微生物在藥學中的應用

第三篇微生物在藥學中的應用微生物與藥學的關系密切:1、許多抗生素是微生物的代謝產物,2、選用微生物來制造醫(yī)藥衛(wèi)生方面廣泛應用的藥物,如維生素,輔酶；3、藥品衛(wèi)生質量的控制需要進行微生物學檢驗；4、藥品和生物制劑應用生物工程技術生產時，采用工程菌進行，如：胰島素、干擾素和生長因子等。

隨著微生物學基礎理論和實驗技術的發(fā)展，微生物在藥學領域應用越來越廣。在醫(yī)藥生產中已廣泛利用微生物發(fā)酵來制備各種藥物，形成一門獨立的微生物藥物學科。

發(fā)酵（fermentation）：原來是指在厭氧條件下酵母菌分解碳水化合物釋放能量以及得到產物的過程，但目前工業(yè)上把發(fā)酵擴展為利用培養(yǎng)微生物來制得產物的任何過程，其中也包括利用微生物的某些酶來轉化某些物質使之成為所需物質的過程.。發(fā)酵（fermentation）：原來是指在厭氧條件下酵母菌分解碳水化合物釋放能量以及得到產物的過程，目前工業(yè)上把發(fā)酵擴展為利用培養(yǎng)微生物來制得產物的任何過程，其中也包括利用微生物的某些酶來轉化某些物質使之成為所需物質的過程.。發(fā)酵的分類：根據發(fā)酵時所需條件1、是否需要氧氣厭氧發(fā)酵與需氧發(fā)酵2、培養(yǎng)基的物理性狀固體發(fā)酵與液體發(fā)酵3、工藝淺層發(fā)酵與深層發(fā)酵

現(xiàn)代生物技術的發(fā)展，使發(fā)酵工業(yè)的范疇突破了利用天然微生物的傳統(tǒng)發(fā)酵，逐步建立起新型的發(fā)酵，可生產天然微生物所不能產生或產生很少的特殊產物。本篇主要內容：1、介紹微生物發(fā)酵制品包括抗生素、維生素、氨基酸、酶和酶抑制劑。2、微生物與藥物變質的關系以及保證藥物制劑質量所必需的各種微生物學檢驗法。如:抗生素效價的微生物學檢定;藥物抗菌活性的測定;第十七章抗生素共生現(xiàn)象：互相依存，作為整體如：根瘤菌與豆科植物拮抗：生活在一起，一種生物產生物質抑制或殺滅另一種生物。抗生素就是拮抗現(xiàn)象的體現(xiàn)。Fleming于1929年首先發(fā)現(xiàn)從青霉菌中產生的青霉素（penicillin），Waksman于1944年發(fā)現(xiàn)從鏈霉菌中產生的鏈霉素（streotomycin）?？股氐默F(xiàn)狀目前從自然界發(fā)現(xiàn)和分離的抗生素已達10，000多種，實際應用于生產和醫(yī)療上的抗生素約有一百多種，連同各種半合成衍生物及其鹽類共約三百種。國外現(xiàn)有的主要抗生素在我國已有生產，其中的慶大霉素用我國自行分離的菌種生產。國外沒有的抗生素如創(chuàng)新霉素國外雖有，但我國發(fā)現(xiàn)新的成分或新的用途如平陽霉素（或博來霉素）第一節(jié)

抗生素的概念和分類

一、抗生素的概念抗生素是指青霉素、鏈霉素等一類化合物的總稱，是人類控制、治療感染性疾病，保障身體健康及用來防治動植物災害的重要化合物。原始含義：是指那些由微生物產生的、能抑制其微生物生長的物質。習慣上：將那些由微生物產生的，極微量即具有選擇性地抑制其他微生物或腫瘤細胞的天然有機化合物稱為抗生素。確切的含義：

抗生素是生物（包括微生物、植物和動物）在其生命活動中產生的（或由其他方法獲得的），能在低濃度下有選擇地抑制或影響其他生物機能的有機物。

幾個注意點：確切含義是只有來自微生物的天然產物才能稱為抗生素，而現(xiàn)在把經化學改造的天然來源的抗生素或微生物代謝的其他產物均稱為半合成抗生素?？股兀菏且粋€低分子量（指一個分子有一定的化學結構，其相對質量最大可達數千）的微生物代謝產物，在低濃度（﹤1mg/ml）時能抑制其他微生物生長。醫(yī)療用抗生素需要以下要求：1、差異毒力大是指微生物或腫瘤細胞等靶體的抑制或殺滅作用，與其對機體損害程度的差異比較。抗生素的差異毒力愈大，則愈有利于臨床應用。如青霉素能抑制細菌細胞壁的合成，而人及哺乳類動物細胞不具備細胞壁，因而青霉素的差異毒力大。一般的化學消毒劑對微生物和機體的毒力無明顯差異。2、生物活性強大、有不同的抗菌譜是指在極微量的抗生素就對微生物具有抑制或殺滅作用?？咕饔玫膹娙跤米畹鸵志鷿舛龋∕IC）來表示，即能抑制微生物生長所需的最低濃度（以μg/ml為單位），數值越小，則作用越強。抗菌譜：是指抗生素所能抑制或殺滅微生物的范圍和所需劑量。范圍廣者稱為廣譜抗生素，范圍窄稱為窄譜抗生素。良好的抗生素還應具有不易使病原菌產生抗藥性，毒副作用小，不易引起超敏反應，吸收快，血藥濃度高，不易被血清蛋白結合而失活。

