jié)果為它的不合理的進(jìn)行辯護(hù)419/17/2022

最差條件的設(shè)計（

1

）儲存時間

Holding

time

灌封設(shè)備、灌封部件、儲罐、無菌物料、藥液在實(shí)際灌封

前能夠放置的最長時間

1.

灌封設(shè)備、灌封部件、儲罐、無菌物料需要再滅菌

（除菌）的時間間隔

Worst

case:

用超出保存時間的灌封設(shè)備、灌封部件、儲罐、無菌物料參與培養(yǎng)基灌封2.

產(chǎn)品從無菌過濾到灌封加塞完成所需要的時間Worst

case

：無菌過濾后存放在儲罐內(nèi)的培養(yǎng)基模擬實(shí)際生產(chǎn)時產(chǎn)品的最大儲存時間后再灌封

產(chǎn)品在灌裝后的儲存時間應(yīng)在培養(yǎng)基灌封中驗(yàn)證429/17/2022

最差條件的設(shè)計（

2

）灌封的持續(xù)時間

Duration

of

runs

最保守的設(shè)計：在培養(yǎng)基灌封試驗(yàn)中，模擬用時最長的瓶

子滿批量生產(chǎn)所需要的時間，其中包括正常的干擾時間

（換班、設(shè)備維修）。

其他的設(shè)計：

1.

在生產(chǎn)完成后接著進(jìn)行培養(yǎng)基