第四講-植物病害生物防治的研究方法

第四講植物病害生物防治的研究方法

假如把地球演化到今天的歷史濃縮到一天，地球誕生是24小時中的零點，地球誕生-零點，地球的首批居民-厭氧性異養(yǎng)細菌早晨7點鐘好氧性異養(yǎng)細菌-午后13點左右，魚和陸生植物-晚上22點；人類-一天的最后一分鐘才出現(xiàn)。1首批居民—厭氧性異養(yǎng)細菌好氧性異養(yǎng)細菌4人類3魚和陸生植物盡管人類對微生物的利用已有幾千年的歷史，現(xiàn)代微生物學也經(jīng)歷了一個多世紀的發(fā)展，但至今，為人們所認識的微生物種類仍僅占自然界中微生物總數(shù)的1%～5%，人類生產(chǎn)和生活中開發(fā)利用的則更少。因此，微生物可能是地球上最大的、尚未有效開發(fā)利用的自然資源。

目前已知的細菌不足6000種（估計在30000種以上），真菌不足80000種（估計在1500000種），目前為人類所了解的數(shù)目約占總數(shù)的5％；僅有約1%保存于世界各地菌種中心，并被開發(fā)利用。

一個國家對生物資源掌握得越多、研究得越深入、利用得越充分，就越能掌握自己國家的未來發(fā)展?？茖W家們普遍相信，至少20%以上的昆蟲腸道系統(tǒng)或體內(nèi)均可分離出多種單一宿主的絕對寄生微生物。因此，在昆蟲種類數(shù)目未清楚前，所有微生物種類的數(shù)量都可能被低估。隨著人類對生命過程認識的加深，生物技術已成為實現(xiàn)社會可持續(xù)發(fā)展的最有潛力的技術手段。

利用拮抗微生物或拮抗微生物產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物來防治植物病害是植物病害防治中十分重要的有效措施之一。拮抗微生物具有不易使病原菌產(chǎn)生耐藥性，對人畜安全無毒，不污染環(huán)境，無殘留，不傷害有益微生物，能保持生態(tài)平衡，而且生產(chǎn)工藝較簡單，開發(fā)和登記費用低于化學農(nóng)藥，以及不少拮抗微生物同時具有對作物的促生作用等特點而引起越來越多的人們的關注和重視。

從50年代起，國內(nèi)外許多科研機構、高等院校以及商業(yè)公司都開展了利用拮抗微生物防治植物病害的研究。目前己經(jīng)分離篩選到一大批對各種植物病害具有不同程度防治效果的各類拮抗微生物，其中有相當一部分己經(jīng)獲得農(nóng)藥登記進入商品化。

自然界的微生物資源非常豐富，利用有益的拮抗微生物進行生物防治的開發(fā)潛力很大，采用遺傳工程的方法改良生防菌株，進一步提高生防效果，擴大生防范圍具有巨大的經(jīng)濟價值和效益，為開發(fā)無公害、綠色食品和保護環(huán)境開辟了廣闊的道路。第一節(jié)拮抗微生物的分離培養(yǎng)一、樣品采集

（一）土壤拮抗微生物

土壤具有微生物生長繁殖所需要的一切營養(yǎng)物質(zhì)及各種條件，因此土壤是微生物良好的生活場所，有“微生物的天然培養(yǎng)基”之稱。土壤微生物種類繁多，數(shù)量極大，其中以土壤表層或耕作層中及植物根附近微生物數(shù)量較多。土壤越肥沃，微生物種類和數(shù)量越多。地球表面存在大量的微生物土壤微生物（Soilmicrobe）雪域高原微生物（1）細菌

土壤中數(shù)量最多的微生物。占土壤微生物總量的70%～90％，田間土壤中一般為106～108個/cm3，其中上層15厘米的土壤中，細菌鮮重為1500-3700公斤/公頃。土壤細菌soilbacteria革蘭氏陽性菌Gram+

節(jié)桿菌屬Arthrobacter芽胞桿菌Bacillus梭菌屬Clostridium

革蘭氏陰性菌Gram-假單胞菌Pseudomonas根瘤菌Rhizobium,（大豆根瘤菌Bradyrhizobiumjaponicum）

固氮菌Azotobacter亞消化單胞菌Nitrosomonas硝化甘油菌Nitrobacter農(nóng)桿菌Agrobacterium2.大腸桿菌Escherichiacoli1.芽孢桿菌Bacillussubtilis3.棒狀桿菌Corynebacterium細菌種類桿狀菌Bacillus梭菌屬Clostridium內(nèi)生芽胞桿菌Endospore-bearingbacteria假單胞菌Pseudomonasaeruginosa陰溝腸桿菌EnterobactercloacaeBordetellapertussis乳酸菌Lactobacillus鏈球菌Streptococcussobrinus葡萄球菌Staphylococcus葡萄球菌Staphylococcus螺原體Spirillum

Borreliaburgdorferi藍藻細菌Cyanobacteria（2）放線菌

是土壤中另一類主要的微生物類群，數(shù)量僅次于細菌，占微生物區(qū)系總量的13～14%。放線菌多存在于偏堿性的土壤中，大部分土壤放線菌屬于鏈霉菌科的三個屬：鏈霉菌屬（Streptomyces）小單孢菌（Micromonospora）諾卡氏菌屬（Nocardia）土壤或根圍中的鏈霉菌大多數(shù)種都歸于鏈霉菌屬。放線菌雖然數(shù)量比細菌少，但由于其菌絲體的體積比單個細菌大幾十倍甚至幾百倍，所以在土壤中的生物量也相近于細菌。放線菌Actinomycetes

目前已發(fā)現(xiàn)的微生物產(chǎn)生的上萬種抗生素中，70%以上是放線菌產(chǎn)生的。土壤是放線菌棲居的重要場所，其理化性質(zhì)和土壤形成環(huán)境強烈影響并決定著土壤放線菌的種類、數(shù)量及其分布。從土壤中獲得具有高效抗菌活性的抗生素產(chǎn)生放線菌，是目前世界范圍內(nèi)研制開發(fā)新醫(yī)藥和新農(nóng)藥必不可少的基礎工作。

（3）土壤真菌

數(shù)量排第三位。土壤中的真菌各種類型都有，以半知菌類為最多，主要分布于土壤表層中。真菌和細菌（Fungiandbacteria）CulturableandunculturableFungibacteria有機營養(yǎng)型或異養(yǎng)型微生物：只利用現(xiàn)成有機物質(zhì)的微生物。無機營養(yǎng)型或自養(yǎng)微生物：一些靠二氧化碳和碳酸鹽自食其力的微生物。微生物具有極強的抗熱、抗寒、抗鹽、抗干燥、抗酸、抗堿、抗缺氧、抗壓、抗輻射及抗毒物等能力。相互作用ComplexityInteractionsL1L2CnbL1L1ThelichenPeltulaUnidentifiedlichenMicrocoleusvaginatus地木耳NostocN2N2與地衣共生藻類（二）根際促生微生物

根際是指生物和物理特性受根系緊密影響的區(qū)域，它與微生物群系共同構成一個極復雜的生態(tài)區(qū)系，是確保植物根系生長發(fā)育正常進行的生境場所，也是植物與外界環(huán)境進行物質(zhì)與能量交換的主要場所，此處微生物多樣性豐富，具有強烈的根際效應。因此，根際微生物所形成的微生物環(huán)境對植物生長起到極其重要的作用。

根際存在著許多對植物有益的細菌群落，包括生防細菌、能生產(chǎn)植物生長激素的細菌和固氮菌等。根際有益細菌能夠促進植物對礦質(zhì)營養(yǎng)的吸收和利用，或者產(chǎn)生促進植物生長的代謝物，甚至抑制有害微生物。因此，這類能夠直接或間接促進植物生長的細菌又被稱為根際促生細菌（Plantgrowth-promotingrhizobacteria，PGPR）。

根際促生細菌主要通過兩種方式發(fā)揮作用：1）抑制植物的病原微生物和減輕病原菌的毒害作用。2）PGPR也可以通過其它方式促進植物生長，如固氮作用、促進營養(yǎng)物質(zhì)（如磷）的溶解、促進菌根功能、調(diào)節(jié)根部乙烯的產(chǎn)生、釋放植物生長素及減輕重金屬毒性等。

在農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中，充分利用這些細菌的生物學潛力將有助于減少化肥和農(nóng)藥投入、促進植物生長、減輕環(huán)境污染，實現(xiàn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展。（三）植物附生與內(nèi)生拮抗微生物

人們早巳發(fā)現(xiàn)綠色植物葉（果）面棲居有大量微生物。在一百多年前微生物學家就從植物葉面分離到許多真菌和細菌。1910年Potter首先證實，葉面附生微生物在干擾真菌引起的葉部病害中起著重要作用。上世紀50-60年代，Last和Ruinen從分別對禾谷類作物葉面和熱帶森林葉表微生物生態(tài)進行系統(tǒng)研究以后，極大地促進了人們對葉面微生物的研究，近年來不斷涌現(xiàn)的病、蟲、草害生物防治成功的事例進一步激發(fā)了人們對葉（果）部病害生物防治的興趣。

植物內(nèi)生菌作為微生物中的重要類群，其種的數(shù)量龐大。植物的生長環(huán)境直接影響內(nèi)生菌的生物多樣性，而植物種植的年代也直接影響其生物多樣性、抗病蟲性，年代越久遠，其內(nèi)生菌的生物多樣性越豐富；抗病和抗蟲性越強的植物，其所含的內(nèi)生菌具有抗菌和殺蟲活性的可能性就越大；具有藥用性能的植物，其所含的內(nèi)生菌有可能產(chǎn)生植物相同或相似的活性物質(zhì)。