二、抗生素的分類

目前尚無完善的系統(tǒng)分類方法

1、根據抗生素的產生來源（1）細菌產生的抗生素如多粘菌素和短桿菌肽（2）放線菌產生的抗生素主要來自鏈霉菌屬如:鏈霉素、卡那霉素、四環(huán)素（3）真菌產生的抗生素如青霉菌屬產生的青霉素，頭孢菌屬產生的頭孢菌素（4）植物和動物產生的抗生素如:地衣和藻類植物產生的地衣酸被子植物蒜中制得的蒜素動物臟器中制得的魚素2、根據抗生素的化學結構分類（1）β-內酰胺類抗生素

如：青霉素、頭孢菌素[特點]分子中有一個含四個原子的酰胺環(huán)，化學上稱為β-內酰胺環(huán)。[來源]它們起初是從真菌產黃青霉菌和頭孢菌屬中發(fā)現(xiàn)，后來從放線菌的鏈霉菌屬和諾卡菌屬及其某些革蘭陰性菌中也發(fā)現(xiàn)。從生物合成角度看，被認為是從氨基酸聚合而衍生的。

[機制]抑制細菌細胞壁基本成分肽聚糖的合成，導致不可逆轉的破壞，具有殺菌作用。早期的青霉素只對革蘭陽性和陰性菌有效。對真菌無用（細胞壁不含肽聚糖），對支原體無效（無細胞壁）[使用注意問題]

除個別外，此類抗生素的毒性非常低。有時出現(xiàn)極為嚴重的超敏反應。（2）四環(huán)類抗生素如金霉素、土霉素和四環(huán)素

[特點]

具有很廣的抗菌譜及較好的治療果[來源]不同種的鏈霉菌均能產生四環(huán)素類抗生素[結構特點]由乙酸和丙二酸單位縮合的鍵環(huán)化而形成；由四個環(huán)線形相連而組成。[作用特點]抑制核糖體蛋白的合成，其作用是可逆的，因此具有抑制作用?？咕V廣即革蘭陽性與陰性菌、立克次體、衣原體和某些原蟲。由于其理化性質（在中性PH條件下不溶水）所決定，天然產生的只能口服，化學半合成獲得了一些可用于注射的衍生物及作用周期較長的。（3）氨基糖苷類抗生素（氨基環(huán)醇類）[來源]包括很廣的由鏈霉菌、小單孢菌和芽孢桿菌產生的物質。[化學特征]具有環(huán)狀氨基醇和與之相連的氨基糖。葡萄糖是氨基醇和氨基糖的來源。[作用機制]以不可逆的方式作用于核糖體而抑制蛋白質的合成，具有殺菌作用，主要作用革蘭陽性菌。[代表藥物]鏈霉素（第一個發(fā)現(xiàn)，也是第一個對抗生素有效的抗生素）、卡那霉素、慶大霉素、妥布拉霉素和丁安卡那霉素。[特點]由于分子內含許多羥基，此類抗生素水溶性非常好，因而不能口服，主要的副作用為腎和耳毒性。（4）大環(huán)內酯類抗生素[化學結構特點]具有一個由不少于12個碳原子，并由內脂基團使其環(huán)化。他們是鏈霉菌的典型產物，其生物合成是由一系列乙酸和丙酸單位縮合而成。[分類與作用特點]分兩類

a、抗細菌大環(huán)內酯類抗生素

由14-16個碳原子構成的內酯環(huán)，至少有兩個糖分子；具有抑菌作用；抗菌譜局限于革蘭陽性菌和支原體；典型代表是紅霉素、竹桃霉素；為改善口服吸收率，還半合成了一些新的衍生物。

b、抗真菌和抗原蟲大環(huán)內酯類抗生素

[特征]由約30個原子組成內酯類，帶有羥基取代基團包含一系列共軛的雙鍵，也稱為多烯類化合物，只有靜脈注射才有活性。[機制]通過干擾細胞膜甾醇類合成誘導細胞膜畸變，因此對細菌無作用。毒副作用較大，因而只能有限的用于最需要的病例。[代表藥物]兩性霉素B(5)肽類抗生素

由氨基酸組成，經常形成環(huán)狀結構；主要對革蘭陽性菌。短肽菌肽主要干擾細菌細胞膜功能；桿菌肽主要抑制細胞壁肽聚糖的合成。[代表藥物]多黏菌素---對革蘭陰性菌有效，作用于細胞膜；肽托霉素和雷膜拉寧—對細胞壁合成抑制作用。

