分子時代的產(chǎn)前篩查與產(chǎn)前診斷主要內(nèi)容

分子時代的產(chǎn)前篩查與產(chǎn)前診斷主要內(nèi)容控制人數(shù)量、提高人素質(zhì)是我國的基本國策。我國是出生缺陷高發(fā)國，隨著傳染性疾病發(fā)病率和圍產(chǎn)兒死亡率的降低，出生缺陷和遺傳性疾病已經(jīng)成為威脅兒童健康、影響人素質(zhì)的主要問題?？刂迫藬?shù)量、提高人素質(zhì)是我國的基本國策。我國是出生缺陷高發(fā)國，隨著傳染性疾病發(fā)病率和圍產(chǎn)兒死亡率的降低，出生缺陷和遺傳性疾病已經(jīng)成為威脅兒童健康、影響人素質(zhì)的主要問題。染色體疾病是重大出生缺陷，唐氏綜合征是最常見的染色體病。上世紀(jì)90年代末以來，我國陸續(xù)開展了中孕期血清學(xué)篩查工作，并對高危孕婦進(jìn)行羊膜腔穿刺、羊水細(xì)胞培養(yǎng)和染色體核型分析。近年來，有些單位還開展了早孕期血清學(xué)結(jié)合超聲指標(biāo)的篩查，對高危孕婦進(jìn)行絨毛取材、絨毛細(xì)胞培養(yǎng)和染色體核型分析。通過技術(shù)培訓(xùn)和推廣，全國主要省份大多建立了較完善的產(chǎn)前篩查和診斷網(wǎng)絡(luò)。通過健全婦幼衛(wèi)生行政管理相關(guān)法律法規(guī)，加強(qiáng)了全國出生缺陷防治網(wǎng)絡(luò)的建設(shè)和行業(yè)管理?；窘⒘朔现袊巳禾卣骱蛧榈漠a(chǎn)前篩查-診斷技術(shù)體系，以及產(chǎn)前篩查-產(chǎn)前診斷-干預(yù)和監(jiān)測三級網(wǎng)絡(luò)。雖然我國已經(jīng)開展了大量的產(chǎn)前篩查工作，但由于人眾多，產(chǎn)前篩查的覆蓋面尚不足孕婦人群的10%。而就目前的篩查量而言，后續(xù)的產(chǎn)前診斷的技術(shù)力量已遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到要求。根據(jù)中國出生缺陷監(jiān)測中心的實際數(shù)據(jù)，29年，全國行產(chǎn)前篩查的孕婦僅占應(yīng)行產(chǎn)前篩查人數(shù)的13.8%,行產(chǎn)前診斷的孕婦（包括高齡孕婦）僅占應(yīng)行產(chǎn)前診斷人數(shù)的4.9%。提高產(chǎn)前篩查的效率、降低假陽性率，大力發(fā)展快速產(chǎn)前診斷技術(shù)及其他新技術(shù)，是解決我國產(chǎn)前篩查與產(chǎn)前診斷“瓶頸”問題的關(guān)鍵。（一）母血胎兒游離DNA用于胎兒非整倍體篩查的思考1997年，香港中文大學(xué)的盧煜明教授首次從妊娠婦女外周血中分離到了胎兒游離DNA片段，這些DNA來自胎盤的凋亡細(xì)胞。27年，通過對胎兒游離DNA的測序和生物信息分析，實現(xiàn)了無創(chuàng)檢測胎兒非整倍體。2010年以來，基于大規(guī)模平行測序技術(shù)的無創(chuàng)產(chǎn)前檢測技術(shù)被越來越多的用于唐氏綜合征的產(chǎn)前篩查，大規(guī)模臨床試驗也相繼發(fā)表，從血清學(xué)篩查高危孕婦、高齡孕婦到低危孕婦，無創(chuàng)產(chǎn)前檢測的優(yōu)勢越發(fā)明顯。無創(chuàng)產(chǎn)前檢測對于目標(biāo)疾病檢出率高，假陽性率低；篩查孕周范圍大，適用于早孕期和中孕期，甚至孕23周以后；所需信息少，取材便捷，流程較簡單，質(zhì)量控制相對容易；檢測周期短（10個工作日）；技術(shù)有后續(xù)進(jìn)一步發(fā)展的空間；可以有效地降低后續(xù)侵入性產(chǎn)前診斷的數(shù)量，解決產(chǎn)前診斷技術(shù)力量不足的問題。另一方面，無創(chuàng)產(chǎn)前檢測受到很多技術(shù)因素和生物因素的影響。胎兒DNA在母血DNA中所占的百分比影響著檢測的準(zhǔn)確性。當(dāng)胎兒比例小于4%時，檢測很可能失敗。影響胎兒比例的因素包括孕齡、母親體重、胎兒非整倍體類型、胎兒數(shù)量、嵌合體以及染色體本身的生物學(xué)特性。由于這些因素的影響，在臨床試驗中觀測到了假陽性與假陰性的結(jié)果，以及測定失敗的病例，對不同的常染色體三體，其檢出率也各不相同。因此，目前國內(nèi)絕大多數(shù)專家都認(rèn)同，基于二代測序的胎兒游離DNA檢測技術(shù)在現(xiàn)階段應(yīng)該明確定位于21，18，13-三體染色體異常的產(chǎn)前篩查領(lǐng)域，稱之為“近似于診斷的篩查”。