有數(shù)據(jù)顯示，51%的從藥用植物內(nèi)生菌分離的生物活性物質(zhì)是以前沒有發(fā)現(xiàn)的化合物，而從土壤微生物發(fā)現(xiàn)的新物質(zhì)僅為38%。由此可見，研究藥用植物內(nèi)生菌，尋找具有農(nóng)藥活性的次生代謝產(chǎn)物是研發(fā)新型生物農(nóng)藥的重要途徑。（四）海洋拮抗微生物

占地球面積71%的海洋環(huán)境非常復雜，造成生活在其中的生物在物種、基因等方面都異于陸地生物。從20世紀80年代開始，國內(nèi)外對海洋微生物的研究越來越多，隨著生物技術的進步，更加促進了海洋微生物的開發(fā)利用。其中許多海洋微生物的次級代謝產(chǎn)物對農(nóng)業(yè)病蟲害有很好的抑制作用。

隨著陸生資源的不斷減少，人們在陸地資源中找到適合開發(fā)的生物資源越來越困難了，所以更多的人們將眼光轉(zhuǎn)向了占地面積更廣，開發(fā)較少的海洋資源上。生活在其中的微生物由于其生活環(huán)境異于陸生生物，造成其產(chǎn)生的活性物質(zhì)與陸生微生物有明顯的不同，因而具有更大的開發(fā)價值。溫泉水微生物AnimalsPlants水體微生物(蘇聯(lián))東方號站南極冰川微生物BacteriainAntarticicecoresMineDrainage礦山水二、分離與培養(yǎng)（一）一般分離方法

不同來源的微生物種類繁多，其分離的方法不同，而同一材料又可以用不同的方法分離，常用的微生物分離方法可以分為兩大類，即組織分離和稀釋分離法。[1]組織分離法

多用于植物內(nèi)真菌的分離。取植物組織塊用清水洗去污泥后，在超凈臺上無菌水清洗數(shù)次后，用75%（v/v）酒精中浸泡數(shù)秒，消除表面氣泡，再用5%（m/v）次氯酸鈉或0.1%升汞浸泡消毒后，立即用無菌水洗滌數(shù)次，用滅菌紙吸干水分，然后用無菌剪刀將各組織剪成4-5mm小塊，接種于培養(yǎng)基平板上。組織分離法[2]稀釋分離方法

將材料充分研磨或分散后，配成懸浮液，經(jīng)稀釋后與熔化并冷卻到45℃左右的瓊膠培養(yǎng)基混合，然后倒在滅菌的培養(yǎng)皿中。稀釋分離法可以使細菌、放線菌菌落充分分散開，容易分離得到純培養(yǎng)。稀釋分離法方法：培養(yǎng)皿稀釋分離法平板劃線分離法稀釋涂布法等。培養(yǎng)皿稀釋分離法稀釋涂布法平板劃線分離法（二）各種材料微生物的分離培養(yǎng)方法1.土壤微生物分離與培養(yǎng)

首先要制備土壤溶液，將土壤溶于水中，然后配置基本培養(yǎng)基，將土壤溶液可以采取涂平板的方式，涂在基礎培養(yǎng)基上，培養(yǎng)出土壤溶液中的全部微生物，選擇所需的菌種，然后再配制選擇培養(yǎng)基，根據(jù)要篩選的細菌的營養(yǎng)類型，選擇培養(yǎng)基，比如，抗性、營養(yǎng)缺陷型等，選出單菌落，進行多次劃線培養(yǎng)，最終可篩選出想得到的微生物。具體步驟：1.1樣本采集及處理為了獲得種類齊全的菌種，采集土樣時，需要綜合考慮不同微生物生存的環(huán)境條件。例如，酵母菌主要分布于含糖較豐富且偏酸的環(huán)境，因此應選取有機質(zhì)豐富的多年果園或瓜園土樣為宜。采樣時，鏟除表土，垂直取距離地表5～15cm深度的土壤。土樣帶回實驗室進行處理，依次制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7不同稀釋濃度的土壤菌懸液。1.2培養(yǎng)基的配制根據(jù)四大類微生物適宜營養(yǎng)條件的差異，需配制不同的培養(yǎng)基。分離微生物的培養(yǎng)基應該使用常規(guī)的選擇培養(yǎng)基，而不宜選用特殊的選擇培養(yǎng)基。細菌、放線菌、酵母菌、霉菌四大類微生物選用的培養(yǎng)基分別為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、高氏1號培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基和馬丁氏培養(yǎng)基。

為了最大限度地避免雜菌污染，需要在培養(yǎng)基的成分中添加適宜的殺菌劑或抑菌劑，以保證所得實驗菌種的質(zhì)量。如高氏1號培養(yǎng)基中添加75μg/mL濃度的重鉻酸鉀，可減少細菌及真菌的數(shù)量；PDA培養(yǎng)基和馬丁氏培養(yǎng)基分別添加50μg/mL和30μg/mL濃度的鏈霉素用以分離酵母菌與霉菌。配制完畢后調(diào)節(jié)pH值，各自分裝于三角錐形瓶中，120℃滅菌20min，備用。培養(yǎng)基配制的一般過程培養(yǎng)基制作過程

1、準備工作2、稱量、材料預處理3、煮熬4、過濾、加可溶性藥物5、熬瓊脂、定容6、營養(yǎng)液分裝7、滅菌處理8、擺斜面9、倒平板

在培養(yǎng)基冷卻到50C°左右時，在酒精燈附近倒平板或制斜面。10、無菌檢測1.3接種及培養(yǎng)每個實驗組取9套無菌平皿，在皿底貼上標簽，注明培養(yǎng)基類型、土壤稀釋液的稀釋度、組別、操作日期等。然后，用所指定的培養(yǎng)基制成空白平板。冷凝后，用無菌吸管分別吸取3個稀釋濃度的菌液各0.1mL（分離細菌取10-7～10-5，分離放線菌、酵母菌、霉菌取10-5～10-3）。用無菌三角涂棒將菌液均勻涂布在培養(yǎng)基表面，每一稀釋度涂布3個平行樣，將培養(yǎng)皿放入恒溫培養(yǎng)箱中。

培養(yǎng)時注意將平皿倒置，一方面可以防止培養(yǎng)基過分失水干裂或縮小，另一方面可以避免皿蓋上的冷凝水滴到正在生長的菌落上，影響后期的觀察和使用。

溫度是影響微生物生長的重要因素之一。不同種類的微生物，對外界環(huán)境的溫度要求不同。細菌的常規(guī)培養(yǎng)適宜溫度為35～38℃。酵母菌培養(yǎng)溫度最好控制在28～30℃。放線菌及霉菌菌生長的最適溫度是28～32℃。在相應的培養(yǎng)溫度下，細菌與酵母菌的培養(yǎng)時間為2～3d，霉菌則需要3～7d，放線菌的培養(yǎng)時間比霉菌長一些，一般需要5～10d才能長成菌落，少數(shù)生長緩慢的種類所需時間更長至半個月之久。

上述方法也可用于植物附生微生物的分離培養(yǎng)，與土壤微生物不同的是植物附生微生物需要將葉（果）面微生物沖洗下來后進行。2.植物內(nèi)生菌的分離與培養(yǎng)

植物的根、莖、葉、花、果實等器官的組織中均有內(nèi)生菌存在。通常選取長勢好、無病害的植株，采用直接切取植物組織分離的方法或榨取植物組織汁液稀釋分離的方法從植物體中分離內(nèi)生菌。一般來說，一個典型植物內(nèi)生菌的分離步驟包括以下幾步：1）材料的收集；2）采集所需要的部位到實驗室；3）組織的清洗；4）表面消毒；5）利用無菌操作技術將組織切割成1-2cm；6）第二次表面消毒；7）將植物組織直接接種于生長培養(yǎng)基上或者將消毒后的材料研磨再取汁液涂布平板；8）對寄主植物的再接種與再分離。2.1內(nèi)生細菌的分離與培養(yǎng)從健康植物組織中分離內(nèi)生細菌的方法很多，關鍵在于植物表面要完全消毒，從而保證所分離的細菌都來源于植物組織內(nèi)部。目前，所采用的消毒方法一般都是常規(guī)的次氯酸鈉、乙醇和升汞消毒。但是不同的植物或植物的不同部位、不同生育期，其結構或生理特性都不同，因此，對其表面所采取的消毒方式也不同，samish等曾對不同的消毒技術進行比較，并形成標準的程序：首先，用自來水或商品凈化劑反復沖洗植物表面，按照材料的不同決定次氯酸鈉、乙醇或升汞的濃度和最佳的消毒時間，再用無菌水沖洗，最后，用無菌濾紙吸干水分。目前，大多采用的都是這種消毒方法。為了確定消毒是否徹底，可將最后一次沖洗過植物組織的水涂布平板，若無細菌則可以證明分離到的細菌全部都是內(nèi)生菌。將表面消毒過的植物材料進行進一步分離，通常有兩種方法：①組織塊分離：把組織材料切成薄片或?qū)⒂兄旱墓麑嵅牧嫌孟疽埔汗艽倘雰?nèi)部吸取汁液涂于平板培養(yǎng)基上。這種技術方法操作簡單，可減少污染，但由于細菌在植物組織內(nèi)的分布不均勻，分離內(nèi)生細菌數(shù)量和種類少，不能代表整個植物材料的內(nèi)生細菌的數(shù)量和種類。②稀釋分離法：將植物材料搗碎放在無菌研缽中，加入無菌水或生理鹽水充分研磨，吸取汁液并稀釋后涂布平板。這種分離方法操作也比較簡單，分離得到的內(nèi)生細菌數(shù)量和種類也比較多，但對一些比較難研碎的植物材料，比如某些植物的根、樹木的木質(zhì)部等，不易搗碎和研磨。因此，需要根據(jù)不同的組織或材料選取較為適宜的分離方法。