（6）安莎霉素類60年代末期投入臨床使用，其典型結構是具有一條脂肪鏈，連接兩個相對的芳香環(huán)，像是一條鏈子上的兩個籃子。它們由放線菌屬的多種類群所構成，由一系列乙酸和丙酸單位縮合而成。如利福霉素（對革蘭陽性菌及分枝桿菌有極強的作用）、利福平（對分枝桿菌及葡萄球菌效果尤佳）。（7）糖肽類抗生素（二丙庚肽類）

代表藥物為萬古霉素和替考拉寧。主要對革蘭陽性細菌有效，尤其是對耐β-內酰胺類抗生素的葡萄球菌有效。

（8）抗腫瘤抗生素屬于不同化學類別，但都以不同機制作用于DNA復制。

放線菌素→由酚惡嗪酮環(huán)組成帶有二個相同的肽環(huán)，它們以其芳香環(huán)與DNA堿基嵌合，而影響DNA功能，在其真核細胞中主要干擾RNA合成。蒽環(huán)類化合物（柔紅霉素和阿霉素）→

具有四環(huán)結構帶有一個取代的糖基，作用于拓撲異構酶，使DNA斷裂。絲裂霉素C→具有三環(huán)結構，使二個DNA鏈中間形成共價鍵橋。博來霉素→由輪生鏈霉菌產生的9肽混合物，以類酶反應使DNA鏈斷裂。

（9）其他抗生素

氯霉素：抑制蛋白質合成，有抑菌作用，

對革蘭陰性細菌尤其沙門菌有很好的效果。

林可霉素：抑制蛋白質合成。

新生霉素：抑制DNA回旋酶的一個單位，

作用革蘭陽性菌和變形桿菌。

灰黃霉素：可以在體內應用的抗真菌抗生素，由真菌產生，具有芳香環(huán)結構，生物合成是由乙酸和丙二酸單位縮合而成，抑制細胞支架的形成。

第二節(jié)抗生素產生菌的分離和篩選目前新抗生素的獲得途徑：1、從自然界分離篩選新抗生素產生菌從土壤到海洋一般常見到極端微生物從微生物到植物、海洋生物。2、改造現(xiàn)有的已知抗生素的產生菌，再經篩選獲得新得抗生素產生菌。3、從已知的抗生素進行結構改造，經篩選獲得新的半合成抗生素。

4、采用新的篩選方法

如：應用定向生物合成和突變生物合成的原理，以及培養(yǎng)超敏細菌以尋找微量的抗生素，選用新的腫瘤模型來篩選抗腫瘤的抗生素。5、采用現(xiàn)代分子生物學技術產生新抗生素（1）基因克隆產生新抗生素：首先獲得某已知抗生素的結構基因，然后通過一定的載體將基因片段導入特定的另一種抗生素產生菌中，則可能產生完全符合人們設計要求的新抗生素。（2）沉默基因的激活：引入抗生素生物合成的調控基因，有可能激發(fā)抗生素產生菌處于休眠狀態(tài)或沉默狀態(tài)的基因系統(tǒng)，從而開啟另一結構抗生素的生物合成開關，得到新抗生素。

絕大多數抗生素的原始產生菌是從自然界分離篩選獲得，以傳統(tǒng)的分離土壤放線菌為例，說明新抗生素產生菌的常規(guī)分離和篩選過程。

一、土壤微生物的分離1、采土以春、秋兩季采土為宜。去除表土，采取5-10cm深處的土壤，裝入無菌容器。2、分離菌株將2-4克土壤均勻散布水中待其沉降，上清部分經適當稀釋后（一般為10-3-104），涂布于適宜培養(yǎng)基中，并培養(yǎng)至單菌落出現(xiàn)，挑取單個菌落移種純培養(yǎng)，根據菌落的特征，初步排除相同菌。二、篩選：是指從大量待篩選微生物中，盡快地鑒別出有實用價值的抗生素產生菌的實驗過程。

1、篩選模型：是指篩選工作中所使用的實驗菌。為了避免感染病原菌的危險，盡可能選用非致病的、且能代表某些類型致病菌的微生物作為實驗菌。

表17-1常用的實驗菌和代表的致病微生物實驗菌代表的致病微生物

金黃色葡萄球菌革蘭陽性球菌枯草芽孢桿菌革蘭陽性桿菌恥垢分支桿菌結核分枝桿菌大腸埃希菌革蘭陰性桿菌白假絲酵母菌酵母狀真菌曲霉絲狀真菌噬菌體病毒、腫瘤細胞2、篩選方法

抗菌抗生素一般采用瓊脂擴散法。

先制備含實驗菌的平板，然后以無菌濾紙片蘸取各放線菌的搖瓶培養(yǎng)發(fā)酵液或切取一定大小的放線菌瓊脂培養(yǎng)塊，置于含菌平板上，培養(yǎng)后觀察有無抑菌圈產生。