未來，該項技術(shù)有望被用于雙胎、性染色體非整倍體，以及微缺失綜合征的檢測。（二）快速產(chǎn)前診斷技術(shù)的快速發(fā)展與應(yīng)用1.熒光原位雜交技術(shù)（FISH）與熒光定量PCR技術(shù)面對產(chǎn)前篩查出的高危病例后續(xù)診斷力量嚴(yán)重不足的現(xiàn)實問題，要在短期之內(nèi)解決巨大需求和醫(yī)療服務(wù)不足之間的矛盾十分困難。細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)人員培訓(xùn)周期長，加強(qiáng)產(chǎn)前診斷中心的技術(shù)力量也難以在短期內(nèi)實現(xiàn)。目前大多數(shù)產(chǎn)前診斷機(jī)構(gòu)的診斷力量和質(zhì)控能力有限，在這種情況下，引入快速產(chǎn)前診斷技術(shù)顯得十分必要。24年，英國國家篩查委員會（theUKNationalScreeningCommittee）推薦對唐氏綜合征采用新的篩查方案，即對篩查高危病例可直接采用熒光原位雜交技術(shù)（FISH）、熒光定量PCR（QF-PCR）等快速診斷方法進(jìn)行診斷，并僅限于13、18、21-三體。在我國，四川大學(xué)華西二院總結(jié)了該院1例羊水染色體結(jié)果，異常核型220例，其中FISH能夠檢出的有135例（21-三體和18-三體共85例，性染色體數(shù)目異常51例），染色體平衡易位和倒位68例，F(xiàn)ISH不能檢出的、但可能有臨床表現(xiàn)的異常核型17例，其中嵌合體9例，標(biāo)記染色體3例（親代亦有），有明確畸形的5例，但此5例超聲均有陽性表現(xiàn)。這一研究也表明，F(xiàn)ISH或QF-PCR可以作為針對產(chǎn)前篩查高危孕婦的產(chǎn)前診斷方法。我國產(chǎn)前篩查和產(chǎn)前診斷工作量巨大，解決篩查后續(xù)診斷的問題是降低出生缺陷的必要環(huán)節(jié)。產(chǎn)前篩查的目標(biāo)疾病是以21-三體和18-三體為主的常見染色體非整倍體，并不包括其他染色體異常，從技術(shù)層面上講，快速產(chǎn)前診斷技術(shù)完全可以解決這部分病例的診斷問題，在臨床實踐中可以作為一項單獨的產(chǎn)前診斷技術(shù)，但必須明確該項技術(shù)在整個產(chǎn)前篩查和產(chǎn)前診斷體系中的定位及適應(yīng)征，即沒有異常妊娠史、產(chǎn)前篩查高危、常見非整倍體的特定人群，其他有細(xì)胞遺傳學(xué)產(chǎn)前診斷適應(yīng)征的孕婦仍應(yīng)進(jìn)行細(xì)胞遺傳學(xué)診斷。在實際工作中，染色體核型分析失敗或大孕周的產(chǎn)前診斷也靠快速診斷來實現(xiàn)。從這個意義上講，將快速產(chǎn)前診斷方法作為單獨的產(chǎn)前診斷方法，和產(chǎn)前診斷實施細(xì)則中提出的產(chǎn)前細(xì)胞遺傳學(xué)診斷適應(yīng)征并不沖突。但要將快速診斷納入到產(chǎn)前篩查-產(chǎn)前診斷體系中，仍需解決技術(shù)和行政層面的問題。技術(shù)層面上，尚需進(jìn)行大樣本前瞻性試驗，和細(xì)胞遺傳學(xué)的金標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行對比，其定位和適應(yīng)征只包括產(chǎn)前篩查發(fā)現(xiàn)的常見非整倍體的高危人群。在獲得這些技術(shù)資料之后，提出在中國人群應(yīng)用快速診斷的技術(shù)依據(jù)和行業(yè)建議，進(jìn)而在行政層面上解決快速診斷的合法性問題。2.各種基因芯片和染色體微陣列分析技術(shù)染色體微缺失綜合征是由小段的染色體缺失所造成(<5Mb)。對于常染色體而言，該區(qū)域會造成基因缺失及基因產(chǎn)物不足的效應(yīng),會合并先天性畸型及智力障礙。被報告的染色體微缺失綜合征已經(jīng)超過二十種，大部份屬于罕見病，但由于我國出生人數(shù)目巨大，微缺失綜合征患兒大多嚴(yán)重殘疾，但可相對長期存活，并大多有生育能力，為家庭和社會造成巨大的經(jīng)濟(jì)，值得控制出生缺陷相關(guān)工作的重視。FISH、BoBs液態(tài)基因芯片檢測技術(shù)均可用于微缺失綜合征的診斷，但靈敏性最高的當(dāng)屬染色體微陣列分析技術(shù)。