分離植物內(nèi)生細菌很關鍵的一步就是培養(yǎng)基的選擇。同一種材料，因培養(yǎng)基的不同，分離的結果無論是細菌的種類還是細菌的數(shù)量，均存在較大的差異。一般常用的培養(yǎng)基有馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（NA）和蛋白胨酵母膏培養(yǎng)基（LA）等。隨著細菌遺傳學的發(fā)展以及對植物與內(nèi)生細菌關系的進一步研究，人們?yōu)榱双@得不同種類的內(nèi)生細菌，常根據(jù)其特性選擇不同的培養(yǎng)基，例如，分離熒光假單胞可選擇KB培養(yǎng)基（2%蛋白胨、1%甘油、0.15%K2HPO4、0.15%MgSO4·7H2O、1.5%瓊脂，pH=7.2）培養(yǎng)，然后在紫外燈下檢測是否有熒光；還可以在一些常用的培養(yǎng)基的基礎上補充糖、無機鹽、有機鹽等成分，從而分離富含糖、無機鹽、有機鹽的植物組織中的內(nèi)生細菌。此外，在分離所需內(nèi)生細菌的培養(yǎng)基中還應該加入抑制劑，抑制真菌等雜菌的生長。不同的植物材料選擇不同的培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間，盡可能的獲得更多的內(nèi)生細菌。盡管如此，組織分離的方法還是存在一定的局限性，除了培養(yǎng)基的成分選擇收到一定的限制外，仍然不可避免的會漏掉那些寄生程度高，與植物密切相關的內(nèi)生細菌，因此，內(nèi)生細菌的分離方法還有待于更進一步的改進。2.2內(nèi)生真菌的分離與培養(yǎng)

從不同類型的植物組織中分離內(nèi)生真菌的消毒方法在不斷地改進，消毒溶液的濃度和清洗時間有些不同，但目前最常用的是乙醇、次氯酸鈉和乙醇三部消毒法。研究結果表明，三步消毒法可以有效的去除表明的厚壁子囊孢子和分生孢子。需要注意的是：在消毒前，先對樣品進行自來水的清洗時非常重要的，它可以減少消毒花費的時間。對樣品的預處理，還可以使用超聲波和消毒劑等方法。總之，預處理是非常重要的，如果單獨使用三步消毒法，一些鑲嵌在組織表面的真菌可能沒被殺死，以至于當做內(nèi)生真菌被分離出來。

培養(yǎng)基的選擇在內(nèi)生真菌的分離過程中也是非常重要的，通常是應用“非選擇性”培養(yǎng)基，以利于盡可能的分離到更多的真菌，迄今為止內(nèi)生真菌可以在所有的人工培養(yǎng)基上生長，如麥芽提取物瓊脂培養(yǎng)基（MEA）、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）等。但是一些生長快速和容易產(chǎn)孢的菌株經(jīng)常覆蓋了生長緩慢的菌株，所以需要通過一些方法減慢或限制真菌的快速生長，便于分離到生長緩慢的菌株，以便更全面的調(diào)查內(nèi)生真菌群落的組成?，F(xiàn)在常用的方法是在瓊脂培養(yǎng)基中加入一些能限制菌株的快速生長，但并不引起細胞死亡的試劑，如抗生素類。3.海洋微生物的分離與培養(yǎng)

海洋環(huán)境中蘊含著豐富的微生物資源，其在生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用，與人類生活息息相關。但是迄今通過傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法可被培養(yǎng)分離的海洋微生物不到1%。主要是由于傳統(tǒng)培養(yǎng)方法存在一些局限性，只有少部分的海洋微生物能夠得到純培養(yǎng)，表現(xiàn)在以下幾個方面：(1)實驗室培養(yǎng)條件同自然條件的差異影響了海洋微生物的可培養(yǎng)性。許多微生物在自然環(huán)境中處于共生狀態(tài)，或受其他微生物及其代謝產(chǎn)物的影響，海洋微生物在培養(yǎng)基上不能生長是由于離開了原來的共生環(huán)境，破壞了它們之間的共生關系以及一些必需生長信號的交流。例如一些海洋細菌處于活的非可培養(yǎng)狀態(tài)，為適應不良環(huán)境整個細菌細胞縮小成球形，在培養(yǎng)基上于常規(guī)條件下培養(yǎng)時，不能生長繁殖，需要提供特殊的培養(yǎng)條件方可獲得培養(yǎng)。(2)微生物之間的拮抗作用導致了一些海洋微生物生長受抑制。

當微生物從自然環(huán)境進入人為環(huán)境時，一些環(huán)境適應性強的優(yōu)勢菌群快速生長，在此過程中產(chǎn)生大量過氧化物、超氧化物以及自由基等有害物質(zhì)，這些物質(zhì)能對細胞造成氧化脅迫從而使細胞受到損傷，因此使適應能力較差或生長緩慢的菌群受到抑制，難以在固體培養(yǎng)基中形成菌落。以上原因?qū)е铝舜罅康暮Ｑ笪⑸镔Y源被埋沒，極大地限制了海洋微生物的應用。海洋微生物分離培養(yǎng)常用的方法有：3.1稀釋培養(yǎng)

稀釋培養(yǎng)是指將樣品稀釋到已知數(shù)量的細胞濃度后，接入滅菌海水中進行培養(yǎng)的一種方法。Button等采用稀釋培養(yǎng)法結合流式細胞儀研究海洋細菌多樣性，結果發(fā)現(xiàn)，稀釋培養(yǎng)九周后的微生物細胞濃度可達到104/mL，細胞的倍增時間差異明顯，短的只需一天，長的達一周。戴欣等比較了普通培養(yǎng)和稀釋培養(yǎng)的分離效果，發(fā)現(xiàn)稀釋培養(yǎng)基上生長的細菌數(shù)量普遍是普通牛肉汁瓊脂培養(yǎng)基上生長的細菌數(shù)量的3~5倍，通過稀釋培養(yǎng)可以獲得更多的純化菌株。3.2高通量培養(yǎng)

為了提高分離效率，Connon等在稀釋培養(yǎng)法的基礎上提出高通量培養(yǎng)方法。該方法是將樣品濃度稀釋至103/mL后，采用48孔細胞培養(yǎng)板分離培養(yǎng)微生物。通過高通量培養(yǎng)技術可將樣品中14%的微生物純培養(yǎng)出來，遠高于傳統(tǒng)分離技術所培養(yǎng)的微生物數(shù)量。3.3擴散盒培養(yǎng)

為了能夠讓海洋微生物在原位條件下進行富集生長，最終得到純培養(yǎng)的微生物，Kaeberlein等設計開發(fā)了擴散盒培養(yǎng)方法。該擴散盒由一個環(huán)狀的不銹鋼墊圈和兩側(cè)膠連的0.1μm濾膜組成，將含有海洋微生物的樣品加至封閉的擴散盒中，在模擬采樣點環(huán)境的玻璃缸中進行培養(yǎng)。這種方法的優(yōu)點是最大程度上模擬微生物所處的自然環(huán)境，環(huán)境中化學物質(zhì)可以自由交換、微生物群落之間可以相互聯(lián)系，保證微生物生存環(huán)境的原位性，從而提高微生物的可培養(yǎng)性。3.4微囊包埋技術

微囊包埋技術是另一種高效、高通量的海洋微生物分離技術。Zengler等將海水和土壤樣品中的微生物進行稀釋后制成包埋單個微生物細胞的瓊脂糖微囊，然后將微囊裝入凝膠柱內(nèi)流態(tài)培養(yǎng)，結合流式細胞儀進行檢測，獲得大量純培養(yǎng)微生物，同時發(fā)現(xiàn)了一些新的細菌16SrRNA基因分支。通過進一步研究表明，微囊包埋技術可以用于超過10000個環(huán)境樣本中的細菌和真菌的分離。美國Diversa公司利用該方法成功培養(yǎng)出一些新菌種，獲得較高的分離效率，但由于該方法建立的時間較短，還存在一些如包埋基質(zhì)透性差、微生物熱敏感等技術問題。

綜上所述，海洋微生物可培養(yǎng)技術在近年來得到了一定的發(fā)展，但仍然無法滿足人類探索海洋的迫切需要，因此還需要在進一步研究海洋微生物生理生化特性的基礎上，結合分子生物學技術，創(chuàng)建一些新的更能模擬海洋環(huán)境條件的培養(yǎng)方法，為海洋微生物資源的保護和利用提供更多的新菌株。三、菌種的保藏

菌種是國家的重要資源，是從事微生物學以及生命科學研究的基本材料，特別是利用微生物進行有關生產(chǎn)更離不開菌種。所以，菌種保藏是微生物學研究和微生物育種工作的重要組成部分，其目的是采用最合適的保存方法，使菌種的變異和死亡減少到最低限度。1.微生物菌種保藏的基本原理