三、早期鑒別

經過篩選的陽性菌應進一步做抗菌譜和抗藥譜的測定，對有價值的產生菌必須從產生菌及自該菌產生的抗生素兩方面進行鑒定。

1、抗生素產生菌的鑒別

通過形態(tài)、培養(yǎng)、生化反應等實驗對抗生素產生菌進行初步的分類鑒定。2、抗生素的鑒別常用理化方法如：紙層析法測定抗生素的極性和在各種溶媒中的溶解度。紙電泳法判斷抗生素是酸性、堿性、中性或兩性。薄層層析法、高效液相層析法、紫外分光光度法等方法測定新抗生素的理化性質和結構。

四、分離精制

將可能產生新抗生素的放線菌進行擴大培養(yǎng)，然后選擇合適的方法從培養(yǎng)液中提取有效抗生素，進一步精制純化。在此過程中，須跟綜測定抗生素的生物活性。五、臨床前實驗研究

如：進行動物毒性實驗（急性、亞急性、慢性）動物治療保護性實驗臨床前藥效實驗和藥理實驗（抗生素在體內吸收、分布、排泄），經系列實驗認為確有前途的新抗生素經有關部門審查合格后方可進行臨床實驗。國家制定了《藥品臨床前研究質量管理規(guī)范》，（簡稱GLP）。六、臨床實驗

《藥品臨床實驗管理規(guī)范》簡稱GCP，是臨床實驗的全過程，包括方案設計、組織實施、監(jiān)視、審核、記錄、分析、總結和報告的標準。

第三節(jié)抗生素的制備

抗生素的制備分為發(fā)酵和提取兩個階段。

抗生素的發(fā)酵：是指抗生素產生菌在一定培養(yǎng)基條件下生物合成抗生素的過程，該過程又分為菌體生長和抗生素生物合成兩個部分。發(fā)酵后存在于發(fā)酵液中的抗生素需用一系列物理和化學方法進行提取和精制，得到抗生素成品。抗生素生產大致分為二個階段：發(fā)酵和提取一般流程如下：

菌種→孢子制備→種子制備→發(fā)酵→發(fā)酵液預處理及壓濾→提取及精制→成品檢驗→成品包裝一、發(fā)酵階段（一）現(xiàn)代抗生素發(fā)酵的一般特點

1、需氧發(fā)酵抗生素產生菌多為需氧菌，需要在發(fā)酵的過程中不斷通入無菌空氣，并進行機械攪拌，以提供足夠氧來進行生物代謝和生物合成。2、深層發(fā)酵（或為沉沒發(fā)酵），在大型發(fā)酵罐內進行，可進行較大規(guī)模的生產。3、純種發(fā)酵在純種培養(yǎng)的抗生素發(fā)酵工業(yè)中，應防止雜菌及噬菌體污染。(二）一般生產流程抗生素發(fā)酵階段一般主要包括：孢子制備、種子制備和發(fā)酵，這是進行微生物逐步擴大培養(yǎng)過程。1、孢子制備目的是將沙土管保存的菌種進行培養(yǎng)，以制備大量孢子供下一步種子制備之用，一般于試管、扁瓶或搖瓶內進行。2、種子制備目的是使有限數量的孢子發(fā)芽繁殖，獲得足夠菌絲體以供發(fā)酵之用。在種子罐內進行。通過種子制備，可以縮短發(fā)酵罐內菌絲體繁殖生長的時間，增加抗生素合成的時間。一般通過種子罐1-3次，再移種到發(fā)酵罐中，分別為二級、三級和四級發(fā)酵。

3、發(fā)酵關鍵階段目的是在人工培養(yǎng)條件下使菌絲體產生大量的抗生素。在發(fā)酵罐內進行。發(fā)酵注意事項：

1、無菌操作污染雜菌主要是種子和空氣過濾系統(tǒng)污染，各部件滲漏及操作。在發(fā)酵的各階段應取樣進行雜菌檢查。2、營養(yǎng)需要發(fā)酵培養(yǎng)基應供給微生物生產繁殖以及生物合成所需的營養(yǎng)，其原料應盡可能價廉，來源要廣。3、pH值：加入使培養(yǎng)基pH值恒定的化合物：硫酸銨、硝酸鈉。4、溫度酶的催化需要合適的溫度?？赏ㄟ^罐的夾套或蛇管導入冷水或熱水以控制罐溫。5、前體

前體→是抗生素分子的前身或其組成的一部分，直接參與抗生素的生物合成而自身無顯著變化。在一定條件下，加入前體可控制抗生素的合成方向，并增加產量。如：在青霉素G的生產中常加入苯乙酸或苯乙酰胺作為前體；在紅霉素生產中添加丙酸、丙醇鹽作為前體。但前體一般對產生菌有一定的毒性。