染色體微陣列分析(chromosomalmicroarrayanalysis，CMA)技術(shù)又被稱之為“分子核型分析”，能夠在全基因組水平進(jìn)行掃描，發(fā)現(xiàn)大量的拷貝數(shù)變異(copynumbervariants，CNV)，尤其是對于染色體微小缺失、重復(fù)等異常的診斷具有突出的優(yōu)勢。根據(jù)芯片平臺及其所檢測出的CNV類型的不同，CMA技術(shù)可被分為兩大類：單核苷酸多態(tài)性微列陣(singlenucleotidepolymorphismarray，SNParray)和基于微陣歹寸的比較基因組雜交(array-basedcomparativegenomichybridization，aCGH）技術(shù)。通過aCGH技術(shù)能夠很好地檢出CNV來，而SNParray的優(yōu)勢在于除了能夠檢出CNV以外，還能夠檢測出大多數(shù)的單親源雙（uniparentaldisomyUPD），并且可以檢測到低水平的嵌合體。近年來，CMA在產(chǎn)前診斷領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣泛。2012年，RonaldJ.Wapner等對4406例產(chǎn)前診斷標(biāo)本分別進(jìn)行了核型分析和microarray分析。在產(chǎn)前診斷病例中，microarray分析的成功率為98.8%，87.9%的產(chǎn)前標(biāo)本不需要細(xì)胞培養(yǎng)。在4282例非嵌合體標(biāo)本中，所有的非整倍體異常和非平衡性異位病例都被染色體核型分析及microarray分析同時檢出，但microarray無法檢出其中的平衡異位及染色體三倍體異常病例（分別占所有病例的0.9%和0.4%）。在所有染色體核型分析正常的病例中，發(fā)現(xiàn)胎兒有超聲異常的病例組中microarray檢測能發(fā)現(xiàn)6.0%的病例有病理性意義的染色體微小位點異常，而在高齡孕婦組中microarray能提高異常檢出率1.7%，在篩查高危組中提升的檢出能力是1.6%?；谏鲜鲅芯拷Y(jié)果，不少學(xué)者提出CMA技術(shù)有可能取代傳統(tǒng)的核型分析，使之成為產(chǎn)前診斷的一線方案°Microarray應(yīng)用于產(chǎn)前診斷，是這項技術(shù)臨床應(yīng)用的轉(zhuǎn)折和飛躍。從基于臨床異常表型，被動地進(jìn)行全基因組掃描來發(fā)現(xiàn)異常的線索，到產(chǎn)前主動尋找、認(rèn)定有臨床意義的染色體位點缺陷，從而明確臨床干預(yù)的策略。在這種應(yīng)用過程中，CMA技術(shù)能帶來診斷靈敏度的大幅度上升，但也存在異常數(shù)據(jù)臨床解讀與芯片數(shù)字化結(jié)果不確定性的問題。要重視檢測過程中的質(zhì)量控制，防止檢測環(huán)節(jié)的假陽性結(jié)果。將CMA檢測用于產(chǎn)前診斷時，若有不能明確意義的位點異常出現(xiàn)，需抽取無表型異常的父母雙方外周血進(jìn)行分析,以明確該位點異常是新發(fā)的還是繼承性的.對于新發(fā)的有明確臨床意義的染色體位點異常（往往為染色體位點缺失），強(qiáng)調(diào)需進(jìn)行可視化的FISH探針驗證以明確該位點異常是客觀存在的，這樣才能據(jù)此作為臨床診斷和后續(xù)干預(yù)決策的依據(jù)。（三）分子時代核型分析技術(shù)的重要性在細(xì)胞分子遺傳時代，雖然各種分子診斷技術(shù)發(fā)展迅猛，但核型分析技術(shù)依然處于非常重要的地位。核型分析技術(shù)依然是許多染色體顯著性異常，包括多倍體，平衡異位以及嵌合體等唯一的診斷技術(shù)。染色體核型分析具有的價格低廉，檢測設(shè)備依賴性低，以及檢測結(jié)果的確定性好等特點依然無法被其它分子技術(shù)所比擬。從診斷染色體異常譜和成本來看，核型分析是性價比最好的診斷技術(shù)。核型分析是遺傳診斷主流技術(shù)的地位仍然沒有動搖。（四）分子檢測面臨的問題目前，胎兒游離DNA檢測技術(shù)、FISH、QF-PCR以及CMA還沒有取得用于產(chǎn)前篩查或診斷的臨床體外檢測行政許可，這是新技術(shù)應(yīng)用時必須要考慮的問題。產(chǎn)前診斷是一項具有高科技性、高不確定性、高風(fēng)險性的專業(yè)技術(shù)，分子診斷技術(shù)發(fā)展迅速，盡快解決新技術(shù)面臨的一系列行政許可問題，將有利于臨床機(jī)構(gòu)規(guī)范醫(yī)療體系，規(guī)避醫(yī)療風(fēng)險，為臨床的應(yīng)用奠定