菌種保藏主要是根據(jù)微生物生理生化特點，人工創(chuàng)造條件，使微生物代謝處于不活潑、生長繁殖受抑制的休眠狀態(tài)。目前，常采取低溫、干燥、缺氧3種方法，使菌種暫時處于休眠狀態(tài)。一種好的保藏方法在能長期保持菌種原有的優(yōu)良性狀不變的基礎上，還應考慮到操作方法的簡便性和經(jīng)濟性，以便生產(chǎn)上能推廣使用。2.微生物菌種的保藏方法2.1定期移殖法亦稱傳代培養(yǎng)保藏法，包括斜面培養(yǎng)、穿刺培養(yǎng)、液體培養(yǎng)（保藏厭氧細菌用）等。將菌種接種于是以的培養(yǎng)基中，最適條件下培養(yǎng)，待生長充分后，于4-6℃進行保存，間隔一定時間后需進行移殖培養(yǎng)。保藏時間依微生物的種類不同而不同。

此法操作簡單，但保存時間短，需要經(jīng)常移種，易變異。只能作為菌種的短期保藏。2.2液體石蠟保藏法亦稱礦物油保藏法。選用優(yōu)質(zhì)化學純液體石蠟，采用以下兩種方法進行滅絕：①121℃濕熱滅絕30min，置40℃恒溫箱中蒸發(fā)水分，經(jīng)無菌檢查后備用。②160℃干熱滅絕2h，冷卻后，經(jīng)無菌檢查后備用。把液體石蠟注入已長好菌的斜面上，并高出斜面頂端1cm，使菌種與空氣隔絕。將試管直立，置低溫（4-6℃）干燥處或室溫下保存。保藏期間應定期檢查，如培養(yǎng)基露出液面，應及時補充無菌的液體石蠟。

此方法簡便有效，保藏時間2-10年，可用于絲狀真菌、酵母、細菌和放線菌的保藏。特別是對難于冷凍干燥的絲狀真菌和難以在固體培養(yǎng)基上形成孢子的擔子菌等的保藏更為有效。缺點是必須直立存放，占空間大，不便攜帶。某些以石蠟為碳源或?qū)σ后w石蠟保藏敏感的菌株，不能用此法保藏。2.3沙土管保藏法取60~80目篩取河沙，用吸鐵石吸去鐵質(zhì)，用10%鹽酸浸泡24h后棄鹽酸，用水洗至中性，將沙子烘干備用。取地表下40~60cm非耕作層貧瘠且黏性較小的土，研碎后100目過篩并用水洗至中性，烘干備用。將處理后的沙、土按質(zhì)量比2：1混合?；靹虻纳惩练盅b入安瓿（bu）管或小試管中，高度為1cm左右，塞好棉塞，121℃濕熱滅菌30cm，無菌檢測合格后方可使用。把制備好的菌懸液分裝每支沙土管0.5ml，放線菌和霉菌可直接挑取孢子拌入沙土管中。塞好棉塞放入盛有干燥劑的容器中，用真空泵抽去水分。檢測合格后封口，存放于低溫（4~6℃）干燥處保藏，每隔半年驗證1次。

本方法操作簡便，設備簡單，適用于產(chǎn)孢子和有芽孢的菌種保藏，可保存兩年，但對營養(yǎng)細胞不適用。由于在真空干燥過程中，機械力容易造成孢子的死亡，因此，在保藏放線菌和部分真菌的孢子時最好用干法接種。2.4真空冷凍干燥保藏法安瓿管用2%鹽酸浸泡過夜，用自來水沖洗并用蒸餾水浸泡至pH中性，烘干后加入脫脂棉塞，滅菌備用。保護劑可選擇血清、脫脂牛奶和海藻糖等。將培養(yǎng)好的菌體或孢子加入保護劑制成菌懸液，分裝于安瓿管中，每支0.2ml。然后放入冰箱冷凍2h以上，當菌懸液溫度達到-20~35℃左右。將安瓿管在真空條件下熔封，低溫或常溫保藏。此法為菌種保藏方法中應用最廣泛的，是國際菌種保藏機構通常采用的方法之一，幾乎所有的微生物均可采用此法保藏。此法適用于菌種長期保存，一般可保存數(shù)年至十余年。方便之處在于因冷凍干燥管無須低溫保藏，所以運輸方便，但此法所需設備要求高，操作復雜，費用昂貴。2.5冷凍保藏法2.5.1普通冷凍保藏技術（-20℃）將培養(yǎng)好的固體或液體菌種用橡膠塞封口，置于普通冰箱中保藏。這一方法操作簡單但不適宜長期保藏。2.5.2超低溫冷凍保藏技術（-80~-60℃）將生長至對數(shù)生長中后期的微生物細胞，加入新鮮培養(yǎng)基使其懸浮，然后加入等體積的20%甘油或10%二甲基亞砜作為冷凍保護劑，混勻后分裝入冷凍管或安瓿管中，于-70℃超低溫冰箱中保藏。某些細菌或真菌菌種可通過此保藏法保藏5年而活力不受影響。2.6基因工程菌的保藏2.6.1穿刺保藏法在容量為2~3ml旋蓋玻璃小瓶中加入約2/3容量的LB瓊脂，滅菌后備用。用接種針挑取保藏菌株單菌落，針刺至瓶底，在適當溫度下培養(yǎng)過夜后避光保藏于4℃或室溫。穿刺法可保藏細菌2年。2.6.1甘油管冷凍保藏在細菌培養(yǎng)物中加入適量甘油（使甘油終濃度為15%），分裝至保存管，置于-20℃或-70℃冰箱中保藏。此法可保藏菌種1~10年。

由于微生物的多樣性，不同的微生物往往對不同的保藏方法有不同的適應性。因此。生物菌種在具體選擇保藏方法是必須對被保藏菌株的特性，則要盡可能多地采用各種不同的手段進行保藏，以免因某種方法的失敗而導致菌種的喪失。第二節(jié)拮抗微生物的活性評價方法離體抑菌活性測定1.1待測細菌-病原真菌平板對峙法將病原菌接種于PDA平板培養(yǎng)基中央，28℃培養(yǎng)，待菌絲長滿培養(yǎng)皿，用孔徑5mm的打孔器（藍槍頭）制作菌餅，將菌餅接到，PDA平板中央，離菌餅約3cm處，用接種環(huán)蘸取培養(yǎng)24h的菌株，在平板表面各劃1條約3cm的細線，以只接菌餅為對照，放于28℃培養(yǎng)，7天后，測量菌落直徑，計算菌落生長抑制率。每個處理3次重復。菌落生長抑制率按下式計算：菌落生長抑制率（%）=（對照菌落凈生長距離-處理菌落凈生長距離）/（對照菌落凈生長距離）×1001.2待測真菌-病原真菌平板對峙法將待測菌、病原菌接種于PDA平板培養(yǎng)基中央，28℃培養(yǎng)，待菌絲生長良好時，用孔徑5mm的打孔器制作菌餅，將菌餅接到PDA平板中央。用同樣方法打取待測菌菌餅，放置于離菌餅約3cm處，以只接菌餅為對照。放于28℃培養(yǎng)，7天后，測量菌落直徑，計算菌落生長抑制率。每個處理3次重復。菌落生長抑制率按下式計算：菌落生長抑制率（%）=（對照菌落凈生長距離-處理菌落凈生長距離）/（對照菌落凈生長距離）×1001.3待測細菌-病原細菌牛津杯法將病原細菌搖菌后，以病原菌液：NA培養(yǎng)基為1：20的比例制成帶菌平板，中間放一牛津杯，待培養(yǎng)基凝固后，向牛津杯中注入0.1ml的待測菌液，以注入NA液體培養(yǎng)基為對照，每個處理3次重復，于28℃培養(yǎng)48h，觀察抑菌情況，測量抑菌圈直徑。

1.4紙片擴散法：將濾紙片（Φ=5mm）浸泡在上述提取液和發(fā)酵濾液中過夜，使其充分吸收，微風略吹干后，平放于含有測試菌的培養(yǎng)基中，3次重復，并用相應的提取液作空白對照。制備好后的培養(yǎng)皿在37℃恒溫培養(yǎng)，24h后觀察，測其抑菌圈的大小，并根據(jù)抑菌圈大小計算出抑菌率。抑菌率（%）=（供試菌落直徑-對照菌落直徑）/供試菌落直徑×1001.5待測菌-病原細菌無菌濾液抑菌法帶菌平板制備方法同1.3，以注入NA/YE/PDA液體培養(yǎng)基為對照，每個處理3次重復，于28℃培養(yǎng)48h，觀察抑菌情況，測量抑菌圈半徑。1.6待測菌-病原真菌無菌濾液抑菌法挑取在對峙培養(yǎng)時有明顯抑菌作用的菌株于NA/YE/PDA液體培養(yǎng)基中，在28℃，130rpm的搖床中振蕩培養(yǎng)，將發(fā)酵液于4000rpm離心3min，上清液經(jīng)0.2μm孔徑的濾膜過濾，取無菌濾液2ml加入到冷卻至50℃左右的18mlPDA培養(yǎng)基中，輕輕搖勻，倒入孔徑為9cm的培養(yǎng)皿中，制成平板，以加NA/YE/PDA液體培養(yǎng)基為對照。用滅菌的打孔器（藍槍頭）打取直徑0.5cm的新鮮病原菌菌餅置于PDA平板中間，于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天，計算抑菌率。