6、通氣、攪拌及消沫發(fā)酵過程中利用溶解氧，因此必須不斷經空氣過濾系統(tǒng)輸入無菌空氣，同時在發(fā)酵罐內設置攪拌和擋板以增加通氣效果。為防止泡沫造成的逃液和滲漏，需用消沫漿或消沫劑。7、發(fā)酵終點判斷定期取樣，測定抗生素含量、發(fā)酵液的pH值、含糖量和含氮量、菌絲含量及形態(tài)觀察。放罐應在產量的高峰期，過早或過遲都會影響抗生素含量。二、發(fā)酵液預處理及提取階段預處理時應盡可能使抗生素轉入以后要處理的相中（多數是液相），可用調節(jié)pH值呈酸性或堿性的方法。預處理的主要任務是除去發(fā)酵液內的雜質（Ca、Mg、Fe）及蛋白質，并經過過濾，使菌絲與濾液分開，便于進一步提取。常用的提取方法主要有四類：

1、溶媒萃取法是用一種溶劑將物質從另一種溶劑中提取出來的方法，這兩種溶劑不能互溶或只部分互溶，能形成便于分離的兩相。目前微生物制藥生產中常用的提取方法。先進的萃取設備：ABE-216萃取機2、離子交換法離子樹脂交換法是應用離子交換樹脂作為吸附劑，將發(fā)酵液中物質選擇性地吸附至離子交換樹脂上，然后用合適的洗脫劑將抗生素從樹脂上洗脫下來，達到分離、濃縮、提純的目的。由于費用較低，成為提取主要方法。如：鏈霉素和卡那霉素的生產。

3、沉淀法是利用等電點或能與酸、堿、金屬鹽類形成不溶性或溶解度極小的復鹽沉淀出抗生素。此法簡便、經濟。如：四環(huán)素4、吸附法是利用適當的吸附劑，在一定的PH條件下，使發(fā)酵液中抗生素被吸附劑吸附，然后再以適當的洗脫劑將吸附的抗生素從吸附劑上洗脫下來，達到濃縮和提純目的。隨著大網格聚合物吸附劑的合成成功，吸附法得到新的發(fā)展。抗生素提取得到粗品后應加以精制，上述方法均可使用。

一般用多級溶劑萃取或多級吸附、洗脫或薄層層析、柱層法、葡聚糖凝膠過濾等。因一般抗生素的穩(wěn)定性差，應避免常壓蒸餾、升華、過酸或過堿等方法。

第四節(jié)抗生素的生物合成機制

一、次級代謝產物的概念次級代謝產物：是指那些由微生物合成的，但對微生物的生長、繁殖無明顯影響的各種代謝產物，如抗生素。特點：1、對微生物的生長、繁殖無明顯影響。初級代謝產物往往是微生物生長所不可缺少的物質。2、與初級代謝緊密相連先有微生物生長，后有抗生素的合成。3、在一定條件下能大量合成。二、抗生素生物合成的代謝途徑

1、抗生素生物合成的大致步驟屬于次級代謝物營養(yǎng)物攝入細胞→轉化為初級代謝各中間產物→合成小分子的抗生素前體物質→前體物質經修飾、碳架重排等→進入各抗生素所特有的合成途徑→聚合或裝配，合成抗生素。2、抗生素合成的有關代謝途徑①脂肪酸代謝②氨基鹽代謝③糖代謝④嘌呤及嘧啶代謝⑤芳香族生物合成⑥一碳單位的甲基庫大多數抗生素前體物質是經多條途徑合成。三、抗生素的生物合成及調控1、青霉素的生物合成

通過氨基己二酸途徑（AAA）

α-酮戊二酸+乙酰CoA

↓高枸櫞酸↓高順烏頭酸↓高異枸櫞酸↓

α-氨基己二酸（α-AAA）

α-AA-δ-半縮醛↙↘L-α-AA-L-cys

↙酵母氨酸↘L-AA-L-cys-D-val

↙↘L-α-AA-6-APA賴氨酸↙↘←苯乙酸6-APA青霉素G2、青霉素生物合成的調控

青霉素生物合成的過程與一般次級代謝產物的生物合成一樣，同樣受酶及外界的調控。（1）賴氨酸對青霉素生物合成的反饋抑制作用由于初級代謝產物賴氨酸與青霉素具有共同的前體α-AAA，因此賴氨酸對代謝途徑的反饋抑制作用，使得共同中間體的合成也受到抑制，因而青霉素的合成受抑制。

（2）糖分解代謝物的阻抑作用

在青霉素的生物合成中，加入過量的葡萄糖能抑制青霉素的合成，而加入乳糖就無此影響。因為葡萄糖的分解產物阻抑青霉素合成中的關鍵酶（酰基轉移酶）的產生，導致青霉素不能合成。而乳糖氧化緩慢，它被水解為可利用的單糖的速度恰好符合青霉生長后期合成青霉素的需要。