抑菌率（%）=（對照病原菌真菌-測試病原菌直徑）/對照病原菌直徑×1002.活體抑菌活性測定2.1果實針刺測定法（1）保護作用測定法采摘健康新鮮的、形狀和大小均一的果實（帶蒂），表面用75%酒精擦拭消毒，晾干備用；將待測樣品用蒸餾水稀釋成不同濃度供試，用小型噴霧器噴于果實表面，底部鋪入濾紙并加無菌水保濕，24h后接種病原菌菌餅，接種時用無菌接種針輕輕刺破果實表皮，將3塊直徑為4mm的病原菌菌餅等距離反接在果實表面有破口處，置于25℃下保濕培養(yǎng)。（2）治療作用測定法果實處理和接種方法與保護作用測定相同，區(qū)別是先在25℃保濕條件下接種病原菌菌餅，24h后再噴施供試待測菌菌液，之后將其置于25℃下保濕培養(yǎng)。以上保護作用測定和治療作用測定每濃度處理均設3次重復，每個重復用果實3個，以相應的待測菌菌液作為對照。4天后測量各處理及對照的病斑直徑，計算相對防效。采用以下公式計算相對防效：

病斑直徑（mm）=測量直徑-4.0（菌餅直徑）

相對防效（%）=（對照病斑直徑-處理病斑直徑）/對照病斑直徑×1002.2真葉法（1）保護作用測定方法采摘健康新鮮葉齡相同的植株真葉，洗凈放于吸水紙上將表面水分晾干。采用Potter噴霧法于真葉上施待測菌菌液，晾干菌液后，在真葉正面的中間部位接種1塊4mm直徑的病原菌菌餅，放入鋪有吸水紙的培養(yǎng)皿中，并用浸水的棉花球包裹葉柄以保濕。25℃暗培養(yǎng)。3天后測量各處理的病斑直徑。（2）治療作用測定方法先在真葉上接種病原菌年菌餅，25℃暗培養(yǎng)，24h后，再施待測菌菌液進行培養(yǎng)（培養(yǎng)條件及施藥方法與保護作用測定方法相同）。3天后測量各處理菌落直徑。以上保護作用測定和治療作用測定每濃度處理均設3次重復，以噴施待測菌菌液為對照。采用以下公式計算相對防效：病斑直徑（mm）=測量直徑-4.0（菌餅直徑）相對防效（%）=（對照病斑直徑-處理病斑直徑）/對照病斑直徑×1002.3傷根接種法制備待測菌菌懸液和病原真菌孢子懸浮液。取同一基因型的組培苗種于盆中，待其長到一定高度時，用傷根法接種。設3個接種處理：Ⅰ為同時接病原菌和待測菌；Ⅱ為先接病原菌，后接待測菌；Ⅲ為先接待測菌，后接病原菌；以只接病原菌為對照。每一處理10株。接種后掛號標簽，置于溫室保濕培養(yǎng)，2個月后統(tǒng)計盆栽植株發(fā)病情況。不同作物的病情分級有不同的標準。第三節(jié)拮抗微生物的鑒定和多樣性分析一、菌株鑒定1.細菌菌株鑒定1.1細菌常規(guī)鑒定技術傳統(tǒng)細菌分類的主要依據(jù)是形態(tài)學、生理學和生態(tài)學特征，在長期的研究過程中建立了許多分類鑒定的方法，這些方法統(tǒng)稱表型分類學。1.1.1形態(tài)結構和培養(yǎng)特性觀察個體形態(tài)學特征，由于細菌的個體形態(tài)學特征不是受單個基因的控制，而是受多個基因的共同影響，個別基因的突變一般不會導致個體形態(tài)的明顯變化，因此，在特定的培養(yǎng)條件下，不同細菌的個體形態(tài)，存在相對穩(wěn)定性和特異性。加上個體形態(tài)易于鑒定，所以其個體形態(tài)學特征可以作為細菌分類鑒定的主要依據(jù)之一。微生物的形態(tài)結構觀察主要是通過染色，在顯微鏡下對其形狀、大小、排列方式、細胞結構及染色特性進行觀察，直觀地了解細菌在形態(tài)結構上的特性，根據(jù)不同微生物在形態(tài)結構上的不同區(qū)別鑒定微生物。不同微生物在某種培養(yǎng)基中生長繁殖，所形成的菌落特征存在很大差異，而同一種細菌在一定條件下，培養(yǎng)特征卻有一定穩(wěn)定性，可以據(jù)此對微生物加以區(qū)別。因此，微生物培養(yǎng)特性也是微生物檢驗鑒別中的一項重要內(nèi)容。1.1.2生理生化實驗不同細菌具有不同的酶系統(tǒng)，因而它們對營養(yǎng)物質(zhì)的需求、分解和利用能力、代謝途徑以及代謝產(chǎn)物存在差別。細菌的很多生理學、生理化學特征比較穩(wěn)定，可以作為細菌分類鑒定的重要依據(jù)。生理生化特征包括營養(yǎng)類型和其他的一些生理特征。微生物檢驗中常用的生化反應有糖酵解實驗、淀粉水解實驗、V-P實驗、甲基紅（MethylRed）試驗、靛基質(zhì)（Imodle）試驗、硝酸鹽（Nitrate）還原實驗、明膠（Gelatin）液化試驗、尿素酶（Urease）試驗、氧化酶（oxidase）試驗、硫化氫（HZS）試驗、二糖鐵（TSI）瓊脂試驗、硫化氫-靛基質(zhì)-動力(SIM)瓊脂試驗等。1.1.3血清學試驗血清學分類就是通過在體外進行抗原抗體反應（即血清學反應）來分析比較細菌之間的抗原特性而進行分類鑒定的一種放法。根據(jù)細菌物質(zhì)組成與結構的多樣性，可以對細菌的各種抗原物質(zhì)進行分析。在食品微生物檢驗中，常用血清學反應來鑒定分離到的細菌，以最終確認檢測結果。習慣上將經(jīng)典的血清學反應分三種類別：凝集反應、沉淀反應和補體結合反應。血清學反應的一般特點：①抗原體的結合具有特異性，當有共同抗原體存在時，會出現(xiàn)交叉反應。②抗原體的結合是分子表面的結合，這種結合雖相當穩(wěn)定但是可逆的。③抗原體的結合是按一定比例進行的，只有比例適當時，才能出現(xiàn)可見反應。④血清學反應大體分為兩個階段進行，但其間無嚴格界限。血清學反應具有特異性強、靈敏度高、簡便快捷等優(yōu)點，在細菌分類中受到高度的關注和廣泛的應用。由于同種或同屬內(nèi)不同菌株的抗原特性不同，從而可將它們分成不同的血清型[1]。抗原特性在細菌分類中的應用主要適用于抗原物質(zhì)同源性程度較高的細菌（如種內(nèi)不同菌株）之間的分析。目前，依據(jù)抗原特征對較高的分類單元,甚至對種進行分類還未能普遍采用。1.2分子生物學鑒定技術表型分類法雖然在細菌的分類和鑒定中發(fā)揮了重要的作用，但也存在著一些問題：表型表達可能不穩(wěn)定，敏感度不高，不具有廣泛的適用性，可能還受到血清變種的影響。由于細菌形狀微小、顯微結構簡單、易于傳播、一般缺少有性生殖過程等特點，依據(jù)形態(tài)學和生態(tài)學形狀進行分類受到很大的限制，生理生化特征對于分析細菌的系統(tǒng)發(fā)育也存在局限性。因此，克服表型分類法的缺點，現(xiàn)代細菌學家積極地尋找和探索新的分類特征，采用了遺傳學、分子生物學的技術方法，分析比較細菌的遺傳物質(zhì)基礎，獲得遺傳學特征資料作為細菌分類的依據(jù)，在細菌分類領域中又產(chǎn)生了“遺傳性分類法”，即分子生物學分類法。分子生物學分類法是建立在遺傳物質(zhì)的基礎上，主要通過兩條途徑獲得細菌遺傳學特征的資料：一是對細菌染色體進行直接的DNA分析或?qū)θ旧w外基因片段進行分析，因而從遺傳進化的角度去認識細菌；二是通過遺傳學方法如轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導或接合作用進行細胞之間的基因轉(zhuǎn)移，以探討細菌間的親緣關系。1.2.1DNAG+Cmol%含量測定方法生物體的遺傳物質(zhì)DNA中4種堿基G、C、A、T的比例和排列順序是決定DNA特性的關鍵因素，它代表著生物的遺傳信息，決定生物的種類，每種生物都有其特定的G+Cmol%含量，動植物的G+Cmol%集中在35%~40%,細菌的G+Cmol%變動幅度達25%~75%，因此，G+Cmol%含量測定更適合于細菌的分類鑒定。一般認為，兩株細菌的G+Cmol%差別<2%是無意義的，含量差別在2%~5%，可判定為同種內(nèi)不同菌株；差別在5%~15%,可判定兩株細菌同屬不同種；差別>15%，可判定兩株細菌不同屬甚至不同科。

細菌G+Cmol%含量測定法具有一定的局限性。G+Cmol%含量不同的兩個菌株，可肯定回答不是同種細菌，但G+Cmol%含量相同的細菌，不能武斷的認為是相同或相似的細菌，因為G+Cmol%含量雖相同，但其堿基排列順序（遺傳密碼）不一定相同，尚需結合表型鑒定確定或通過核酸雜交鑒定菌株間的親緣關系。1.2.2核酸序列分析法隨著PCR技術和DNA測序技術的快速發(fā)展，以及相應的成本降低，直接通過細菌DNA序列來進行分類的方法已經(jīng)成熟。盡管可以通過測定不同細菌任一相同基因區(qū)段的序列加以比較來劃分，但目前在細菌的系統(tǒng)分類學研究中最有用的和最常用的分子鐘是rRNA，其種類少，含量大約占細菌RNA含量的80%，分子大小適中，存在于所有的生物中，特別是進化具有良好的時鐘性質(zhì)，其結構與功能具有高度的保守性，素有“細菌化石”之稱。rRNA在大多數(shù)原核生物中都具有多個拷貝，5SrRNA、16SrRNA和23SrRNA的拷貝數(shù)相同，16SrRNA由于大小適中，約1.5kb左右，既能體驗不同菌屬之間的差異，又能利用測序技術來較容易地得到其序列，故被細菌學家及分類學家所接受。細菌的16SrRNA的可變區(qū)序列因不同細菌而異，恒定區(qū)序列基本保守，所以，可以利用恒定區(qū)序列設計引物將16SrRNA片段擴增出來，利用可變區(qū)序列的差異來對不同均屬、菌種的細菌進行分類鑒定。但較其他方法而言，16SrRNA序列測定分析更適用于確定屬及屬以上分類單位的親緣關系。2．真菌菌株鑒定

真菌的鑒定就是依據(jù)真菌的形態(tài)或分子特征對其分類地位做出評判的過程。然而，真菌的系統(tǒng)分類一直面臨著特殊的挑戰(zhàn)，因為它幾乎不存在化石、形態(tài)簡單，許多種類都被簡單地從形態(tài)上進行劃分，盡管也許與它們真正的系統(tǒng)進化關系不一致。因此，真菌的分類顯得復雜和繁亂。像其他生物的分類系統(tǒng)一樣，真菌的分類也是從形態(tài)特征分類基礎上發(fā)展起來的，表型研究是重要的分類途徑。目前主要是使用合適的培養(yǎng)基培養(yǎng)真菌，觀察、鑒別其特征：主要包括產(chǎn)孢結構的形態(tài)、大小、著生方式及孢子的形態(tài)大小以及其培養(yǎng)性狀等。隨著科學技術的不斷發(fā)展和真菌分類學自身發(fā)展的客觀要求，在真菌的現(xiàn)在分類學中引入了操作方便、特異性好且準能卻可靠的分子生物學技術鑒定方法。尤其是對相關屬、復合種或亞種的鑒定分類時，利用真菌較保守的18SrDNA以及ITS序列進行系統(tǒng)發(fā)育積累分析和真菌的多樣性研究已經(jīng)成為有效而快速的手段。也有用真菌的18SrRNA基因同源性分析方法對真菌進行分類鑒定的。ITS（InternalTranscribedSpacer）在真核生物中，指rRNA基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，是rDNA上的一個非編碼區(qū)域，它包括ITS-1（位于18SrDNA和5.8SrDNA之間）5.8SrDNA和ITS-2（位于5.8SrDNA和28SrDNA之前）區(qū)，該區(qū)域受外界環(huán)境的影響較小，與編碼區(qū)相比具有進化速度快的特點。真菌的ITS具有屬內(nèi)種間差異明顯，而種內(nèi)較為一致的規(guī)律性，而且基于rDNA-ITS的序列分析由于可以從太長的核酸序列中獲得相對足夠的信息來反映生物親緣關系與分類情況，因而成為真菌分類及鑒定研究的特點，目前，已廣泛應用于真菌的屬種間及部分種內(nèi)組群水平的系統(tǒng)學研究。二、多樣性分析1.培養(yǎng)（Culture-dependent）方法