第五節(jié)抗生素的主要作用機制一、抑制細胞壁的合成

多種抗革蘭陽性菌的抗生素，主要與抑制肽聚糖的合成有關，而肽聚糖合成的阻斷，就使得細胞壁無法完全形成。肽聚糖的合成以大腸埃希菌，其肽聚糖的生物合成分為三個階段：1、基本單元的形成肽聚糖是由N-乙酰胞壁酸（MurNAc）、N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）及短肽側鏈組成。它的前體物質是UDP-MurNAc-五肽和UDP-GlcNAc。UDP-GLcNAc由糖酵解的中間產物6-磷酸果糖生成，UDP-GlcNAc與磷酸烯醇式丙酮酸縮合，雙鍵還原形成UDP-MurNAc，L-Ala、D-Glu和間-DAP相繼加到UDP-MurNAc上，生成中間物胞壁酰三肽。所有的反應均在細胞質內。2、單體的形成及跨膜轉運

3、肽聚糖鏈的組裝及三維結構的構建合成的最后幾步是由幾種酶催化完成；①轉糖基酶②轉肽酶③D-羧肽酶④內肽酶反應發(fā)生在細胞質膜外表面.金黃色葡萄球菌

①五肽中第三位氨基酸是Lys，而不是DAP；第二位氨基酸是Gln，而不是Glu。②二糖五肽合成后，五個Gly分子通過肽鍵連接在Lys的ε-NH2上③轉肽反應在五肽次末端D-Ala的羧基和末端Gly的氨基之間。抑制細胞壁肽聚糖合成的抗生素有：1）環(huán)絲氨酸2）萬古霉素和桿菌肽3）β-內酰胺類抗生素，如青霉素和頭孢菌素二、影響細胞膜的功能

作用于細菌細胞膜抗生素對細菌有較強的殺傷作用，如：多黏菌素，屬多肽類抗生素，分子內含堿性親水性（多肽）基團與親脂性脂肪酸鏈。親水性基團可以與細菌細胞膜磷脂上的磷酸基形成復合物，而親脂鏈可以插入細胞膜上的脂肪鏈之間，因而解聚細胞膜的結構，使細菌細胞膜的通透性增加，導致細菌細胞內的主要成分如氨基酸、核酸和鉀離子等滲漏，細菌因而死亡。

短桿菌肽：為多肽類抗生素，對革蘭陽性菌有較強的殺菌作用，其分子的氨基酸側鏈也有親水性和輸水性兩種基團，也可與細胞膜的脂蛋白或脂質結合，影響細菌細胞膜的通透性和其他功能。兩性霉素B是一種抗真菌的抗生素，對新型隱球菌和白假絲酵母菌等具有良好的抗菌作用，其作用機制主要是能和敏感菌細胞膜上的甾醇部分結合而改變了膜的通透性，使細胞內鉀離子和其他成分滲出膜外，從而抑制了真菌的生長。三、干擾蛋白質合成

抑制蛋白質合成過程的抗生素較多，主要有氨基糖苷類、四環(huán)素類、大環(huán)內酯類以及其他一些抗生素。它們作用于蛋白質的起始、延長、終止各階段的不同環(huán)節(jié)。如：鏈霉素對蛋白質的起始、延長、終止各階段均有影響，但其作用是能不可逆地與細菌核糖體30S亞基結合，抑制蛋白質合成的起始及密碼子識別階段。

四環(huán)素類與核糖核蛋白體30S亞基16SrRNA上靠近與氨基酰-tRNA連接的區(qū)域形成可逆復合物，使氨基酰-tRNA不能與結合部位結合，阻斷蛋白質合成的肽鏈延長。這類抗生素對細菌有選擇性毒性，因為原核細胞中的主動轉運體系能使藥物特異性透過細胞，真核生物細胞卻能主動外排此類抗生素。

大環(huán)內脂類抗生素如紅霉素與核糖核蛋白體50S亞基結合，選擇性地抑制原核細胞蛋白質的合成林可霉素與核糖核蛋白體50S亞基結合，抑制蛋白質合成的肽鏈的延長。四、抑制核酸的合成如：博來霉素是引起DNA單鏈斷裂，也可使DNA一條鏈上的脫氧核糖和磷酸連接部分斷裂，形成缺口，還可抑制DNA連接酶和DNA聚合酶，干擾DNA的復制。

利福霉素和利福平可直接作用于RNA聚合酶而抑制RNA的合成，主要是特異性抑制RNA合成的初始步驟，對原核生物細胞RNA合成有選擇性抑制作用，低濃度可抑制細胞RNA聚合霉，而高濃度對DNA聚合酶幾乎無作用，利福霉素類抗生素還能抑制RNA指導的DNA聚合酶（逆轉錄酶）和RNA復制酶。蒽環(huán)類抗生素：如阿霉素可致DNA斷裂、染色體交換率增高、染色體畸變、抑制DNA復制五、干擾細胞的能量代謝和電子傳遞體系由于大多數毒性較強，限制在臨床上的廣乏應用。