從混雜微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過程稱為微生物分離與純化。平板分離法普遍用于微生物的分離與純化，其基本原理是選擇適合待分離微生物的生長條件，如選擇合適的營養(yǎng)成分、酸堿度、溫度和氧等造成只利于該微生物生長而抑制其他微生物生長的環(huán)境，從而淘汰一些不需要的微生物，并且微生物在固體培養(yǎng)基上生長形成的單個菌落，通常是由一個細胞繁殖而成的集合體，因此，可通過挑取但菌落而獲得一種純培養(yǎng)。其基本流程是：倒平板就→制備梯度稀釋液→涂布（或劃線法）→培養(yǎng)→挑單菌落→保存→根據(jù)菌株的生理生化、生態(tài)和遺傳特征等對其進行鑒定。但是由于環(huán)境中微生物群落結構非常復雜，物種多樣性極高，純種分離富集培養(yǎng)的方法不但費時費力，而且存在致命的方法學上的缺陷：①自然界大量微生物的不可培養(yǎng)性，使人類無法培養(yǎng)自然界中所有的微生物；②分離富集培養(yǎng)方法具有強烈的選擇性，使培養(yǎng)得到的微生物在種類數(shù)量和功能上都無法反映自然狀態(tài)下微生物群落的真實情況。2.非培養(yǎng)（Culture-independent）方法至今所鑒定的植物內(nèi)生菌大多數(shù)是依靠傳統(tǒng)的可培養(yǎng)方法分離的，由于對許多微生物的生長條件尚未知曉，受培養(yǎng)基選擇限制，可培養(yǎng)的菌株只是其中一小部分，而有相當一部分菌株處于存活但不可培養(yǎng)的狀態(tài)。近幾年，以16SrDNA基因作為系統(tǒng)發(fā)育標記，利用非培養(yǎng)方法檢測微生物種群的技術，克服了傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的欠缺，為檢測微生物種群多樣性提供了更為有效的手段。經(jīng)過多年的研究，目前，已發(fā)展起來應用于土壤、海洋、植物內(nèi)生菌研究的非培養(yǎng)方法包括以生物化學為基礎的非培養(yǎng)方法，如磷脂脂肪酸（phospholipidfattyacid,PLFA）圖譜分析方法、脂肪酸甲酯（fattyacidmethylesters，F(xiàn)AME）圖譜分析方法等；基于生理學的方法-Biolog微量分析；基于雜交技術的方法-熒光原位雜交（FISH）；但運用最多的是基于PCR反應，在此基礎上進行各種分析。主要的分析技術有變性梯度凝膠電泳（DenaturingGradientGelElectrophoresis,DGGE）、擴增rDNA限制性分析（AmplifiedRibosomalDNARestricitionAnalysis，ARDRA）、溫度梯度凝膠電泳（TemperatureGragmentGelElectrophoresis，TGGE）、末端限制性片段長度多態(tài)性（TerminalRestrictionFragmentLengthPolymorphism，T-RFLP）、單鏈構象多態(tài)性分析（SingleStrandConformationPolymorphism，SSCP）、限制性片段長度多樣性（RestrictFragmentLengthPolymorphism，RFLP）等。目前，這些方法與技術，結合蛋白質(zhì)組學、基因組學的方法與技術，如功能基因分析、酶活性測定等，不僅可以開展自然環(huán)境未培養(yǎng)微生物群落的多樣性及其群落結構的研究，而且能夠揭示自然生態(tài)系統(tǒng)的結構、功能及其相互關系，即可以直接通過基因組序列及其基因產(chǎn)物，分析或預測未培養(yǎng)微生物的系統(tǒng)發(fā)育關系、生理生化反應及其代謝途徑等，而無須首先獲得純培養(yǎng)。2.1生物化學方法的代表-磷脂酸法（PLFA）PLFA存在于細胞膜中，由于不同的微生物具有不同的PLFA種類和數(shù)量，因此，可以作為了解自然環(huán)境中微生物種類組成和數(shù)量變化的指標。但PLFA模式并不能給出一個實際的微生物種類組成，僅有群落結構的概圖。在有的情況下，某種PLFA的濃度改變與某些特異的微生物類群的改變密切相關。PLFA的分析結果又時要結合生態(tài)因子進行綜合評價，才能獲得準確的信息。此方法主要應用于微生物群落動態(tài)變化的定量分析，雖然能夠快速有效地從環(huán)境樣品中提取大部分脂肪酸，但只能鑒別到屬的水平，且受人為因素干擾強烈。2.2生理學方法的代表-Biolog微量分析Biolog微量板分析系統(tǒng)是由Biolog公司開發(fā)，用來測定微生物為95種碳源的利用情況并據(jù)此來對話能異樣細菌進行鑒定的系統(tǒng)。Biolog依據(jù)的原理很簡單，在分析板上有96個孔，其中，有一個孔不含有任何碳源作為對照，其余95個孔每孔含有以種碳源和氧化還原染料四氮哇藍。底物利用產(chǎn)生的氧化還原電勢的變化可導致染料的顏色發(fā)生變化，變化的速率和程度代表了底物被利用的速率和程度。微生物群落結構不同，95個孔的顏色變化方式就不同，這樣可以知道不同樣點位生物區(qū)系的差異。如Garland等[13]首先報道了這種碳源利用信息可把一種不同種類的土壤和水體微生物區(qū)系區(qū)別開。Zak等[14]把這種系統(tǒng)作為一種定量方法，用來評價與6種植物區(qū)系相關的微生物的功能多樣性。但是，由于不同微生物對同一碳源的利用能力是有差異的，所以微生物對不同單一碳源的代謝指紋差異并不能簡單地歸納為微生物群落數(shù)量和結構的差異；而且土壤微生物在Biolog系統(tǒng)中生長時，由于溫育環(huán)境的改變引起微生物對碳底物實際利用能力的改變，使得Biolog方法在準確性方面受到一定限制。但Biolog方法因快速、簡便而受到人們的歡迎。2.3基于雜交技術的方法-熒光原位雜交（FISH）熒光原位雜交技術是一種利用非放射性的熒光信號對原位雜交樣本進行檢測的技術，其原理是dsDNA變性后和帶有互補序列的同源單鏈退火配對形成雙鏈結構的過程。退火復性形成的可以是DNA/DNA或DNA/RNA異質(zhì)雙鏈扽子，帶有熒光標記的探針與固定在玻片或纖維膜上的組織或細胞中特定的核苷酸序列進行雜交，探測其中所有的同源核酸序列，結果可直接在共聚焦激光掃描顯微鏡或熒光顯微鏡下進行，無須單獨分離DNA或RNA，從而對染色體或基因異常的細胞、組織樣品進行檢測和診斷，為各種基因相關疾病的分型、預前和預后提供準確的依據(jù)，熒光原位雜交技術近幾年也已經(jīng)成為微生物生態(tài)學研究的熱點。由于其靈敏、快速、使用安全、特異性好等特點，被用于分析復雜環(huán)境的微生物群落結構，是一種監(jiān)測和定量分析復雜的環(huán)境樣品中微生物群落動態(tài)的有效方法，也為人工創(chuàng)建生物處理系統(tǒng)的最佳條件提供了理論依據(jù)。在微生物多樣性的研究中大多以熒光染料標記的16SrDNA和16SrRNA掛核苷酸序列作為探針，按照2個核酸的堿基序列互補原則，將標記的探針直接原位雜交到染色體或DNA纖維切片上，由于與熒光素分子偶聯(lián)的單克隆抗體和探針分子特異性結合，能激發(fā)雜交探針的熒光信號，通過熒光檢測系統(tǒng)和圖形分析技術對染色體或DNA纖維上的DNA序列進行定位、定性和相對定量分析，就能實現(xiàn)原位樣品中的目標細菌的探測。此技術包括如下步驟：樣品定位、樣品的制備與預處理、預雜交、探針和樣品的變性、雜交、漂洗和檢測信號等。2.4基于PCR的研究方法2.4.1變性梯度凝膠電泳（DGGE）變性梯度凝膠電泳（DGGE）的原理是使用一對特異性引物PCR擴增微生物自然群體的16SrRNA基因，產(chǎn)生長度相同但序列有異的DNA片段的混合物，然后用DGGE分離產(chǎn)物混合物。DGGE膠是在6%聚丙烯酰胺膠中添加線性梯度的變性劑，在一定溫度及同一濃度變性劑的條件下，序列不同的產(chǎn)物，其解鏈程度也不同，而產(chǎn)物解鏈程度又直接影響其電泳遷移率，結果不同的產(chǎn)物在凝膠上分離開來。在引物的5’端加上40個堿基左右的G-C串可使DGGE對序列差異的分辨率提高近1倍，所以，DGGE方法可用于微生物群落結構的研究、微生物種群動態(tài)的分析、富集培養(yǎng)物及分離物的分析、核糖體RNA同源性的分析等。但是PCR擴增過程中可能存在堿基插入的錯誤、不同微生物細胞破壁難易的不同等而造成的分析結果的偏差。PCR-DGGE的操作過程：①核酸DNA的提取；②PCR擴增：根據(jù)所選16SrDNA變異區(qū)兩邊的保守區(qū)設計特異性的引物（其中一條引物的5’端加40bp左右的GC夾子），設計程序時最后可以使用降落PCR從而進一步減少非特異性擴增；③DGGE；④Electrobloting；⑤雜交分析或者在完成DGGE后可以對分離的膠進行回收，然后，再進行二次PCR（用不加GC夾子的引物），將產(chǎn)物回收與T載體連接，轉(zhuǎn)化到DH5a，然后，進行酶切驗證并將陽性克隆送到相關公司完成測序。PCR-DGGE的優(yōu)點：①不需要培養(yǎng)：直接從所研究的樣品中提取總DNA，然后對16SrRNA的可變區(qū)進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物通過變性梯度凝膠電泳（DGGE）進行分析，能檢測到難以培養(yǎng)或不能培養(yǎng)的微生物，由此發(fā)現(xiàn)一些原來沒有檢測到的新的微生物種類；②檢測極限低大約為1%~3%，如果結合使用rRNA雜交技術，還可使檢測極限降至0.1%左右；③檢測速度快、經(jīng)濟；④結果準確可靠：傳統(tǒng)的生化鑒定方法雖然也能對細菌進行鑒定，但會出現(xiàn)假陽性或假陰性結果，主觀性比較強，而且會漏掉一些不能培養(yǎng)的微生物；⑤同時檢測多種微生物：DGGE凝膠上至少可以區(qū)分10個清晰可辨的條帶，而每個條帶可能來自不同的微生物；⑥與其他方法結合：DGGE可以和許多方法結合，從而全面認識微生態(tài)的組成、優(yōu)勢菌群等。2.4.2溫度梯度凝膠電泳（TGGE）溫度梯度凝膠電泳（TGGE）的原理與變性梯度凝膠電泳（DGGE）類似，除了利用核酸分子的大小和帶電荷數(shù)的多少以外，還利用了核酸分子的分子構象。穩(wěn)定的構象由氫鍵和范德華力共同維系，并受環(huán)境溫度、鹽離子濃度、pH值等因素影響，如果環(huán)境溫度升高到某一限定點就可以破壞氫鍵和范德華力，這時分子即處于變性狀態(tài)，此過程就稱為熱變性，TGGE就是利用不同構象的分子具有不同的變性溫度（Tm）來進行分離的。在正常情況下，經(jīng)過PCR的16SrDNA分子呈雙鏈結構狀態(tài)；當溫度升高到一定值時，16SrDNA雙鏈開始解開，由完整的雙鏈變成分叉雙鏈；如果溫度繼續(xù)升高，rDNA雙鏈完全解開，變?yōu)閱捂渞DNA。這種分子構象的改變會影響分子在電泳時的遷移行為，因為rDNA雙鏈的打開直接導致遷移率下降。這種影響在兩條鏈即將完全解開時最大，此時分子的電泳速度最慢；而當全部形成單鏈時，泳動速度又會變快。利用這一特點，TGGE就可以在聚丙烯酰胺凝膠上得到所分析樣品的遺傳指紋圖譜。

2.4.3限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）分析限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）是一種DNA分子水平上的多態(tài)性檢測技術，它是限制性內(nèi)切酶、核酸電泳、印跡技術、探針-雜交技術的綜合應用。該技術已廣泛用于微生物群落的研究。PCR-RFLP可以檢測出堿基發(fā)生突變、插入、缺失的位點。限制性內(nèi)切酶能識別并切割特異性核苷酸序列。由于不同來源的DNA具有不同的限制性內(nèi)切酶酶切位點的分布，每一種DNA限制性酶組合所產(chǎn)生的片段是特異的，從而產(chǎn)生多態(tài)性，所以它能作為某一DNA的特有指紋。切割產(chǎn)生的不同片段通過特定探針雜交進行檢測，從而可比較出不同品種的DNA水平的差異（即多樣性）。多個探針的比較可以確立生物的進化和分類關系，該方法檢測結果不受環(huán)境因素的影響。但是該技術所用限制酶的選擇通常憑經(jīng)驗，正常情況下必須使用多種酶。因為一種酶可能在兩種DNA片段的同一位置進行切割。為了克服RFLP技術上的缺陷，將PCR技術和熒光標記技術結合，發(fā)展出了核糖體DNA擴增片段限制性內(nèi)切酶分析（ARDRA）技術及末端限制酶切片段長度多態(tài)性分析（T-RFLP）技術。目前，在環(huán)境微生物群落研究中，PCR-RFLP主要用于微生物的16SrDNA，根據(jù)16SrDNA序列的限制性片段長度多態(tài)性，以此確定群落的微生物多樣性和種群的遺傳多樣性。2.4.4單鏈構象多態(tài)性（SSCP）分析單鏈構想多態(tài)性（SSCP）是利用保守區(qū)的序列作為引物，以PCR進行擴增，將擴增的DNA片段變性，使其解鏈成為單鏈DNA，在一定條件下通過聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離，DNA上微小的堿基差異即可形成不同的DNA構象，在凝膠上的遷移率亦不同，反映出單鏈DNA片段的多態(tài)性。其基本過程是：①PCR擴增靶DNA；②將特異的PCR擴增產(chǎn)物變性，而后快速復性，使之成為具有一定空間結構的單鏈DNA分子；③將適量的單鏈DNA進行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳；④最后通過放射性自顯影、銀染或溴化乙錠顯色分析結果。近年來該方法除了大量地用于檢測和腫瘤發(fā)生有關的基因突變外還應用于微生物生態(tài)研究，在微生物菌群多樣性的研究中，SSCP是與16SrDNA技術結合，對16SrRNA基因擴增產(chǎn)物進行分析的另一種簡便有效的方法。SSCP特點：設備簡單，無需專門的電泳設備；無需帶有GC夾子和熒光標記物；后續(xù)研究易進行，當研究特異類群的動態(tài)變化時，可采用該類群的特異探針與SSCP圖譜進行雜交，進而顯示該類群的演替及在群落中的位置。但是SSCP技術重現(xiàn)性較差，易受膠濃度和電泳溫度等條件的影響，另外，SSCP能夠有效分離的DNA序列過段短（150~400bp）。第四節(jié)拮抗微生物在生物農(nóng)藥創(chuàng)制中的應用

微生物容易人工控制培養(yǎng)條件，繁殖周期短，繁殖系數(shù)大，有效產(chǎn)量高，特別是可以通過育種手段改造菌種，使之便于組織工業(yè)化生產(chǎn)。拮抗菌的研究開辟了微生物應用研究的新領域，目前工作的重點是篩選能產(chǎn)生高活性抑菌次生代謝產(chǎn)物的菌株，經(jīng)育種改造菌株或改進工藝，利用其生產(chǎn)藥物。1.

首先，篩選產(chǎn)抗菌活性物質(zhì)拮抗菌株應遵循一定的策略，避免篩選的盲目性。我們應考慮篩選材料的有關背景。如利用植物內(nèi)生菌篩選活性菌株，要注意植物的生長環(huán)境、植物的特殊分布、植物種的年代、抗病抗蟲性以及藥用背景等。植物的生長環(huán)境直接影響內(nèi)生菌的生物多樣性，而植物種植的年代也直接影響其生物多樣性、抗病蟲性，年代越久遠，其內(nèi)生菌的生物多樣性越豐富；抗病和抗蟲性越強的植物，其所含的內(nèi)生菌具有抗菌和殺蟲活性的可能性就越大；具有藥用性能的植物，其所含的內(nèi)生菌有可能產(chǎn)生植物相同或相似的活性物質(zhì)。2.其次，應選擇適宜的培養(yǎng)基及摸索合理的培養(yǎng)條件。有合適的培養(yǎng)基，就能培養(yǎng)出分離到的菌株，從而篩選到目標菌株。3.最后，發(fā)酵液中活性物質(zhì)的提取分離手段。值得一提的是，目前采用的通常是經(jīng)典的生物化學提取分離方法與現(xiàn)代技術相結合，既運用了傳統(tǒng)的溶劑提取、柱層析分離的方法，又運用了正反相分離、高效液相色譜（HPLC）制備、高速逆流色譜（HSCCC）、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）等現(xiàn)代技術手段分離純化次生代謝產(chǎn)物，利用光譜分析手段，包括紫外光（UV）、紅外線（IR）、核磁共振（NMR）、質(zhì)譜（MS）、X射線（X-Ray）對化合物進行結構鑒定。

我國幅員遼闊，具有豐富的微生物資源。如藥用植物資源的利用在我國具有悠久的歷史，有記載的藥用植物就有5000多種，包括許多具有抗菌和殺蟲活性的植物。因此，利用我國的微生物資源篩選抗菌和殺蟲活性物質(zhì)，對促進新型生物農(nóng)藥的開發(fā)和創(chuàng)制具有十分重要的意義。此外，從微生物中尋找發(fā)現(xiàn)新型先導化合物，也是新農(nóng)藥研制的重要途徑。第五節(jié)抑菌土

抑病性土壤是健康的土壤。土壤健康是指在生態(tài)系統(tǒng)界限內(nèi)維持生物生產(chǎn)力、環(huán)境質(zhì)量和促進植物、動物健康的土壤功能的運行能力。多年來，人們已經(jīng)對一些重大的植物病害的土壤抑病性進行了研究，并且揭示了土壤抑病性的形成機制是不同的，主要分為普遍抑病性和特殊抑病性兩種機制。普遍抑病性是指土壤中微生物群體對某種病原菌具有很強的拮抗性，而特殊抑病性則是指土壤中某類微生物對某種病原菌生活史的特定階段具有拮抗作用。一、概念

1.土壤抑菌作用（fungistasis）：指土壤中或同土壤相接觸的微生物繁殖體的萌發(fā)受到抑制的現(xiàn)象。抑菌作用對細菌、放線菌、真菌都存在，但以真菌最為敏感。Dobbs和Hinson在1953年最早提出了土壤抑菌作用概念。土壤抑菌作用可以使真菌孢子在土壤中保持休眠狀態(tài)而存活更長時間。說明土壤抑菌作用可能是土傳病害生防菌劑防效不穩(wěn)定的重要原因之一。2.抑病土（Suppressivesoils）：包括所有不利于病害發(fā)展的土壤。狹義來講，它們是指那種病害發(fā)生程度自然降低的土壤。與那些由單一種植某種作物品種而引起的病害降低有明顯的區(qū)別。在抑病土中，即使有病原和感病寄主存在，病原接種體密度大，病害的嚴重程度也會受到限制，病害也不發(fā)展。對于土傳病害生防菌，要求它能夠在土壤和植物根部定殖及擴增，這就需要克服和解除土壤對生防菌的抑菌作用。土壤由感病狀態(tài)轉(zhuǎn)化為抑病狀態(tài)。抑病土中即使長期不種植作物，其抑制作用仍是存在的。3.導病土（Conducivesoils）指利于病害發(fā)展的土壤，也稱為利病土。在導病土中，在病原接種體密度相對低的情況下，病害也能嚴重發(fā)生。土壤平板法直接測定土樣對生防菌孢子的抑菌作用，不同土樣普遍存在土壤抑菌作用，且土樣間和菌株抑菌作用有差異。只有當感病作物和病原物同時存在時抑病土才能被鑒定。二、研究史-1892年Atkins首次開展了棉花枯萎病(Fusariumoxysporumf.sp.Vasinfectum)抑病土的研究。–1933年walker發(fā)現(xiàn)了豌豆萎蔫病的抑病土。–1934年Fellow和Glynw分別在美國和英國發(fā)現(xiàn)小麥全蝕病的抑病土。

–1968年Gerlagh在荷蘭驗證了小麥金蝕病抑病土存在，同時說明了小麥連作可使部分病田土壤轉(zhuǎn)變?yōu)橐植⊥痢?/p>

–20世紀70年代以來研究報道不斷增加，1974年baker和cook進一步證實麥田土壤對小麥全蝕病菌產(chǎn)生抑制性，病害隨著連作逐漸衰退。–1982年Huber報道15種土傳病原引起的30余種病害被抑制的情況，包括抑病土的類型及與抑病有關的因素。

三、特性1.抑病土具有一定的抑菌范圍抑病土對不同病原微生物的抑制性不同，每一種抑病土都有其自身的抑菌范圍。例如，在美國夏威夷島，華麗腐霉Pythiumsplendens的抑病土可抑制P.splendens，瓜果腐霉P.aphanidermatum）但不能抑制橡膠樹疫霉Phytopgthorapalmivora，辣椒疫霉P.capsici。2.pH值對抑病土的影響調(diào)節(jié)土壤的pH值可使一些抑病土喪失其抑病。在臺灣，P.capsici抑病土的pH值由4調(diào)整到5或6時，則失去抑病性；反之，導病土的pH值由5調(diào)整到4，并不會抑制P.capsici孢子囊發(fā)芽。3.土壤營養(yǎng)物質(zhì)對抑病土的影響十字花科蔬菜根瘤菌抑病土的抑病性與土壤含鈣量密切相關。Ca(OH)2、Ca(NO3)2·4H2O、CaCO3、CaSO4、K2HPO4則具有抑制鐮刀菌厚垣孢子發(fā)芽和促進芽管壞死的顯著作用。在土壤中加水苔、青萍和龍眼種子粉可使西瓜蔓割病菌（Fusariumoxysporumf.sp.niveum）厚垣孢子的芽管大量壞死。棉花枯萎病菌抑菌性土壤施入不同形式的有機肥后，抑菌性發(fā)生了變化。–施入馬糞后，抑菌性被削弱，枯萎病菌增殖加快，棉花枯萎病發(fā)病率與導菌土相當。

–施入棉子餅及豆餅之后則抑菌性增強，抑菌效果增加，尖胞鐮刀菌萎蔫?；偷脑鲋呈艿揭种?，而非致病性鐮刀菌及產(chǎn)熒光假單胞菌含量增加。水苔是一種天然的苔蘚，又名泥炭蘚(HerbaSphagni)，為泥炭蘚科植物。苔蘚植物是一種小形的綠色植物，結構簡單，僅包含莖和葉兩部分，有時只有扁平的葉狀體，沒有真正的根和維管束。中國大部地區(qū)山地均有分布。苔蘚植物喜歡陰暗潮濕的環(huán)境，一般生長在裸露的石壁上，或潮濕的森林和沼澤地。廣泛用于各種蘭花的栽培，是種植栽培基質(zhì)上等材料之一。青萍，水生植物。浮萍的別稱。用途全草入藥，發(fā)汗，利尿，消腫?？勺黠暳?。4.抑病性的可傳遞性微生物因子引致的抑病性具有可傳遞。P.splendens的利病土中分別加入10％、25％、50％、75％的抑病土，病菌孢子萌發(fā)率隨著加入抑病土量增加而減少。說明抑病性是可以傳遞的。將一部分抑病土和經(jīng)高溫處理的利病土混合后，就可以獲得抑病作用。連續(xù)稀釋后，即使只加入1mg/kg的抑病土，抑制作用也是有效的。將泥炭土中加入10%的抑病土，獲得的抑病作用就與原來的抑病土相似，當抑病土的體積占總體積的2%，甚至是1%時，抑制作用仍是有效的。在溫室條件下種植番茄只加入8%的抑病土，對鐮刀菌枯萎病的有效控制就可達3年之久。四、作用機理（一）土壤非生物因素的作用1.特定的土壤類型和特定的病害之間存在明顯的聯(lián)系。

棉花鐮刀菌萎蔫病的的嚴重度隨土壤類型不同而不同。豌豆鐮刀菌萎蔫病的傳播，沙土比結構好的土壤傳播的快。香蕉枯萎病的抑病土與粘土有關。沙土利于鐮刀菌枯萎病的侵