如：抗霉素A是呼吸鏈電子傳遞體系的抑制劑，可以使細胞色素b變成還原狀態(tài)，細胞色素c1變成氧化狀態(tài)，抑制細胞色素b和細胞色素c1間的電子傳遞。另外，抗霉素還能抑制細胞能量代謝中的氧化磷酸化過程，其機制可能是阻抑電子傳遞體系放出的自由能形成高能中間體向ATP生成的過程。

第六節(jié)

抗藥性

常見的臨床致病菌金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、變形桿菌、大腸埃希菌、志霍菌屬等抗藥情況突出。所引起的各種感染已成為臨床治療上的一大難題。一、抗藥性的基本概念

抗藥性（drugresistance）：

指在微生物或腫瘤細胞多次與藥物接觸發(fā)生敏感性降低的現(xiàn)象，是微生物對藥物所具有的相對抗性?？顾幮缘某潭纫话阋栽撍帉δ撤N微生物的最小抑菌濃度來衡量。

有些微生物由于具有一些獨特的結構或代謝，天生對藥物不敏感，根據抗藥性的概念，就不能稱之為抗藥性，這種現(xiàn)象可稱為天然不敏感性（過去稱為固有抗藥性）。如：銅綠假單胞菌對多種藥物不敏感。

微生物個體對原來敏感的抗生素通過遺傳性的改變而獲得了抗藥性，可稱之為獲得抗藥性，常常是臨床上不合理用藥或長期用藥之后表現(xiàn)出的抗藥性。多重抗藥性（multipledrugresistance）：

指某一些微生物可同時對兩種以上作用機制不同的藥物所產生的抗藥性，也稱為多劑抗藥性，這是由于多重抗藥性菌株的遺傳物質上帶有多種抗藥性基因。

交叉抗藥性（crossdrugresistance）：有些微生物對結構類似或作用機制類似的抗生素均有抗藥性的現(xiàn)象。賴藥性（drugdependence）：由于基因突變而致的抗藥性，不僅對該藥具有抗性，而且需要該藥物作為特殊營養(yǎng)因素，這種現(xiàn)象稱為賴藥性。耐受性（tolerance）：有一些微生物對藥物抑菌作用的敏感性未改變，而對藥物的殺菌作用具有相對抗性，即該菌在最低抑菌濃度時仍受到抑制，但最小殺菌濃度提高，抗生素此時表現(xiàn)的是抑菌，而不是殺菌作用，這種現(xiàn)象稱為耐受性。二、抗藥性產生的遺傳學機制微生物對藥物的抗藥性可由染色體或質粒，或兩者兼有介導。大多數抗藥性由質粒編碼，少數由染色體編碼。產生抗藥性的原因可能是染色體或質粒上帶有與抗藥性有關的基因。如：耐甲氧西林金黃色葡萄球菌，帶有一種與抗藥性相關的mecA基因。有些具有多重抗藥性的菌株，可能含有兩個以上的抗藥質粒，或其抗藥質粒上可能含有多個抗藥基因。

1、自發(fā)突變加藥物選擇一般認為，抗藥菌所含的抗藥基因是由敏感菌的遺傳物質自發(fā)突變產生的，但突變率極低，在10-10-10-6。極少量的抗藥菌存在于大量的敏感菌不足為害，但經臨床頻繁使用抗生素后，藥物殺死或抑制敏感菌的生長，而抗藥性細菌繼續(xù)生長繁殖，無形中對抗藥菌起了選擇作用，造成抗藥菌株的大量增殖，形成抗藥菌系。

許多實驗證明，抗藥性的產生不是由于微生物與藥物接觸而產生的，而是自發(fā)突變加上藥物選擇的結果。2、細胞間抗藥性的基因轉移

染色體上的抗藥性可以通過三種機制由一個細菌傳遞到另一個細菌：1）接合帶有抗藥性基因的質?？勺孕袕椭疲鄠?，并在不同種屬間（特別是腸道）進行轉移，而導致抗藥性的廣泛散播。如：1958年日本爆發(fā)痢疾大流行發(fā)現(xiàn)：攜帶黃胺、四環(huán)素、鏈霉素、氯霉素等抗藥基因的大腸埃希菌在腸道內通過接合將多種抗藥性基因轉移給痢疾桿菌，從而抗藥性的散播。2）轉導通過噬菌體將細菌染色體片段由供體菌株向受體菌株轉移。當轉導片段中含有抗藥性的遺傳因子時，轉導將導致抗藥性的傳播。但頻率不高。3）轉化不重要4）一些微生態(tài)制劑的活菌細胞中可能攜帶有一定的抗藥性基因，由于廣泛大量地被服用，也可能造成抗藥性的傳播。5）轉座子在細胞間抗藥性的基因轉移中，起重要作用。三、抗藥性產生的生物化學機制

是指抗藥菌遺傳學上的改變在生物化學上的表現(xiàn)。

主要有三方面：1、產生使抗生素結構改變的酶（即鈍化酶）一些抗藥菌產生能使抗菌藥物活性降低或完全失活的酶類（包括組成酶和誘導酶）最典型代表：β-內酰胺類抗生素，由于抗藥菌產生β-內酰胺酶（包括青霉素酶、頭孢菌素酶等），而使抗生素水解滅活。

細菌

β-內酰胺酶產生一般兩種情況：

1、與具有誘導酶作用的藥物接觸，酶被誘導產生，大多數是胞外酶，此類酶一般由質粒編碼,在革蘭陽性菌株的抗藥菌中約占90%.

2、細菌發(fā)生自發(fā)突變，β-內酰胺酶可以穩(wěn)定地產生，與誘導藥物無關，是一種組成酶，常常結合在細胞膜上，屬于固有的胞內酶。氨基糖苷類抗生素的抗藥菌產生乙酰基轉移酶、磷酸轉移酶、腺苷酸轉移酶，以及氯霉素類抗藥菌產生的CM-乙?；D移酶，均屬抗藥酶（鈍化酶）類。2、抗生素作用靶位的修飾

許多抗生素通過使作用靶位失活而發(fā)揮作用。由于基因突變，一些細菌形成抗生素不能與之結合的作用靶位，或者即使與之結合形成復合物，但靶位仍能保持其功能，微生物就出現(xiàn)抗藥性。如：對鏈霉素抗藥的突變株，就是由于抗藥菌染色體上的str基因發(fā)生突變，使得核糖體30s亞基上的S12蛋白的構型發(fā)生改變，而核糖體上的S12蛋白與鏈霉素和核糖體RNA復合體的形成有關，因而使鏈霉素不能與核糖體結合，因而不能抑制蛋白質合成而產生抗藥性。

青霉素的原始作用靶位是青霉素結合蛋白，它們是與肽聚糖交聯(lián)有關的酶類，抗藥菌的結合蛋白數目減少、類型改變、與抗生素親和力下降，即酶的性質發(fā)生改變，則造成此類抗生素的失活。黃胺類抗藥菌株

由于基因突變，改變了二氫葉酸合成酶的性質，合成了另一種對黃胺不敏感的酶類，在黃胺存在情況下，仍能合成大量二氫葉酸，使代謝正常進行，由此而產生抗藥性。3、細胞膜通透性改變由于細胞膜通透性發(fā)生改變致使藥物進入細胞內減少，就使得微生物細胞表現(xiàn)出抗藥性。如：抗四環(huán)素的細菌可能是因為一些與抗生素透入細胞相關的膜孔蛋白結構上的改變，降低細胞膜的餓通透性而使藥物的透入濃度降低，另外其細胞膜上可能還存在有一種使藥物外排的機制，在降低藥物攝入的同時，促使藥物的外排，使之達不到抑制濃度，因而產生抗藥性。

銅綠假單胞菌對β-內酰胺類抗生素具有天然不敏感性，其原因之一就是其細胞膜上缺乏幫助轉運這類藥物的膜孔蛋白或可利用的膜孔蛋白數量極少，使得抗生素進入較少。

微生物對抗生素的抗藥性產生存在著不同的生物化學機制，有的與抗生素的作用有關，有的則與抗生素的作用機制無關。對同一種抗生素，可能存在不同機制抗藥的菌株。當兩種抗生素作用于相同位點時，常出現(xiàn)交叉抗藥性。四、抗藥性的控制1、合理使用抗生素不必使用抗生素時盡可能不用，防止交叉抗藥性。同時注意聯(lián)合用藥，因每一種藥物在代謝過程中發(fā)生作用的部位不同，聯(lián)合服用兩種藥物可起到協(xié)同作用。2、尋找新藥尋找具有新的化學結構的新抗生素以及新的酶抑制劑，改造現(xiàn)有的抗生素（包括對現(xiàn)有的產生菌和抗生素的改造）。目前半合成抗生素的使用己成為克服抗藥性的主要途徑。3、加強抗藥機制的研究研究抗藥機制，有助于了解細菌抗藥性的本質，有效地控制細菌感染。第七節(jié)抗生素的效價、單位及測定法

一、抗生素的效價和單位抗生素是一種生物活性物質，可以利用抗生素對生物所起作用的強弱來判定抗生素的含量。含量通常用效價或單位表示。有時二者合稱效價單位。效價（potency）:指在同一條件下比較抗生素的檢品和標準品的抗菌活性，從而得出檢品的效價。即效價是檢品的實際單位數與其標準量的比值。常用百分數表示。

效價=檢品的抗菌活性x100%

標準品的抗菌活性

單位（unit，u）是衡量抗生素有效成分的具體尺度。有以下幾種：1、重量單位以抗生素的生物活性部分的重量作為單位。1mg=1000單位（u），對于不同鹽類的同一抗生素，只要它們